Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Biofilmbildung von Candida albicans in Echtzeit unter wirtsphysiologischen Bedingungen zu visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Biofilmbildung während ihrer Entwicklung in Echtzeit und kann zur Überprüfung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Wirkstoffen oder zur Beurteilung genetischer Mutanten verwendet werden. Diese Technik kann verwendet werden, um potenzielle Therapeutika in einem Hochdurchsatz auf ihre Aktivität gegen Biofilme zu untersuchen, und ihre Wirksamkeit kann gemessen, visualisiert und mit aktuellen Behandlungen verglichen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die Biofilmbildung unter verschiedenen Bedingungen zu testen, die für die Forscher von Interesse sind. Obwohl diese Methode speziell für die Untersuchung der Biofilmbildung von Candida albicans entwickelt wurde, kann sie auch auf andere biofilmbildende Mikroorganismen angewendet werden, einschließlich anderer Pilzarten sowie Bakterien. Bereiten Sie zunächst Einzelkoloniekulturen verschiedener C.albicans-Stämme aus Zellen vor, die auf Hefeextrakt, Pepton, Dextrose oder YPD-Medium-Agar plattiert sind, und zwar nach mikrobiologischen Standardverfahren.

Schalten Sie als Nächstes das mikrofluidische System ein, das den Controller, die beiden Netzteile, das Mikroskop, die Kamera und den Computer umfasst, die an das System angeschlossen sind. Sobald der Computer geladen ist, öffnen Sie die Software, die das System steuert. Suchen Sie die Barcode-Nummer des verwendeten Schildes und geben Sie die Nummer ein, wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden.

Stellen Sie dann im Steuermodul die Temperatur des mikrofluidischen Systems auf 37 Grad Celsius ein. Klicken Sie anschließend auf die Einlassschächte I1, I7, I13 und I19 und lassen Sie fünf Minuten lang sterile Luft durch die Rohre der Schnittstellenplatte strömen, um jegliches Kondenswasser zu entfernen. Wenn das gesamte Kondenswasser verdunstet ist, stellen Sie die 48-Well-Mikrofluidikplatte mit 0-20 dyn auf den Mikroskoptisch.

Für ein 12-stündiges Experiment zur Biofilmbildung geben Sie zunächst 600 Mikroliter vorgewärmtes Medium in die Einlassschächte. Senken Sie die gereinigte Schnittstellenplatte langsam auf die 48-Well-Mikrofluidikplatte ab. Schieben Sie dann die Schnittstellenplatte leicht nach links, bis die Rohre auf den Ein- und Auslassschächten positioniert und eingerastet sind.

Stellen Sie im Abschnitt "Schersteuerung" der Software den Strömungsmodus auf konstant und die maximale Scherung auf einen Dyn pro Quadratzentimeter ein. Klicken Sie dann auf die Einlassschächte mit dem Medium, um den Medienfluss vom Einlass zu den Auslassschächten zu starten und den Kanal zu grundieren. Klicken Sie nach fünf Minuten Durchfluss auf die Stopp-Schaltfläche im Abschnitt zur Steuerung der Well-Platte der Software.

Entfernen Sie dann die Grenzplatte und beobachten Sie die Vertiefungen der mikrofluidischen Platte. In den Auslassschächten sollte nur ein kleiner Tropfen des Mediums sichtbar sein. Um Wildtyp- und mutierte C.albicans-Stämme zu testen, geben Sie 50 Mikroliter Wildtyp-SC5314-Zellkultur in Spinnenmedien in zwei Auslassvertiefungen, fügen Sie die bcr1-Mutante in Spinnenmedien in zwei Auslassvertiefungen hinzu und fügen Sie die EFG1-Mutante in Spinnenmedien in zwei Auslassvertiefungen hinzu.

Setzen Sie die Schnittstellenplatte wieder auf die mikrofluidische Platte und verriegeln Sie den Deckel. Stellen Sie im Abschnitt "Schersteuerung" der Software den Strömungsmodus auf konstant und die maximale Scherung auf zwei Dyn pro Quadratzentimeter ein. Klicken Sie auf die Auslassvertiefungen mit den Zellen, um den Medienfluss vom Auslass zu den Einlassvertiefungen zu beginnen und mit der Aussaat von C.albicans zu beginnen.

