Name: In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie die fluoreszenzbasierte Überwachung circadianer Genexpression im suprachiasmatischen Kern von Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitmessungen bei Licht-Dunkel- und Dauer-Dunkel-Bedingungen.

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Wir danken Mitglieder im Zhang Labor für anregende Diskussionen und Mitglieder im Zhan Labor für technische Hilfestellung bietet. Diese Forschung wurde durch 31500860 (zu C.Z) Zuschüsse der NSFC, 2012CB837700 (zu E.E.Z. und C.Z) des Programms 973 aus der M.O.S.T. von China, und durch die Finanzierung von kommunalen Regierung in Peking unterstützt. E.E.Z. wurde von den Chinesen "Recruitment Programm von Global Youth Experts" unterstützt.

Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden mit Zustimmung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des National Institute of Biological Sciences, Peking, im Einklang mit der staatlichen Regelungen des China durchgeführt.
1. Bau der Cry1 -Fluoreszenz-Reporter
Hinweis: Frühere circadiane Studien mit Biolumineszenz System2,12,13 Sicherung circadiane Förderer mit einer destabilisierten Luciferase (dLuc), rhythmische dLuc Ausdruck zu induzieren. Um ein Fluoreszenz-Reporter zu entwickeln, wurde destabilisiert Luciferase mit destabilisiert Fluoreszenz Protein (dVenus) induzieren rhythmische dVenus Ausdruck ersetzt. Die Generation der P (Cry1)-dVenus Reporter ist weiter unten beschrieben, das Konstrukt ist derzeit Addgene übermittelt und werden bald für den akademischen Gebrauch zur Verfügung stehen.
<ol><li>Den funktionale Maus Cry1 Projektträger (+328-1208 bp Region des Gens Cry1 , Transkription Startsite als '' -1 '' bezeichnet) zu verstärken. Verwenden Sie die PCR-Enzym (KOD Plus Neo), Primer F1 und R1 (siehe Tabelle 2), Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, um das Cry1 Förderer DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Intron 336 des Cry1 -Gens, die wichtig für die Funktion der circadianen Uhr Cry114zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F2 und R2, Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, das Intron 336 DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Venuszu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F3 und R3, pVENUS-N1 Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die Venus DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Das NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F4 und R4, pcDNA3.3-d2eGFP-Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken.</li>
	<li>Synthetisieren Sie DNA-Fragment 1 als Exon 1.</li>
	<li>DNA-Fragment 2 als Linker zwischen Intron 336 und die Venus -DNA-Fragment zu synthetisieren.</li>
	<li>Schneiden Sie die pAAV-EF1a-Doppel-Floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA-Vektor-Plasmid mit den Enzymen, MluI und EcoRI. Verwenden Sie das Gel Extraction Kit, um das größere DNA-Fragment zu reinigen. Protokoll des Herstellers zu verwenden.</li>
	<li>Mit einem Gibson-Montage-Mix und seine standard-Protokoll, montieren Sie alle DNA-Fragmente zusammen, um die pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA Reporter zu produzieren. Protokoll des Herstellers zu verwenden.</li>
</ol>2. Herstellung von Adeno-assoziierten Virus15
<ol><li>Vorbereitung der folgenden Plasmid DNA-Aktien: 31,25 µg von pRV1, 31,25 µg pH21 und 125 µg pFdelta6 62,5 µg pAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>Bereiten Sie fünf 15 cm Gerichte der 293T Zellen und warten Sie, bis die Zellen 90 % Zusammenfluss werden.</li>
	<li>Transfizieren Sie Plasmide in den 297T Zellen nach der Transfektion Reagenz-Protokolls. Für jedes Gericht verwenden, 6,25 µg von pRV1, 6,25 µg pH21, 25 µg pFdelta6, 12,5 µg pAAV-p (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA und 120 µL Transfection Reagens.</li>
	<li>72 h nach Transfektion, lösen die Zellen von jeder Platte mit einer Pipette Waffe; Ernten Sie die Zellen in zwei 50 mL Röhrchen.</li>
