Synthese von funktionalisierten 10 nm Polymer beschichteten Goldpartikeln für Targeting Endothel und Drug-Delivery

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Synthese funktionalisierter, polymerbeschichteter Gold-Nanokügelchen mit einem Durchmesser von 10 Nanometern, biokompatibel, mit einer verlängerten Zirkulationszeit und mit Fluoreszenzmikroskopie abbildbar. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Kardiologie zur Endothelpermeabilität unter erkrankten Bedingungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass biokompatible ultrakleine Partikel hergestellt werden, die funktionelle Gruppen haben, die für eine weitere Anpassung zur Verfügung stehen.

Verdünnen Sie zunächst in einem Mikrozentrifugenröhrchen 12 Mikroliter 80 % THPC mit einem Milliliter Reinstwasser. Einen 100 Milliliter Rundkolben über eine magnetische Rührplatte klemmen. 45 Milliliter Wasser und einen kleinen eiförmigen Rührstab in den Kolben geben.

Beginnen Sie mit dem Rühren des Wassers bei 300 U/min. In den Kolben werden 0,5 Milliliter einer molaren Natronlauge und ein Milliliter der verdünnten THPC-Lösung gegeben. Rühren Sie das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang kräftig um.

Geben Sie dann unter Rühren zwei Milliliter einer 25 millimolaren Chloraurinsäurelösung in das Reaktionsgemisch. Vergewissern Sie sich, dass das gelbe Reaktionsgemisch innerhalb von Sekunden dunkelbraun wird, was auf die Bildung von THPC-gekappten, negativ geladenen Goldnanopartikeln hinweist. Rühren Sie die Mischung 15 Minuten lang weiter.

Während das Gemisch rührt, wird eine wässrige Lösung aus heterobifunktionellem Amin PEG-Thiol, Carboxymethyl-PEG-Thiol und monofunktionellem Methoxy-PEG-Thiol hergestellt. Sobald das Goldnanopartikel-Reaktionsgemisch 15 Minuten lang gerührt wurde, reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit auf 100 U/min. Die PEG-Lösungen unter Rühren tropfenweise zur Mischung geben.

Rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur vorsichtig weiter. Verschließen Sie dann ein Ende einer 12-14 Kilodalton schweren MWCO-Zellulosemembran mit einem Dialyseclip. Das Reaktionsgemisch mit einer Pipette auf die Membran übertragen.

Verschließen Sie das andere Ende der Membran mit einem zweiten Dialyseclip. Dialysieren Sie das Nanopartikelgemisch gegen vier Liter Wasser, das 72 Stunden lang bei 60 U/min gerührt wird. Wechseln Sie das Wasser in den ersten sechs Stunden alle zwei Stunden und danach alle sechs bis 12 Stunden.

Filtrieren Sie dann das halbgereinigte pegylierte Gold-Nanopartikelgemisch durch einen 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Frieren Sie die gereinigte Nanopartikellösung etwa fünf Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius ein. Lyophilisieren Sie die gereinigten Nanopartikel mit einem Gefriertrockner.

Um mit der Vorbereitung der fluoreszierenden pegylierten Goldnanopartikel zu beginnen, wird ein 100-Milliliter-Rundkolben über eine magnetische Rührplatte gespannt. Geben Sie 18 Milliliter Reinstwasser und einen kleinen eiförmigen Rührstab in den Kolben und beginnen Sie mit 100 Umdrehungen pro Minute zu rühren. Kombinieren Sie in einem konischen Röhrchen von vier Millilitern zwei Milligramm lyophilisierte pegylierte Goldnanopartikel mit zwei Millilitern Wasser.

Anschließend wird die Nanopartikellösung zur weiteren Rekonstitution in den Rundkolben überführt. Geben Sie unter Rühren einen Milliliter eines 0,1 molaren Karbonatpuffers mit einem pH-Wert von 8,8 zu den rekonstituierten Nanopartikeln. Fügen Sie dann fünf Mikroliter einer Lösung von 10 Milligramm pro Milliliter eines fluoreszierenden Anhydroxysuccinimidesters in Dimethylsulfoxid hinzu.

Wickeln Sie den Kolben in Folie ein, um Licht vollständig auszuschließen. Rühren Sie das fluoreszierende Nanopartikelgemisch über Nacht bei Raumtemperatur weiter. Dann dialysieren Sie das Gemisch 72 Stunden lang gegen vier Liter Wasser unter Verwendung des Verfahrens, das bei der Herstellung der pegylierten Goldnanopartikel beschrieben wurde.

Halten Sie den Behälter während der gesamten Dialyse mit Folie abgedeckt. Ein Milliliter der gereinigten fluoreszierenden pegylierten Nanopartikel wird zur Charakterisierung beiseite gelegt. Die restlichen fluoreszierenden Nanopartikel werden eingefroren, lyophilisiert und bei vier Grad Celsius gelagert.

