Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Das übergeordnete Ziel dieses Versuchsaufbaus ist es, die Hauptschichten der RNA- und DNA-Regulation zu beschreiben, um die wichtigsten molekularen Mechanismen aufzudecken, die als Reaktion auf einen Stimulus oder eine Behandlung auftreten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in vielen verschiedenen biologischen Bereichen zu beantworten, wie z.B. Immunantworten im Allgemeinen, aber auch molekulare Reaktionen auf medikamentöse Behandlungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie mehrere Schichten der Genregulation im Laufe der Zeit gleichzeitig anzeigen können.

Daher ist es wichtig, für jede Methode den gleichen Zellpool zu verwenden. Im Großen und Ganzen geht es bei diesen drei Protokollen darum, die interessierenden Zellen zunächst zu verschiedenen Zeitpunkten zu manipulieren. Nach jeder Manipulation werden die Zellen gepoolt und in drei Gruppen eingeteilt, eine für jeden Assay.

Dieser Abschnitt des Videos beschreibt die Markierung und Reinigung der zuletzt erstellten Transkripte mittels 4sU-Markierung. Jedes Protokoll produziert letztendlich Proben, die für die Sequenzierung bereit sind. Suchen Sie zunächst nach der erforderlichen 4sU-Konzentration und der Inkubationszeit, die für die gewünschte Zelllinie erforderlich sind.

Zum Beispiel werden 200 mikromolare 4sU eine Stunde lang auf T-Zellen angewendet. Trennen Sie den Zellpool nach der Behandlung in eine separate Schale für jede Methode und jeden Zeitpunkt. Tauen Sie dann die erforderliche Anzahl von 4sU-Aliquoten vollständig auf, fügen Sie die 4sU direkt zum Zellmedium hinzu und inkubieren Sie die Kulturen wie angegeben.

Sammeln Sie als Nächstes die 4sU-markierten Zellen in Polypropylenröhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen. Resuspendieren Sie das Pellet in TRIzol bei etwa drei Millionen Zellen pro Milliliter und inkubieren Sie die Zellen in TRIzol fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie nun 30 bis 80 Mikrogramm RNA oder mehr nach der Methode von Radle und Co. vor. Als nächstes mischen Sie die Thiol-spezifische Biotinylierungsreaktion in dieser Reihenfolge. Beginnen Sie mit nukleasefreiem Wasser, dann mit 10-fachem Puffer, dann RNA und zuletzt Biotin-HPDP.

Dann durch Pipettieren mischen und inkubieren. Fahren Sie mit dem Reinigungsschritt fort, um Proben von neu transkribierter biotinylierter RNA zu erzeugen, die mit unmarkierter, bereits vorhandener RNA gemischt ist. Erhitzen Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang auf 65 Grad Celsius.

Legen Sie sie dann sofort auf Eis. Sobald jede Probe abgekühlt ist, fügen Sie 100 Mikroliter Streptavidin-Kügelchen hinzu und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur mit Rotation für 15 Minuten. Isolieren Sie nun die mit neu transkribierter RNA dekorierten Kügelchen mit einer magnetischen Säule und eluieren Sie die RNA dann in 11 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser für die Folge.

In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie RNA isoliert wird, die aktiv translatiert wird. Bei der Sequenzierung dieser Transkripte wird das dynamische Translatosom untersucht. In Verbindung mit RNA-Sequenzierungsdaten ermöglicht dieser Assay die Berechnung des RNA-Umsatzes und der Translationsraten.

Beginnen Sie mit der Zugabe von Cycloheximid zur Suspension und mischen Sie es mit Inversionen. Nach einer Minute bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die Zellen, entfernen das Medium und waschen die Zellen mit mindestens 10 Millilitern PBS, ergänzt mit Cycloheximid. Als nächstes aspirieren Sie das Medium und ersetzen es durch 100 Mikroliter Säugetierzelllysepuffer pro 10 Millionen Zellen.

Zerreiben Sie die Mischung, um die Zellen mit einer 20- bis 25-Gauge-Nadel zu lysieren. Übertragen Sie dann das Zelllysat in ein vorgekühltes 1,50-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie das Lysat 10 Minuten lang auf Eis mit periodischen Inversionen. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie das Lysat und überführen den Überstand in ein kühles 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Bereiten Sie als Nächstes eine Verdünnung des Lysats von eins bis 10 in nukleasefreiem Wasser vor und messen Sie die Absorption bei 260 Nanometern. Erstellen Sie dann 200-Mikroliter-Aliquots des unverdünnten Lysats und behandeln Sie jedes mit 7,5 Einheiten Nuklease für jede Absorptionseinheit. Lassen Sie die Nuklease 45 Minuten lang reagieren und beenden Sie dann die Reaktion mit 15 Mikrolitern RNase-Inhibitor oder lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Aufreinigen Sie dann die RPF-RNA mit einem handelsüblichen Kit und führen Sie anschließend eine rRNA-Depletion durch, ebenfalls mit einem Kit. Führen Sie als Nächstes eine PAGE-Aufreinigung an 500 Nanogramm isolierter RPF-RNA durch. Nachdem Sie die Proben für das Laden in das Gel vorbereitet haben, denaturieren Sie sie, letztere und Kontrollen, mit einer fünfminütigen Inkubation bei 95 Grad Celsius.

