Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Das übergeordnete Ziel dieses präklinischen Modells am Menschen, das aus chirurgisch reseziertem Tumorgewebe gewonnen wurde, ist die Etablierung einer Primärkultur von patienteneigenen Weichteilsarkomen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Pathophysiologie des Weichteilsarkoms zu beantworten und stellt ein wichtiges präklinisches Instrument zur Vorhersage des Ansprechens auf die Therapie dar. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein vollständig humanes präklinisches Modell handelt.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Weichteilsarkoms, da dieses präklinische Modell mit herkömmlichen innovativen Medikamenten getestet werden kann, um deren Aktivität und Wirkmechanismus zu untersuchen. Obwohl diese Methode Einblicke in das Weichteilsarkom geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung der Interaktion von Weichteilzellen mit Krebszellen angewendet werden. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden aufgrund der Heterogenität des Tumorgewebes und der Isolierung von Tumorzellen Schwierigkeiten haben.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die anfängliche Auswahl der Weichteilsarkomzellen und die Zöliakie-Schritte ein gewisses Maß an Erfahrung erfordern, bevor die Kompetenz erreicht werden kann. Tumorproben sollten in einem sterilen 100-Milliliter-Urinbehälter mit 50 Millilitern DMEM-Medium mit niedrigem Glukosegehalt aufgenommen werden, das mit einem Paraffinfilm versiegelt ist. Die Proben dürfen nach der Tumorresektion maximal drei Stunden bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.

Sterilisieren Sie die Gewebekulturhaube mit 70 % Ethanol und sterilisieren Sie die INOX-Pinzette aus Stahl mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie den Paraffinfilm vom Urinbehälter und entsorgen Sie ihn. Reinigen Sie das Äußere des Urinbehälters mit 70 % Ethanol.

Öffnen Sie eine quadratische Petrischale, öffnen Sie dann den Urinbehälter und verwenden Sie die sterilisierte INOX-Pinzette aus Stahl, um die Tumorproben in die Schale zu übertragen. Fügen Sie PBS hinzu und waschen Sie die Tumorprobe zweimal. Nach dem Waschen zerkleinern Sie die Tumorprobe fein in ein bis zwei Millimeter große Stücke.

Ein Viertel der Gesamtprobe wird in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen umgefüllt. Geben Sie dann einen Milliliter TRIzol-Reagenz in das Röhrchen und frieren Sie sofort bei minus 80 Grad Celsius ein. Sammeln Sie den Rest des fein zerkleinerten Tumormaterials in einem 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie vier Milliliter Kollagenase-Typ-1-Lösung hinzu.

Verdünnen Sie dann die Kollagenase-Typ-1-Lösung mit vier Millilitern Nährmedium, verschließen Sie das Röhrchen und verschließen Sie es mit Paraffinfilm. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius auf einem rollenden Shaker für 15 Minuten, um die Verdauung zu aktivieren. Stellen Sie das Röhrchen nach 15 Minuten mit dem Rollschüttler auf Raumtemperatur und lassen Sie es über Nacht stehen.

Am nächsten Tag filtrieren Sie die Zellsuspension vorsichtig durch einen 100-Mikron-Sterilfilter in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie dann den Filter mit Nährboden und zentrifugieren Sie das Filtrat bei 225 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen und die Zellen mit ein bis zwei Millilitern Kulturmedium resuspendieren.

Nachdem Sie eine Zellzählung durchgeführt und die Zellzahl berechnet haben, plattieren Sie die Zellen in einer Standard-Monolayer-Kultur mit einer Dichte von 80.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Um eine zytologische Probe vorzubereiten, beginnen Sie mit der Entnahme von 100.000 Zellen in 200 Mikrolitern Kulturmedium. Pipettieren Sie die Lösung in einen Einwegtrichter, der mit einem Filter ausgestattet und mit einem Glasobjektträger montiert ist.

Öffnen Sie die Zytozentrifuge und geben Sie die Proben ein. Entsorgen Sie nach der Zytozentrifugation den mit dem Filter ausgestatteten Trichter. Fixieren Sie dann den Objektträger 10 Minuten lang in Aceton, gefolgt von Chloroform für fünf Minuten.

Passieren Sie die STS-Zellen, wenn die Konfluenz etwa 90 % beträgtNach dem Waschen des Zellblatts mit PBS fügen Sie zwei bis drei Milliliter 1X Trypsin in PBS hinzu und inkubieren Sie drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Pipette von 200 bis 1.000 Mikrolitern, um die abgelösten Zellen zu sammeln und in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Fügen Sie vier Milliliter Medium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.

Dann bei 225 mal g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nachdem der Überstand verworfen wurde, resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie einen Milliliter Medium hinzufügen und die Zellen in eine neue Kulturplatte oder einen Kolben aussäen. Tumorzellen wurden aus einem Liposarkom isoliert, das einem 54-jährigen Patienten operativ entnommen wurde.

Eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurde durchgeführt, um die MDM2-Amplifikation in der Gewebeprobe des Patienten nachzuweisen. Die zytologische Analyse der MDM2-Amplifikation in isolierten Tumorzellen bestätigt die Etablierung einer patienteneigenen Primärkultur. Morphologische Veränderungen gegenüber der Base wurden induziert, wenn Kulturen mit Ifosfamid, Epirubicin, Ifosfamid und Epirubicin, Trabectedin und Eribulin behandelt wurden.

Für jedes Viabilitätsexperiment wurden drei unabhängige Replikate durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Empfindlichkeit der Kulturen gegenüber Chemotherapie. Die aktivste Behandlung war die Kombination mit Ifosfamid und Epirubicin, einer Erstlinientherapie bei fortgeschrittenem oder metastasiertem ALT-DDLPS.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15-16 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Tumorprobe fein zu zerkleinern. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen durchgeführt werden, einschließlich Genexpressionsprofilierung, immunhistochemischer Analyse oder Zytotoxizitätsassay, um zusätzliche Fragen zur Biologie von Weichteilsarkomen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Weichteilsarkoms, um die natürliche Geschichte dieser wenig erforschten Malignome zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Primärkultur für vom Patienten stammende Weichteilsarkome einrichten können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben und Medikamenten äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten mit einem Abzug getroffen werden sollten.