Klicken Sie nach drei Sekunden auf die Schaltfläche Stopp im Abschnitt zur Steuerung der Well-Platte, um zu verhindern, dass Zellen in die Einlass-Wells gelangen. Lassen Sie die Zellen 10-20 Minuten lang ohne Fluss im Betrachtungskanal verbleiben, um eine anfängliche Zelladhärenz zu gewährleisten. Öffnen Sie im Fenster des Imaging-Moduls das multidimensionale Erfassungsmodul und klicken Sie im Menü auf der linken Seite auf die Registerkarte Bühne.

Laden Sie im Stufenbereich die Master-Stufenliste für die 48-Well-Mikrofluidikplatte mit 0-20 Dyn. Öffnen Sie als Nächstes die Einstellung zum Nachladen des Samples und verschieben Sie den Tisch auf die absoluten Positionsmodule. Drücken Sie im Modul zur Einstellung des Nachladens von Proben die Live-Taste, um eine Bildvorschau mit Fadenkreuz anzuzeigen.

Positionieren Sie die Well-Platte mit dem Joystick so, dass die Spitze des Pfeils neben dem Betrachtungskanal vier mit dem Fadenkreuz in der Software ausgerichtet ist. Gehen Sie dann zum Menü "Stufe verschieben, um die absolute Position zu erreichen" und drücken Sie die Taste "Ursprung einstellen". Gehen Sie als Nächstes zurück zum Modul zur Einstellung der Probennachladung, klicken Sie im linken Menü auf den Abschnitt "Anfänglicher Referenzpunkt" und laden Sie die Datei für die 48-Well-0-20-Dyn-Mikrofluidikplatte.

Doppelklicken Sie auf dem Tischausschnitt des multidimensionalen Aufnahmemoduls auf die Tischposition 22.2, um den Mikroskoptisch und den Kamerafokus in die Nähe der Pfeilmarkierung durch den Sichtkanal 22 zu bringen. Positionieren Sie dann mit dem Joystick die Vertiefungsplatte so, dass die Spitze des Pfeils neben dem Betrachtungskanal 22 mit dem Fadenkreuz ausgerichtet ist. Kopieren Sie die Y-Koordinate im multidimensionalen Erfassungsmodul in die Y-Position von.

2 auf der Registerkarte Referenzpunkte aktualisieren des Moduls zur Einstellung des Probennachladens. Klicken Sie abschließend auf der Registerkarte "Positionen aktualisieren" des Moduls zur Anpassung der Probennachladung auf "Auf MDA-Phasenliste anwenden". Verwenden Sie im Fenster des Imaging-Moduls das multidimensionale Erfassungsmodul und klicken Sie im linken Menü auf die Registerkarte Speichern.

Wählen Sie dann den Dateinamen für das Experiment und den Ordner aus, in dem die erfassten Bilder auf dem Computer gespeichert werden sollen. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte Zeitraffer und stellen Sie sie so ein, dass zwischen jedem Bild insgesamt 145 Bilder von fünf Minuten aufgenommen werden. Stellen Sie dann auf der Registerkarte Wellenlängen die Anzahl der Wellenlängen auf eins ein und nehmen Sie bei 50 % Hellfeld und 50 % Kamera mit einer Belichtungszeit von 12-20 Millisekunden auf.

Stellen Sie die Verstärkung auf 0,6 und den Digitizer auf 20 Millihertz ein. Nachdem Sie den Fokus wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben eingestellt haben, wählen Sie Erfassen, um mit der Aufnahme von Bildern vor dem Spülen von anhaftenden Zellen für alle Unterstufen zu beginnen. Legen Sie im Abschnitt Schersteuerung den Strömungsmodus auf konstant und die maximale Scherung auf einen Dyn pro Quadratzentimeter fest.

Klicken Sie dann auf die Einlassvertiefungen, um den Medienfluss von den Einlass- zu den Auslassvertiefungen zu starten und alle nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Klicken Sie nach fünf Minuten auf die Stopp-Schaltfläche im Abschnitt zur Steuerung der Well-Platte. Lassen Sie eine zweite Runde von Bildern aufgenommen werden, und stellen Sie dann im Abschnitt "Scherkontrolle" den maximalen Scherfluss auf 0,5 Dyn pro Quadratzentimeter ein und bestätigen Sie die Änderung.