Lassen Sie dann die Proben etwa 75 Minuten lang bei 180 Volt laufen und bewerten Sie die Ergebnisse. Für die Entnahme von Gelscheiben stechen Sie mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel Löcher in den Boden eines 0,5-Milliliter-Röhrchens. Als nächstes werden Schneidegelscheiben, die dem Nukleotidbereich von 28 bis 30 Basen entsprechen, und in die vorbereiteten 0,5-Milliliter-Röhrchen überführt.

Fügen Sie eine Probe der RNA-Kontrolle und eine Probe der Negativkontrolle hinzu, um sie auf Kontamination zu prüfen. Laden Sie anschließend die kleinen, verschlossenen Probenröhrchen in größere Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Baugruppen, um das Gel zu zerkleinern, und übertragen Sie die Probe in das 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie als Nächstes Wasser, Ammoniumacetat und SDS in die Probenröhrchen, um die RNA in einer Übernachtreaktion bei vier Grad Celsius zu eluieren. Verwenden Sie dann ein kommerzielles Kit, um eine cDNA-Bibliothek aus der kleinen RNA herzustellen, und fahren Sie mit der Sequenzierung der cDNA-Bibliothek fort. ChIP-seq wird verwendet, um die Bindung eines interessierenden Transkriptionsfaktors in einem Genom abzubilden.

In Kombination mit Daten aus dem Ribosomen-Profiling und der Befragung aller neuen Transkripte zeigt ChIP-seq den tatsächlichen Einfluss der Transkriptionsfaktorbindung. Vernetzen Sie zunächst die Zellproben mit Formaldehyd auf eine Endkonzentration von 1 %Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Glycinkonzentration auf 0,125 molar erhöhen. Sammeln Sie dann die Zellen und waschen Sie sie dreimal mit eiskaltem PBS und frieren Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius ein.

Später resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter eiskaltem Zelllysepuffer mit frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis. Nach 10 Minuten schleudern Sie die Zellen herunter, aspirieren Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zugabe und Inkubation des Lysepuffers. Als nächstes verwenden Sie Ultraschall, um geschertes Chromatin zwischen 200 und 1.000 Basenpaaren zu erzeugen.

Koppeln Sie dann das Chromatin an Antikörper-beschichtete magnetische Kügelchen und eluieren Sie die Protein-DNA-Komplexe in 50 Mikrolitern Elutionspuffer. Fügen Sie als Nächstes die fünf Mikroliter 40%RNase und Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang. Geben Sie dann eine Einheit Proteinase K und 20 Mikrogramm Glykogen in die Probe und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang.

Bewegen Sie die Probe anschließend über Nacht auf 65 Grad Celsius, um sie umzukehren. Legen Sie die Probe am nächsten Tag mindestens 30 Sekunden lang gegen den Magneten und sammeln Sie dann den Überstand, der die interessierende DNA enthält. Reinigen Sie dann die DNA, verwenden Sie die quantitative PCR zur Verifizierung und sequenzieren Sie die DNA.

Die 4sU-Markierung kann Zellen stressen und zur Apoptose führen. Die Annexin-V- und 7-AAD-Färbung wurde verwendet, um apoptotische und tote Zellen zu identifizieren. Nach der Markierung von Th1-Zellen mit 4sU durch 30- oder 60-minütige Behandlungen starben die Zellen nicht ab und durchliefen keine Apoptose.

Die Integrität der RNA wurde vor der Sequenzierung immer mit einem Standard-Assay überprüft, da dies bei der Verarbeitung von RNA von großer Bedeutung ist. Amplifizierte Bibliotheken wiesen einen gesunden Bereich an Nukleotiden auf. Überschüssige Adapterdimere mussten durch PAGE weiter aufgereinigt werden.

Zu viel Template oder zu viele Zyklen führen zu schweren Nukleotiden, verschmierten Produkten und Adapterdimerprodukten. Es wurde festgestellt, dass das Chromatinscheren am besten funktioniert, wenn die Hauptfraktion des gescherten Chromatins etwa 1.000 Basenpaare oder etwas weniger betrug. Die quantitative PCR wurde verwendet, um die Anwendbarkeit des Antikörpers für die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung zu testen. Die Negativkontroll-Primer sind für Gene, die nicht in den interessierenden Zellen exprimiert werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen detaillierten Plan des Versuchsaufbaus zu erstellen, einschließlich eines Zeitplans für die Zugabe von 4sU und den Zeitpunkt der Ernte der Zellen für jede Methode. Überprüfen Sie immer die optimalen 4sU-Markierungsbedingungen, indem Sie die Auswirkungen von 4sU auf die Zellviabilität und die Stressreaktion im Voraus testen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz es uns ermöglicht, alle Ereignisse der Genregulation sichtbar zu machen, die während eines Prozesses der zellulären Aktivierung auftreten können.

Diese Methode könnte auch für primäre Immunzellen und ihre Reaktion auf einen Reiz oder ein Medikament eingesetzt werden.