	<li>Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min und den überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellen, indem man 20 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jedes Rohr; Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min, und den überstand verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Pellets in 150 mM NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0; Verwenden Sie 25 mL der Lösung/Schlauch. Jedes Rohr 1,25 mL frisch zubereitete 10 % Natrium-Deoxycholate (in dH2O) hinzufügen. Eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro mL Benzonase Nuklease hinzufügen und gut durchmischen. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 3000 X g für 15 min entfernt. Weiter zu gewährleisten, dass alle Verschmutzungen entfernt worden ist, indem man die Mischung durch einen 0,45-μm-Spritze-Filter; Dieser Schritt hilft Heparin Spalten verhindert.</li>
	<li>Einrichten von Heparin Spalten mithilfe einer peristaltischen Pumpe; Einstellen der Durchflussmenge bis 1 mL/min, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in die Spalten eingeführt werden.</li>
	<li>Equilibrate der Spalten mit 10 mL eines 150 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Fügen Sie die Lösung mit dem Virus zu jeder Spalte hinzu. Waschen Sie die Spalten mit 20 mL einer 100 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Dann, mit einer 5 mL Spritze, die Spalten mit 1 mL einer 200 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung pH 8.0, gefolgt von 1 mL einer 300 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0 waschen.</li>
	<li>Eine 5 mL Spritze um das Virus mit 3 mL eines 400 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, gefolgt von 4 mL 450 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, eluieren verwenden und schließlich durch eine 3 mL eines 500 mm NaCl , 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Die extrahierten Materialien zu sammeln.</li>
	<li>Laden Sie für rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Konzentration des geförderten Materials, 4 mL in einer Zeit, in zentrifugale Filtereinheiten mit einem 100.000 Molekulargewicht cutoff. Zentrifugieren Sie jede 4-mL-Probe bei 2000 X g für 5 min bei Raumtemperatur, verwerfen die Durchströmung.</li>
	<li>Wenn alle geförderten Materials durch die zentrifugale Filtereinheiten ausgeführt wurden, fügen Sie 4 mL PBS und Zentrifugieren Sie die Mischung in rund 250 μL. RAAVs zu entfernen (virale Titer sollte über 2-8 x 1012 Viruspartikel pro mL) im zentrifugalen Filtereinheiten, aliquoten und Store bei-80 ° C bis zur Verwendung. In diesem Stadium kann das Virus für mehrere Monate gespeichert werden.</li>
</ol>(3) rAAV Injektion und optische Faser Einlegen in der Erwachsenen Maus SCN
<ol><li>Injektion von zirkadianen Fluoreszenz Reporter-tragenden rAAVs in der SCN<ol>
<li>5 µL rAAV zu laden (der Virustiter geht es um 2 bis 8 x 1012 Viruspartikel pro mL) in eine Mikro-Spritze.</li>
		<li>Betäuben Sie Erwachsenen Mäuse (2, 5-Monate alten, C57BL/6 Hintergrund) mit Nembutal (80 mg/kg), über intraperitoneale Injektion. Suchen Sie nach ausreichender Tiefe der Narkose durch das Fehlen einer Zehe-Prise Antwort.</li>
		<li>Mit einer Schere den Kopf der Maus Fell entfernen und montieren Sie dann die Maus in einer stereotaktischen Apparat. Bieten Sie eine Wärmequelle zu betäubten Tiere über einer zirkulierenden Warmwasser Decke oder ein anderes Heizgerät. Hinweis: Verwenden Sie alternativ enthaarende Creme oder elektrischen Haarschneidemaschinen, um das Fell zu entfernen.</li>
		<li>Reinigen Sie der Operationsstelle mit geeigneten Desinfektionsmitteln. Beispielsweise könnte dies gehören sterilem Wasser oder Alkohol und Jod, Betadine oder Chlorhexidin in wechselnden Peelings zu verdünnen. Wiederholen Sie mindestens 3 Mal. Drapieren Sie der Operationsstelle.</li>
		<li>Verwenden Sie die Schere, machen einen Schnitt in der Kopfhaut und setzen den Schädel.</li>
		<li>Einstellen Sie das stereotaktischen Gerät so, dass Bregma und Lambda in der gleichen horizontalen Ebene sind; machen Sie zwei symmetrische Punkte von Bregma, in der gleichen horizontalen Ebene.</li>
		<li>Verwendung eines sterilen Wattetupfer getränkt in 4 % H2O2/h2O, um das Gehirn Periost korrodieren. Dann verwenden Sie ein sauberes, steriles Wattestäbchen und trocknen Sie die Oberfläche des Schädels.</li>
		<li>Mit einem Mikro Bohrer, machen Sie ein Loch von ca. 1 mm im Durchmesser posterior 0,46 mm und 0,25 mm seitliche, Bregma.</li>
		<li>
