Name: Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung der Biofilmbildung von Candida albicans in Echtzeit mit einem automatisierten mikrofluidischen Gerät. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung antimikrobieller Wirkstoffe und genetischer Mutanten.

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Wir danken allen Mitgliedern des Nobile Lab für hilfreiche Diskussionen an Biofilm-Assays. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Stipendium R21 AI125801 (C.J.N.) unterstützt. D.L.R. wurde durch ein Promotionsstipendium von der University of California Institute für Mexiko und den Vereinigten Staaten (UC-MEXUS) und Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) unterstützt.

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Clarissa J. Nobile ist einer der Gründer von BioSynesis, Inc., ein Unternehmen für die Entwicklung von Inhibitoren und Diagnostik von C. Albicans Biofilmen.

Anpassbare mikrofluidischen Biofilm Assays hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der Biofilmbildung in Echtzeit auf eine Einzelzelle Niveau, wenn eine Pauschale Laminar-Flow und konstante Temperatur ausgesetzt. Freuen Sie sich auf ein mächtiges Mittel, um die Entwicklung von Biofilmen in Wildtyp und Mutanten Stämme zu studieren, und die Auswirkungen der antimikrobielle Wirkstoff Behandlungen auf Biofilme unter Bedingungen, die physiologische Bedingungen nachahmen im klinischen Umfeld beobachtet. Im Gegensatz z...

Candida Albicans gehört Kommensalen der menschlichen Mikrobiota, aber es ist auch eine opportunistische Erreger, verursachen oberflächliche und schweren Pilzinfektionen1,2. Eine größere Virulenz-Eigenschaft von C. Albicans ist seine Fähigkeit, Form elastisch und resistente Biofilme Gemeinschaften von Zellen eine Oberfläche eingehalten und eingeschlossen in eine extrazelluläre Matrix-Werkstoff-1,-3. C. Albicans Biofilme sind hochgradig strukturiert, mit mehreren Schichten von mehreren Zelltypen (angehende Hefe-Form Runde Zellen, ovale pseudohyphal Zellen und röhrenförmigen Bodenaggregaten Zellen)4. C. Albicans Biofilm Entwicklung beginnt mit der Einhaltung runden Hefe-Form Zellen eine Oberfläche (Aussaat des Biofilms), gefolgt von der Verbreitung dieser Zellen an der Oberfläche, und dann die Reifung des unreifen Biofilms Struktur in eine voll ausgebildet Biofilm, die extrazelluläre Matrix Material4umgeben ist. Der Reife Biofilm besteht überwiegend aus länglichen Bodenaggregaten Zellen, die Dichte und miteinander verbundenen Netzwerken, die architektonischen Stabilität, der Biofilm-4bilden. Über den gesamten Lebenszyklus der Biofilm Runde Knospen Hefe Zellen zerstreuen von der Reife Biofilm und können Reisen in andere Regionen des Körpers zu disseminierte Infektionen verursachen oder Samen neue Biofilme an anderen Standorten4,5. C. Albicans können auf biotische Oberflächen, z. B. Schleimhaut-Oberflächen und in der gesamten Wirtsgewebe, und abiotischen Oberflächen, wie z.B. Kathetern, Herzschrittmacher, Zahnersatz und Gelenkprothesen Biofilme bilden. Aufgrund der widerspenstigen Eigenschaften von Biofilmen sie sind extrem schwer zu beseitigen, und in vielen Fällen ist die einzige wirksame Behandlungsstrategie Entfernung des infizierten Gerät4. Es ist so entscheidend für Biofilmbildung unter Bedingungen ähnlich denen beobachtet im klinischen Umfeld zu untersuchen.
Es gibt mehrere kritische in Vivo Tiermodellen zur Untersuchung von C. Albicans Biofilm Bildung6,7,8; aber können diese Studien kostspielig, zeitaufwändig, und sind begrenzt durch die Anzahl der Stämme und antimikrobielle Wirkstoffe, die zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können. In-vitro- Biofilm-Assays, auf der anderen Seite ermöglichen die schnelle, Hochdurchsatz-Bewertung von Antimykotika Verbindungen und mutierte Stämme und sind kostengünstiger und ethische als Biofilm Assays durchgeführt Out in Tier9, Modelle 10,11,12,13,14. Hier beschreiben wir eine in-vitro- Tests, die wir entwickelt und optimiert, um die Biofilmbildung zeitlich unter Laminar-Flow mit einem anpassbaren mikrofluidischen Gerät14,15beobachten. Der Test ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Phasen der Biofilmbildung, einschließlich der Einhaltung der erste Schritt, Zellproliferation, Biofilm Reifung und Zelle Dispersion. Der Test eignet sich auch Zelle Morphologie Änderungen während der Entwicklung eines Biofilms zu visualisieren.
Mikrotiter-Platten, die in der Regel verwendet werden, für in-vitro- Biofilm-Assays, bei hohem Durchsatz nicht kontrollierten Strömungsverhältnisse zulassen. Traditionelle Laminar-Flow-Zelle-Systeme ermöglichen die kontinuierliche Bewertung der Biofilmbildung in kontrollierten Strömungsverhältnisse, aber diese sind oft zeitaufwändige Einrichten und sind in der Regel nur über begrenzte Dynamikumfang Kontrolle und Durchsatz. Die mikrofluidischen Gerät hier verwendete überwindet diese Einschränkungen durch die Kombination von Hochdurchsatz-Platten (mit 48 Brunnen) mit einer integrierten Laminar-Flow-Kammer und hoch reproduzierbare und vielseitig anpassbar.
Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Verwendung eines handelsüblichen automatisierte mikrofluidischen Geräts Biofilmbildung ein Wildtyp C. Albicans bewerten belasten, die Auswirkungen der bekannten Antimykotikum auf die Entwicklung eines Biofilms und Biofilm Bildung in zwei mutierte Stämme (bcr1Δ/Δ und efg1 Δ/Δ), die zuvor gemeldet wurden, um Biofilm haben Mängel in Vitro und in Vivo16,17,18. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Wirksamkeit antimikrobieller Mittel in der Hemmung der Biofilmbildung während der Entwicklung eines Biofilms zu testen und zu identifizieren, die für normale Biofilm Entwicklung durch screening mutierte Bibliotheken erforderlich.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Automatisiertes mikrofluidisches Gerät für die Lebendzellanalyse</td></tr><tr><td>48-Well-Platte 0-20 dyn</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>Mikrofluidische</td></tr><tr><td>Plattenmontagesoftware</td><td>Fluxion</td><td>Version 7.8.4.0</td><td>Visualisierungsanalysesoftware</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Hefeextrakt</td><td>Kriterium</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glukose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Nährbrühe</td><td>Kriterium</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Mannitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Kriterium</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Impfösen</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen mit klarem Deckel</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Einwegküvetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Linsenpapier</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten- und Küvetten-Spektralphotometer</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>Schüttinkubator</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung der biofilmbildung in candida albicans ein automatisiertes mikrofluidischen gerät