Wählen Sie im Fenster des Imaging-Moduls die Registerkarte Analysetools aus und klicken Sie im Dropdown-Menü auf Multidimensionale Daten überprüfen. Klicken Sie dann auf Basisdatei auswählen. Dadurch wird das Fenster für multidimensionale Datensatz-Dienstprogramme geöffnet.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Verzeichnis auswählen und wählen Sie den Ordner aus, in dem das Experiment gespeichert wurde. Wählen Sie in der Liste der Datasets das Protokoll der Experimentdatei aus. Sobald das Protokoll geladen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Ansicht.

Wählen Sie die Wellenlänge aus, indem Sie auf die Optionen im linken Wellenlängenmenü klicken, und wählen Sie die anzuzeigende Tischposition aus einem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie das zu ladende Bild aus den Zahlen oben im Modul aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Bildnummer klicken. Wählen Sie dann alle Bilder aus, um ein Zeitraffervideo zu erstellen.

Die ausgewählten Bilder werden als Video in einem neuen Fenster geöffnet. Klicken Sie im Fenster des Imaging-Moduls auf die Registerkarte Datei und wählen Sie Speichern unter aus dem Dropdown-Menü. Speichern Sie das resultierende Video im Standarddateiformat.

Öffnen und laden Sie abschließend die gespeicherte Videodatei in Bild J.In Bild J, klicken Sie auf die Registerkarte Datei und dann auf Speichern unter. Wählen Sie AVI aus dem Dropdown-Menü und konvertieren Sie die Datei in eine AVI-Datei, indem Sie die JPEG-Konvertierung auf 10 Bilder pro Sekunde einstellen. Unter Wildtyp-Bedingungen in RPMI 1640-Medien hafteten mehrere Zellen stark an dem Kanal.

Sie bilden Hyphen und es ist ein dicker Biofilm mit inkalierenden Hyphen und Hefezellen zu beobachten. Gegen Ende des mikrofluidischen Experiments füllt der Wildtyp-Biofilm diesen Betrachtungskanal vollständig aus. Das Vorhandensein von Amphotericin B hat jedoch einen ausgeprägten Effekt auf die Verringerung der Biofilmbildung.

Insbesondere wird die Adhärenz der Zellen verringert und es ist zu sehen, wie mehrere Zellen mit der Scherströmung des Mediums wegfließen. Die Wildtyp-Kontrollzellen, die diesmal in Spinnenmedien gezüchtet wurden, bildeten einen Biofilm, der dem gerade gezeigten in RPMI ähnelt. In diesem Medium wurden auch zwei Biofilm-defekte Mutanten gezüchtet.

Beide Stämme zeigen im Vergleich zur Kontrolle eine stark reduzierte Biofilmbildung. In dieser Zellpopulation bilden die anhaftenden Zellen keine Hyphen und der resultierende Biofilm ist stark defekt. Dieser andere Stamm ist sowohl in der Biofilmbildung als auch in seiner Fähigkeit, am Kanal zu haften, defekt.

Einmal gemeistert, kann dieses Experiment in weniger als einer Stunde aufgebaut werden. Mit dieser Methode kann man viel über eine Reihe verschiedener Aspekte der Biofilmbildung lernen, einschließlich der anfänglichen Zelladhärenz, der Biofilmreifung und der Zellausbreitung. Dieses Protokoll ist hochgradig anpassbar und vielseitig.

Es kann angepasst werden, um verschiedene mikrobielle Spezies in verschiedenen Königreichen zu bewerten. Flussraten, Temperaturen, Inkubationszeiten und Medien können auch zur Untersuchung von Biofilmen mit gemischten Spezies verwendet werden. Wir empfehlen diesen mikrofluidischen Biofilm-Assay als In-vitro-Assay, der vor In-vivo-Tierversuchen verwendet werden sollte.

Unserer Erfahrung nach korrelieren die Ergebnisse dieses Assays sehr gut mit bestehenden in vivo Biofilm-Assays.