fi Verwenden Sie einen sauberen sterilen Wattestäbchen mit physiologischer Kochsalzlösung, um Knochenfragmente von der sichtbaren Oberfläche des Gehirns zu löschen.</li>
		<li>Legen Sie eine Mikro-Spritze in das Gehirn, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikro-Spritze 0,46 mm posterior ist und 0,25 mm seitliche Bregma und 5,7 mm tief von der Oberfläche des Schädels.</li>
		<li>Injizieren 500 nL rAAV (50 nL min-1) in der SCN, verlassen die Mikro-Spritze in Ort für 10 min nach der Injektion um komplette Diffusion von rAAV sicherzustellen.</li>
		<li>Ziehen Sie langsam die Mikro-Spritze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die optische Faser in den SCN-Bereich.<ol>
<li>Schneiden Sie mit einem Glasfaser-Messer eine Faser 17-mm in der Länge, um sicherzustellen, dass jede Seite der optischen Faser glatt ist.</li>
		<li>Die Glasfaser in die Keramik Ferrule und befestigen Sie der Glasfaser, Keramik Ferrule mit Methyl-Ethyl-Keton-Peroxid (AB Kleber), um sicherzustellen, dass die Oberflächen der Glasfaser und Keramik Ferrule bündig sind.</li>
		<li>Reinigen Sie die Faser mit einer kalten sterilisiermittel Lösung oder Ethylen oxid.</li>
		<li>Nach rAAV Injektion (Schritt 3.1.11) einfügen der Keramik Ferrule-haltigen Glasfaser in der SCN.</li>
		<li>Befestigen Sie den Keramik-Ferrule und optische Faser auf den Schädel mit dental Harz und trocknen lassen.</li>
		<li>Schmieren Sie die Oberfläche des zahnärztlichen Harzes mit hinteren Nagellack. Wiederholen Sie die Schritte in 3.1.2, 3.2.5, weglassen der eigentlichen Injektion von rAAV zur Steuerung beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Postoperative Pflege<ol>
<li>Subkutan, postoperative Schmerzmittel wie Buprenorphin 2 mg/kg Körpergewicht, Mäuse bieten zweimal am Tag.</li>
		<li>Platzieren Sie Mäuse in einem Recovery-Käfig, während sie aus der Narkose kommen.</li>
		<li>Hausmäuse individuell unter einer 12 h hell/dunkel-Bedingung (Lichtintensität ~ 100 Lux an der Unterseite des Käfigs) mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Acht Tage sollen vor weiter experimentieren, um genügend Erholungszeit zu ermöglichen und um optimale Fluoreszenz Reporter Ausdruck entfallen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in Vivo Fluoreszenz Signalüberwachung und Datenerhebung
<ol><li>Acht Tage nach der Operation, die Faser auf den Maus-Kopf mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor verbinden (zB., Gene Observer). Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal im SCN der Kontroll-Mäusen, das Hintergrundsignal zu etablieren. Führen Sie die Beobachtung und Messung dieses Signals mit Fluoreszenz-Signal-Monitor.</li>
	<li>Bewerten Sie das Fluoreszenzsignal experimentelle Maus mit dem gleichen Betrieb der Maus Steuerung. Schließen Sie Mäuse die viralen Vektoren erhalten haben, aber die Anzeige nur das Hintergrundsignal aus Analyse, aus, da dies bedeutet wahrscheinlich, dass die Spitze der optischen Faser die SCN verpasst hat. Nach diesen ersten Maßnahmen zurück Mäuse in ihrer Heimat Käfige für weitere 3 Wochen erlauben das Fluoreszenzsignal zu stabilisieren.</li>
	<li>Verbinden Sie nach 3 Wochen die Mäuse mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor. Messung die Fluoreszenz für 15 s alle 10 Minuten, bei einer Frequenz von 100 Hz. Während diese Messungen sind die Mäuse frei beweglichen in ihren Käfigen mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Verwenden Sie eine Lichtintensität auf dem Boden des Käfigs von ~ 100 Lux, und eine Leistung des Lasers an der Spitze der Glasfaser zwischen 15-20 µW.</li>
	<li>Perfundieren Sie nach der Fertigstellung aller Aufnahmen Mäuse mit 4 % Paraformaldehyd und entfernen Sie und in Scheiben schneiden Sie die Gehirne um Platzierung der optischen Faser zu überprüfen. Schließen Sie Mäuse aus Analyse, wenn die Glasfaser-Tipp nicht richtig im SCN implantiert wird.</li>
</ol>(5) Datenanalyse und Präsentation
<ol><li>Maßnahme-Fluoreszenz-signal alle 10 min für 15 s, bei einer Frequenz von 100 Hz bis 1500 Datenpunkte ergeben. Der Durchschnitt dieser 1500 Punkte entspricht das Fluoreszenzsignal zu jedem gegebenen Zeitpunkt. Plotten mehrere Durchschnitte im Laufe der Zeit produziert eine Signal-Zeit-Kurve entspricht die transkriptionelle Rhythmus der Cry1 unter einer leichten Kontrollbedingung im SCN Mäusen frei zu bewegen.</li>
</ol>

