Eine einfache und kostengünstige Test zur Messung der Gehfähigkeit in Mausmodellen der Muskeldystrophie
29. Dezember 2017
Dieses Protokoll beschreibt ein flexible und kostengünstige System zur Messung Maus Gehfähigkeit in ein offenes Feld Aktivität Assay. Wir zeigen, dass ein 6-minütige Gehfähigkeit Assay basiert auf diesem System eine Abnahme der Freiwillige Bewegung in Mdx Mäuse erkennt und Verbesserung der Muskel-spezifische Rettung dieser Tiere genau unterscheidet.
Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die freiwillige Gehfähigkeit in Mausmodellen für Muskeldystrophie zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Muskeldystrophie über das Fortschreiten der Muskelschwäche in Mausmodellen der Muskeldystrophie und die Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine nicht-invasive und reproduzierbare Messung der Tieraktivität ermöglicht, die leicht an viele verschiedene Forschungsumgebungen angepasst werden kann.
Platzieren Sie in einem ruhigen, klimatisierten Raum zu einer konstanten Tageszeit eine Kamera auf einem Drahtgeflecht über der Aktivitätskammer, um die Aufzeichnung in der gesamten Arena zu ermöglichen, und reinigen Sie die Kammer mit Desinfektionsmittel. Lassen Sie die Maus unmittelbar vor der Aktivitätsaufzeichnung die Polstange eines digitalen Kraftmessers greifen und ziehen Sie sie vorsichtig zurück, bis die Polstange losgelassen wird. Notieren Sie die Spitzenspannung in Newton für jeden Versuch.
Mit einer Minute Pause zwischen den Versuchen. Platzieren Sie die Maus unmittelbar nach dem Griffkrafttest in der Kammer und starten Sie die Videoaufnahme, damit die Maus frei erkunden kann. Stoppen Sie nach sechs Minuten die Aufzeichnung und bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.
Für die Tracking-Analyse der Videodaten öffnen Sie zunächst die Aufnahme in der entsprechenden Videoschnittsoftware und stellen die Geschwindigkeit auf zwei Mal ein. Exportieren Sie das dezimierte Video im mp4-Dateiformat für die Tracking-Analyse und öffnen Sie das Video im entsprechenden Videoanalyseprogramm. Um die Kalibrierung für die Videoaufzeichnung einzustellen, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie entlang einer Seite der Kammer zu zeichnen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeile, wählen Sie Messung kalibrieren und geben Sie die tatsächliche Größe der Kammerseite in Zentimetern ein. Um die halbautomatische Verfolgung der Mausposition zu starten, klicken Sie auf den Cursor zum Verschieben. Beginnend mit dem ersten Frame im Video klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Punkt, der verfolgt werden soll.
Der Tracking-Punkt wird mit einem blauen Kreis markiert. Verwenden Sie den Rechtspfeil auf der Tastatur, um den Rahmen zu verschieben. Der Tracking-Punkt sollte sich automatisch basierend auf der Position der Heckbasis bewegen.
Wenn die Tracking-Position nicht am Point of Interest in einem bestimmten Frame ausgerichtet ist, richten Sie den blauen Kreis manuell an der Tracking-Position aus. Wenn das gesamte Video verfolgt wurde, speichern Sie das Video und das Tracing-Overlay und wählen Sie In Tabelle exportieren, um die Positionsdaten des Tracing zu exportieren. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen ähnlicher Assays zeigten Dystrophin-Null-MDX-Mäuse, die unmittelbar vor dem Test einem Trainingsprotokoll unterzogen wurden, in einem sechsminütigen Freilandtest signifikant weniger willkürliche Bewegungen als Wildtyp-Tiere.