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida Albicans ist der häufigste pilzliche Erreger des Menschen, was etwa 15 % der Fälle von nosokomialen Sepsis. Eine größere Virulenz-Attribut von C. Albicans ist seine Fähigkeit, Form Biofilme, strukturierten Gemeinschaften von Zellen zu biotischen und abiotischen Oberflächen befestigt. C. Albicans Biofilme bilden können auf Host Gewebe, wie z. B. Schleimhaut Schichten und medizinischen Geräten wie Herzschrittmachern, Katheter, Zahnersatz und Gelenkprothesen. Biofilme stellen signifikante klinische Herausforderungen, weil sie sehr widerstandsfähig gegen physikalische und chemische Störungen sind und können als Stauseen Samen Infektionen verbreitet wirken. Verschiedene in-vitro- Assays wurden genutzt, um C. Albicans Biofilmbildung wie Mikrotiter-Platte-Assays, Trockengewicht Messungen, Zelle Lebensfähigkeit Assays und konfokale Lasermikroskopie Scan zu studieren. Alle diese Tests sind einzelne Endpunkt Assays, wo Biofilmbildung zu einem bestimmten Zeitpunkt bewertet. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Biofilmbildung in Echtzeit mit einem automatisierten mikrofluidischen Gerät unter Laminar-Flow-Bedingungen zu studieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Biofilmbildung wie der Biofilm entwickelt sich im Laufe der Zeit mit anpassbaren Bedingungen, die denen der Host, wie denen in Gefäßkathetern nachahmen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, die Biofilm-Defekte genetische Mutanten und die hemmenden Auswirkungen von antimikrobiellen Wirkstoffen auf Biofilm Entwicklung in Echtzeit einzuschätzen.