Um den Goldnanopartikelkern mit Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen, legen Sie zunächst 10 Mikroliter der gereinigten fluoreszierenden Nanopartikellösung auf ein kohlenstoffbeschichtetes Mesh-TEM-Gitter. Lassen Sie den Tropfen fünf Minuten einwirken. Verwenden Sie dann Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit vorsichtig vom Rand des TEM-Gitters abzuleiten, bis nur noch ein Film der fluoreszierenden Nanopartikel auf dem Gitter verbleibt.

Stellen Sie die Nanopartikel bei 80 Kilovolt ab, mit einer Vergrößerung von 50.000 bis 150.000. Um die Größe der hydrodynamischen Nanopartikel zu messen, geben Sie ein Milligramm lyophilisierter THPC-beschichteter Goldnanopartikel in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie einen Milliliter Wasser in jedes Röhrchen und geben Sie die Lösungen in einen Milliliter durchsichtige Plastikküvetten.

Bewerten Sie jede Lösung mit dynamischer Lichtstreuung und messen Sie die kugelförmigen hydrodynamischen Durchmesser der Partikel. Übertragen Sie dann die Küvette mit den fluoreszierenden pegylierten Goldnanopartikeln in ein Spektrofluorometer. Stellen Sie die Exotationswellenlänge auf 633 Nanometer ein und lesen Sie die Emissionssignale von 650 bis 800 Nanometern aus.

Um die Biokompatibilität bei 7 Nanopartikelkonzentrationen zu bewerten, pipettieren Sie zunächst 100 Mikroliter einer Rattenfettpad-Endothelzellsuspension in DMEM in jede der 21 Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit steriler Gewebekultur. Inkubieren Sie die Zellen, bis die Konfluenz erreicht ist, und erhalten Sie dann sieben Lösungen fluoreszierender Nanopartikel in DMEM mit Konzentrationen von null bis 1000 Mikrogramm pro Milliliter. Saugen Sie das DMEM aus den Vertiefungen an.

Geben Sie 100 Mikroliter jeder der sieben Nanopartikellösungen in dreifacher Ausfertigung in jede der separaten Vertiefungen. Lassen Sie die Zellen und Nanopartikel 16 Stunden lang mitinkubieren. Aspirieren Sie dann das DMEM und suspendierte oder lose gebundene Nanopartikel aus den Vertiefungen.

100 Mikroliter frisches DMEM mit 20 Mikrolitern einer MTS/PES-Lösung in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Beurteilen Sie dann die Lebensfähigkeit der Zellen durch chlorometrische Analyse bei 492 Nanometern mit dem Plattenlesegerät.

Als nächstes paddeln die Samenratten-Fettzellen auf sterile 12-Milliliter-Glasabdeckungen bei 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Füttern Sie die Zellen mit DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellen, bis die vollständige Konfluenz erreicht ist.

Modifizieren Sie bei Bedarf die endotheliale Glykokalyx und inkubieren Sie die Zellen dann 16 Stunden lang mit 550 Mikrogramm pro Milliliter fluoreszierender Goldnanopartikel. Bereiten Sie die Zellen für die Immunfluoreszenzmikroskopie vor. Montieren Sie jedes Deckglas auf einen Objektträger mit lichtechtem Eindeckmedium, das DAPI enthält.

Versiegeln Sie die Einschubskanten mit Nagellack. Abbildung der immungefärbten Endothelzellen mit konfokaler Mikroskopie. Visualisieren Sie die Zellkerne, die Heparinsulfat-Glykokalyx und die Nanopartikel mit blauen, grünen bzw. dunkelroten Kanälen.

Die TEM von THPC-beschichteten Goldnanopartikeln wies Partikeldurchmesser von zwei bis drei Nanometern auf. Die TEM der pegylierten Nanopartikel konnte nur das Vorhandensein von dispergierten Partikeln bestätigen, da PEG auf den TEM-Bildern nicht sichtbar ist. Die DLS der THPC-beschichteten und pegylierten Nanopartikel zeigten eine Verschiebung des Peak-Partikeldurchmessers von 2,5 Nanometern auf 10,5 Nanometer.

Die Fluoreszenzemission hatte ein Maximum zwischen 660 und 672 Nanometern, wenn sie mit 633 Nanometer Licht angeregt wurde, was mit der erwarteten maximalen Emission bei 665 Nanometern für die verwendete Fluoreszenzsonde übereinstimmte. Rattenfettpolster-Endothelzellen zeigten nach 16-stündiger Co-Inkubation mit fluoreszierenden pegolierten Goldnanopartikeln in Konzentrationen von bis zu einem Milligramm pro Milliliter ein ähnliches Maß an Lebensfähigkeit, was auf keine signifikante Toxizität der Nanopartikel hindeutet. Es wurde eine minimale Aufnahme von Nanopartikeln in Rattenfettpolster-Endothelzellen mit gesunden Glykokalyxen beobachtet.

Eine signifikant höhere Aufnahme trat in Zellen mit abgebauten Glykokalyxen auf, wie die Zunahme der rot fluoreszierenden Signale von den Nanopartikeln zeigt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Modifikationen, wie z. B. die Konjugation an die offenen funktionellen Gruppen, durchgeführt werden, um die Partikel für ein spezifisches Targeting einer Endothelkomponente oder die Verabreichung eines Wirkstoffs zu modifizieren.