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<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Im Gegensatz zu ex-Vivo -Methoden, z. B. Slice Kultur4,5, RT-PCR16und in Situ Hybridisierung17, die erfordern, dass Tiere getötet werden, kann das in Vivo Aufnahme Methode Ermittler, circadiane Genexpression in ein lebendes Tier zu studieren. Als solche bietet diese Technologie die Möglichkeit, die Wirkung der verschiedenen körperlichen Störungen (z.B., Schlafentzug, Stress, Ernäh...

Bei Säugetieren regelt der suprachiasmatischen Kern (SCN) den ganzen Körper zirkadianen Rhythmus um eine individuelle Reaktion auf exogene Veränderungen der Umwelt (z.B., Licht, Temperatur, Druck usw.)1zu koordinieren. Uhr Kernkomponenten bestehen aus Per1-3, Cry1-2, Uhrund Bmal1und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der circadianen Uhr jeder Zelle. Jede Zelle in der SCN enthält den transcriptional Aktivator, CLOCK/BMAL1, fungiert als ein Heterodimer induzieren die Expression von v. und Weinen. Das KGV / Schrei-Komplex hemmt dann die Funktion der Uhr/BMAL1, eine Transkription-Übersetzung-Feedback-Schleife zu bilden, das dauert etwa 24 h komplett2,3.
Frühere Studien über die SCN haben vor allem die ex Vivo SCN Stück Kultur Methode4,5,6 eingesetzt und während dieser Ansatz wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt hat, haben seine Grenzen unserer Fähigkeit, gehemmt Daten über den Einfluss der anderen Gehirn-Kerne auf der SCN sowie die Wirkung von exogenen Reize (z.B.Licht) auf Zellen, die ihren Wohnsitz in diesem kritischen Bereich zu erhalten. Im Jahr 2001 erstmals Hitoshi Okamuras Gruppe der Biolumineszenz-System zur in-Vivo Genexpression Monitor circadianen Uhr im SCN in frei beweglichen Mäuse7verwenden. Ken-Ichi Honma Gruppe verbrachte die letzten Jahren Weiterentwicklung der Biolumineszenz in Vivo recording-System in der SCN8,9,10. Zusammen haben diese Studien Forscher mit der Fähigkeit der circadiane Uhr in ständiger Dunkelheit oder nach einem Lichtimpuls zu überwachen zur Verfügung gestellt. Jedoch da Biolumineszenz zu schwach ist für kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus, gepaart mit der Tatsache, dass Licht das vorherrschende Signal für die SCN-vermittelten Entrainment ZIRKADIANE Uhren11erforderlich ist es gibt steigende Nachfrage für die Entwicklung von experimentellen Methoden, die Überwindung der Grenzen Biolumineszenz Aufnahme zugeordnet. Der vorliegende Bericht beschreibt ein Fluoreszenz-basiertes System, das errichtet wurde, um die innere Uhr des SCN in Vivo in Mäusen frei beweglich zu überwachen. Diese einfach zu bedienende Methode ermöglicht kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus und ermöglicht die langfristige Beobachtung der Transkription von Genen der circadianen Uhr im SCN in Echtzeit und in hoher zeitlicher Auflösung.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0,45&nbsp; &Mikro; M&nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap Heparinsäulen</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 Zentrifugalfilter</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp; UFC810024</td><td>100.000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonase-Nuklease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Herstellung einer frischen Lösung für jede</td></tr><tr><td>Charge Maus stereotaktische Apparatur</td><td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Reagenz-Maus</td></tr><tr><td>stereotaktische Apparatur</td><td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid-Lösung</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Optische Faser</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0,39 NA und Oslash; 200 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Mikrospritzenpumpe</td><td>Nanoliter 2000 Injektor, WPI</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Keramikferrule</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&thinsp; &mu; m Innendurchmesser, 2,5 mm Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Geräte</td></tr></tbody></table>

in vivo Überwachung der circadianen uhr genexpression in der maus suprachiasmatischen kern mit fluoreszenz-reporter