Tatsächlich blieben die mdx-Mäuse nach der leichten Anstrengung einer Griffkraftherausforderung in der Regel in den ersten Minuten des Gehprotokolls ruhig, mit einer bescheidenen Zunahme der Bewegung um vier bis fünf Minuten. Beim Vergleich von Wildtyp- und MDX-Tieren ohne Belastungsherausforderung werden jedoch keine Unterschiede in der zurückgelegten Strecke festgestellt. Mdx-Mäuse, die für die Utrophin-Expression transgen sind, sind nicht von Wildtyp-Tieren zu unterscheiden, wobei es keine signifikanten Unterschiede in der zurückgelegten Gesamtstrecke oder zu einem der beobachteten kommulativen Zeitpunkte gibt.
Um den Effekt einer Verringerung der Abtastrate zu bestimmen, wurde die Gesamtstrecke gemessen, die von einer Minute Video mit voller Bildrate zurückgelegt wurde, und mit den Entfernungsmessungen verglichen, die aus heruntergerechneten Versionen des Datensatzes abgeleitet wurden. Durch die Reduzierung der Bildrate um die Hälfte verringerte sich die gemessene Entfernung um 5 % der ursprünglich berechneten Entfernung. Die Genauigkeit der gemessenen Entfernung nimmt nach diesem Punkt stark ab, obwohl selbst stark dezimierte Datensätze dem Weg des Tieres immer noch sehr nahe kommen, was die Bedeutung der Berücksichtigung der Bildrate und der Signalverarbeitung bei der Beurteilung der Tieraktivität unterstreicht und zeigt, dass eine hohe räumliche Auflösung in heruntergesampelten Videodaten beibehalten werden kann.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mausbewegung in einer offenen Feldumgebung aufzeichnen und analysieren können. Einmal gemeistert, kann diese Analyse in 15 bis 30 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Dieser kostengünstige und nicht-invasive Assay ermöglicht es Forschern, die motorische Aktivität in Mausmodellen für Muskeldystrophie zu untersuchen und kann als informativer erster Schritt für weitere funktionelle Messungen dienen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein flexibles, kostengünstiges System zur Messung der Fortbewegung von Mäusen in einem Open-Field-Aktivitätsassay. Die Methode ermöglicht eine nichtinvasive und reproduzierbare Erfassung der Tieraktivität, die an verschiedene Forschungsumgebungen angepasst werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Muskeldystrophieforschung
- Verhaltensanalyse
Hintergrund
- Der Test misst die freiwillige Fortbewegung bei Mausmodellen der Muskeldystrophie.
- Er befasst sich mit zentralen Fragen zum Fortschreiten der Muskelschwäche.
- Die Methode dient dazu, die Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zu bewerten.
- Die Aufzeichnung erfolgt in einer kontrollierten Umgebung, um Konsistenz zu gewährleisten.
Zweck der Studie
- Um die freiwillige Bewegung bei mdx-Mäusen zu messen.
- Um die Wirkung muskelspezifischer Interventionen zu bewerten.
- Um Erkenntnisse über den Verlauf der Muskeldystrophie zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Verwendung einer über der Aktivitätskammer positionierten Kamera zur Aufzeichnung.
- Reinigung der Kammer mit Desinfektionsmittel vor den Versuchen.
- Ermöglichen, dass die Maus einen Stab greift, um die maximale Spannung zu messen.
- Aufzeichnung der Aktivität während eines sechsminütigen Gehversuchs.
Hauptergebnisse
- Das System erfasst Abnahmen der willkürlichen Bewegung bei mdx-Mäusen.
- Es unterscheidet genau zwischen Verbesserungen, die auf eine muskelspezifische Wiederherstellung zurückzuführen sind.
- Die Ergebnisse sind über verschiedene Versuche hinweg reproduzierbar.
- Die Methode ist an verschiedene Forschungsumgebungen anpassbar.
Schlussfolgerungen
- Dieser Assay eignet sich zur Untersuchung der Muskeldystrophie bei Mäusen.
- Er liefert wertvolle Daten zur Wirksamkeit potenzieller Therapien.