Wir führten mikrofluidischen Biofilm Assays beschrieben hier mit einem Wildtyp C. Albicans Belastung Bedingungen zwei Medien (RPMI-1640 und Spider Media), der Wildtyp Stamm in der Gegenwart bekannte antimykotische Wirkstoff Amphotericin B (16 µg/mL) in RPMI, und zwei mutierte Stämme zuvor berichtet, dass Mängel in Biofilmbildung (bcr1Δ/Δ und efg1 Δ/Δ) in Spider Media.
Video 1 zeigt die Entwicklung der ...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Biofilmbildung von Candida albicans in Echtzeit unter wirtsphysiologischen Bedingungen zu visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Biofilmbildung während ihrer Entwicklung in Echtzeit und kann zur Überprüfung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Wirkstoffen oder zur Beurteilung genetischer Mutanten verwendet werden. Diese Technik kann verwendet werden, um potenzielle Therapeutika in einem Hochdurchsatz auf ihre Aktivität gegen Biofilme zu untersuchen, und ihre Wirksamkeit kann gemessen, visualisiert und mit aktuellen Behandlungen verglichen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die Biofilmbildung unter verschiedenen Bedingungen zu testen, die für die Forscher von Interesse sind. Obwohl diese Methode speziell für die Untersuchung der Biofilmbildung von Candida albicans entwickelt wurde, kann sie auch auf andere biofilmbildende Mikroorganismen angewendet werden, einschließlich anderer Pilzarten sowie Bakterien. Bereiten Sie zunächst Einzelkoloniekulturen verschiedener C.albicans-Stämme aus Zellen vor, die auf Hefeextrakt, Pepton, Dextrose oder YPD-Medium-Agar pla

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Immunologie und Infektion

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Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Quelle: Kurz, D. L., et al. Mikrofluidische Plattform zur Untersuchung von Bioverstopfungen in porösen Medien. J. Vis. Exp. (2022)Das Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Untersuchung der Biofilmbildung. Eine bakterielle Suspension wird in den Mikrokanal eingeführt, gefolgt von einer Inkubation, um die Entwicklung von Biofilmen zu ermöglichen. Anschließend wird der Fluss wieder aufgenommen, und Drucküberwachung zusammen mit Bildgebung wird eingesetzt, um...

Ein mikrofluidisches Gerät für Echtzeitbildgebung und Druckverfolgung während der Biofilmbildung

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines in vivo Mausmodells zur Untersuchung der Biofilmbildung von Candida albicans im Unterhautgewebe. Bei dem Experiment werden Candida-infizierte Geräte in die Rückenregion des Tieres implantiert, um einen Biofilm zu bilden.

Candida albicans Biofilmbildung in einem in vivo Mausmodell

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Züchtung und qualitativen Analyse von bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen mittels Mikroskopie. Bakterielle Biofilme bilden sich häufig auf Pilzoberflächen und sind an zahlreichen bakteriell-pilzlichen Interaktionsprozessen beteiligt, wie z. B. metabolischer Kooperation, Konkurrenz oder Prädation.

Ein Verfahren zur Probenvorbereitung zur Visualisierung von Biofilm-bildenden Bakterien auf Pilzhyphen

Protokolle zur Untersuchung der Biofilmbildung in einem mikrofluidischen Gerät, das poröse Medien nachahmt, werden diskutiert. Das mikrofluidische Gerät besteht aus einem Array von Mikrosäulen und die Biofilmbildung durch Pseudomonas fluorescens wird in diesem Gerät untersucht.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Entwicklung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Die Quantifizierung der Pilzbiofilme erfolgte durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten und durch eine nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung, bei der die Menge des erzeugten Lichts der Anzahl der lebensfähigen Zellen entspricht.

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

Um die internen Merkmale von Candida albicans Biofilmen zu sehen und zu quantifizieren, bereiten wir feste intakte Proben vor, die durch Brechungsindex-Matching geklärt werden. Dann kann die optische Schnittmikroskopie verwendet werden, um dreidimensionale Bilddaten durch die volle Dicke des Biofilms zu erhalten.

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

Lernen Sie die Visualisierung der Biofilmbildung von Candida albicans in Echtzeit mit einem automatisierten mikrofluidischen Gerät. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung antimikrobieller Wirkstoffe und genetischer Mutanten.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

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