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Diese Technik verbindet optische Faser vermittelt Fluoreszenz Aufnahmen mit der präzise Lieferung von recombinant Adeno-assoziierten Virus basierte gen Reporter. Dieses neue und einfach zu bedienen in Vivo Fluoreszenz monitoring-System wurde entwickelt, um die transkriptionelle Rhythmus des Gens Uhr Cry1, im suprachiasmatischen Kern (SCN) frei beweglichen Mäuse aufzeichnen. Hierzu wurde ein Cry1 Transkription Fluoreszenz Reporter entworfen und verpackt in Adeno-assoziierten Virus. Gereinigtes, konzentrierter Virus injiziert wurde, in die Maus SCN, gefolgt durch die Einfügung einer Glasfaser, die dann auf die Oberfläche des Gehirns behoben wurde. Die Tiere waren kehrte in ihre Heimat Käfige und erlaubt eine 1 Monat postoperativen Erholungsphase ausreichend Reporter Ausdruck sicherzustellen. Fluoreszenz verzeichnete dann frei beweglichen Mäuse über einen in-Vivo monitoring-System, das in unserer Einrichtung erstellt wurde. Für die in Vivo recording-System wurde 488 nm Laser mit einem Strahlteiler 1 × 4 gekoppelt, die das Licht in vier Erregung Laserleistungen gleicher Leistung unterteilt. Diese Einrichtung konnten wir aus vier Tiere gleichzeitig aufnehmen. Jedes der emittierte Fluoreszenz Signale wurde über einen Photomultiplier Röhre und einer Datenkarte Erwerb gesammelt. Im Gegensatz dazu erlaubt, die früheren Biolumineszenz in Vivo circadianen Uhr Aufnahmetechnik, diese Fluoreszenz in Vivo recording-System die Aufzeichnung der circadianen Uhr gen-Expression in den Licht-Zyklus.

Fluoreszenz-Reporter-Design der Cry1 war Show in Figur 1A. Mit dem Ansatz über 500 detaillierte nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 wurde erfolgreich in der SCN Erwachsener Mäuse injiziert und robuste Venus Ausdruck (Abbildung 1 b, 1 C) ausgestellt. Fluoreszenz-Signale aufgezeichnet unter 12h / 12h hell/dunkel (LD) und dunkel/dunkel (DD) Bedingungen (Abbildung 2</str...

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Genexpression der zirkadianen Uhr in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung in frei beweglichen Mäusen zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl unter Hell-Dunkel- als auch unter Dunkel-Dunkel-Bedingungen funktioniert, was für die Untersuchung der zirkadianen Uhr von entscheidender Bedeutung ist. Schneiden Sie mit einem Glasfasermesser eine Faser mit einer Länge von 17 Millimetern ab.Stellen Sie sicher, dass jede Seite der Glasfaser glatt ist. Führen Sie die optische Faser in die Keramikzwinge ein und befestigen Sie die optische Faser mit Methylethylketonperoxid an einer Keramikzwinge. Sicherstellen, dass die Oberflächen der optischen Faser und der Keramikferrule bündig sind.Reinigen Sie die Glasfaser mit einem Wattestäbchen, das mit 75% Ethnol getränkt ist. Und halten Sie es sauber, bis es zum Einsetzen bereit ist. Beginnen Sie den Injektionsvorgang, indem Sie zunächst fünf Mikroliter rekombinantes AAV in eine Mikrospritze füllen.Nachdem Sie eine erwachsene Maus mit einem institutionell anerkannten Protokoll betäubt haben, überprüfen Sie, ob eine ausreichende Anästhesietiefe vorhanden ist, da keine Zeh

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Das Verfahren zur Herstellung von Scheiben mit der adulten Maus Hypothalamus suprachiasmatischen Nukleus (SCN), und einen schnellen Weg zur Kultur der SCN Gewebe in organotypischen Kultur Zustand, gemeldet werden. Darüber hinaus ist die Messung der oszillatorischen Uhr-Gen-Protein-Expression mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie beschrieben.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Genetisch codierte Luciferase ist eine beliebte nicht-invasive Reporter der Genexpression. Eine automatisierte längs Luciferase imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR) können längs Aufnahme von Biolumineszenz Zellen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Hier zeigen wir, wie ALLIGATOR im Rahmen des circadianen Rhythmus Forschung verwendet werden können.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Diese Studie führt chemogenetische und auf violettes Licht basierende Strategien ein, um eine zuverlässige zirkadiane Phasenverschiebung am Tag zu ermöglichen.

Induzierung von circadianen Phasenverschiebungen am Tag mittels chemogenetischer und spektraler Ansätze

Erfahren Sie die fluoreszenzbasierte Überwachung circadianer Genexpression im suprachiasmatischen Kern von Mäusen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitmessungen bei Licht-Dunkel- und Dauer-Dunkel-Bedingungen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

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