- Der Ansatz ist flexibel und kann in unterschiedlichen Forschungsumgebungen eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Messung der willkürlichen Fortbewegung bei Mausmodellen liefert einen translationalen Endpunkt für die motorische Funktion bei Muskeldystrophie, der direkt vergleichbar ist mit klinischen Parametern wie dem Sechs-Minuten-Gehtest. Dieser kostengünstige, video-basierte Assay ermöglicht eine reproduzierbare, nicht-invasive Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der therapeutischen Ansprechrate in präklinischen Studien. Durch den Nachweis von Aktivitätseinschränkungen bei dystrophin-negativen mdx-Mäusen sowie deren Wiederherstellung mittels Utrophin-Expression unterstützt die Methode die Zielvalidierung und die mechanistische Entlastung im Rahmen der neuromuskulären Wirkstoffforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die freiwillige Fortbewegung als funktioneller Parameter für Muskelkraft in dystrophischen Modellen quantifiziert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch reproduzierbare Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei mdx-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp- und therapierten Gruppen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem wirksame Interventionen (z. B. Utrophin-Transgen) identifiziert werden, die die Aktivitätsniveaus auf Wildtyp-Niveau normalisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Testung von Substanzen unter Verwendung standardisierter Metriken zur Ambulation im Freilandversuch vor.
- Reproduzierbarkeit: Liefert quantitative, auf Distanz und Zeit basierende Ergebnisse, die eine Standardisierung des Assays zwischen verschiedenen Laboren ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Nutzt kostenlose Open-Source-Software und leicht verfügbare Hardware, um eine Wiederverwendung der Plattform in unterschiedlichen Forschungsumgebungen ohne spezialisierte Ausrüstung zu ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Modelliert patientenrelevante Gehstörungen und schafft so eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Mechanistische Risikominimierung: Klärt, ob beobachtete Effekte auf einer muskelspezifischen Wiederherstellung oder unspezifischen Aktivitätsänderungen beruhen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie die Wiederherstellung der Gehfähigkeit mit der Zielinteraktion und der Modulation des Signalwegs korreliert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für den Entdeckungsprozess von der Zielvalidierung bis zur Leitsubstanzidentifizierung und bietet eine funktionelle Brücke zwischen molekularen Mechanismen und phänotypischen Ergebnissen in Modellen der Muskeldystrophie.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem genetische oder pharmakologische Interventionen mit messbaren Veränderungen der willkürlichen Bewegung verknüpft werden.
- Screening: Ermöglicht die Versuchsbereitschaft durch reproduzierbares, videobasiertes Tracking, das quantifizierbare Gehendpunkte für die Wirkstoffbewertung erzeugt.
- Analysen: Erzeugt positions- und zeitbezogene Datenströme, die es Teams ermöglichen, die motorische Aktivität über Genotypen, Behandlungen und Zeitpunkte hinweg zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem klinische Gehbeurteilungen nachgebildet werden, was die Abstimmung von Biomarkern und die Erstellung prädiktiver Modelle erleichtert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, kostengünstige Kapazität für die Gehtestung und verringert damit die Abhängigkeit von spezialisierten zentralen Einrichtungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in motorischen Funktionstests verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch Open-Source-Tracking und kontrollierte Umweltbedingungen.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalnutzungseffizienz, indem der Bedarf an teuren Bewegungsverfolgungssystemen entfällt, während die Datenqualität erhalten bleibt.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf der funktionellen Wiederherstellung von Gehphänotypen in präklinischen Modellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Kenntnisse in der Videobearbeitung und in der Verwendung von Open-Source-Tracking-Software (z. B. manuelle Einzelbildausrichtung).
- Basiert auf Standard-Aufnahmegeräten und konsistenten Umweltbedingungen (Beleuchtung, Temperatur, Tageszeit).
- Setzt die Einhaltung einheitlicher Protokolle durch alle beteiligten Teams voraus, um die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Standorten und zwischen verschiedenen Bedienern sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen hinsichtlich unterschiedlicher Kammerngrößen, Mausstämme und Aktivitätsniveaus.
- Beinhaltet Kompromisse zwischen Bildwiederholfrequenz und Messgenauigkeit, da eine geringere Bildrate die Genauigkeit bei der Distanzberechnung verringert.
