Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca^{2 +} Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses zellbasierten Assays ist es, Moleküle zu identifizieren und zu charakterisieren, die in der Lage sind, die G-Protein-gekoppelte Rezeptor-vermittelte intrazelluläre Kalziummobilisierung zu stimulieren oder zu hemmen. Diese Methode kann ein wertvoller Assay für die Entdeckung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sein, da sie zum Screening nach Molekülen verwendet werden kann, die Rezeptor-vermittelte intrazelluläre Kalziumkörper modifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, Moleküle mit agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften innerhalb desselben Assays zu identifizieren.

Dieser Assay kann bei der Entdeckung neuartiger Wirkstoffkandidaten helfen, die auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wirken und therapeutische Ziele versprechen, die bei vielen menschlichen Krankheiten eine Rolle spielen. Am Tag der Zellpassage beschichten Sie jede Vertiefung einer schwarz wandigen Polystyrol-96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden mit 100 Mikrolitern 0,1%iger Gelatinelösung und inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Während die Gelatine erstarrt, verwenden Sie eine Trypsin-EDTA-Lösung, um die interessierenden Zellen vom Boden ihres Kulturkolbens zu heben, und resuspendieren Sie die Zellen in frischem Wachstumsmedium in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, sobald sie sich gelöst haben.

Nach der Zählung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in frischem Wachstumsmedium auf eine Konzentration von eins mal 10 bis zum fünften lebensfähigen Zellen pro Milliliter resuspendiert. Wenn die Platten fertig sind, entsorgen Sie überschüssige Gelatinelösung und trocknen Sie die Platten auf einem Laborgewebe. Waschen Sie dann die Vertiefungen mit 200 Mikrolitern PBS und ersetzen Sie die Wäsche durch 200 Mikroliter Zellen pro Vertiefung für eine Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Klopfen Sie am nächsten Morgen auf die Platte, um das Wachstumsmedium aus den Vertiefungen zu entfernen, und trocknen Sie die Platte kopfüber auf einem Papiertuch. Markieren Sie dann die Zellen in jeder Vertiefung mit 100 Mikrolitern Ladefarbstofflösung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Während die Zellen inkubieren, fügen Sie 75 Mikroliter CXCL12 pro Vertiefung in die Chemokinplatte und 50 Mikroliter der interessierenden Verbindung in jede Vertiefung der Verbindungsplatte hinzu.

Schalten Sie als Nächstes die Kühleinheit des Fluoreszenzplatten-Readers ein, gefolgt vom Platten-Reader selbst. Nachdem Sie das System einige Minuten lang gestartet haben, öffnen Sie die Plattenlesersoftware. Um das Assay-Protokoll einzurichten, wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" den Lesemodus und die entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen für den Ladefarbstoff aus.

Wählen Sie die Registerkarte Mischung mit Transferflüssigkeit aus, um die Verbindungen in der Mischplatte automatisch zu mischen. Legen Sie in der Registerkarte Transferflüssigkeit 20 Mikroliter jeder Vertiefung aus der Verbundplatte ein, die in die Messplatte übertragen werden sollen, und positionieren Sie die Pipettenspitzen 20 Mikroliter unter der Flüssigkeitsoberfläche. Stellen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit auf 50 Mikroliter pro Sekunde und die Dosiergeschwindigkeit auf 25 Mikroliter pro Sekunde ein und klicken Sie auf Mit Transferflüssigkeit lesen.

Während des ersten Intervalls werden 60 Reads mit einer Leseintervallzeit von einer Sekunde ausgewählt, wobei 10 Reads aufgezeichnet werden, bevor die Verbindungen in die Messplatte abgegeben werden, und 50 Reads, die danach abgeschlossen werden. Stellen Sie das zweite Intervall mit einer Leseintervallzeit von 30 Sekunden und 18 Lesevorgängen ein. Wählen Sie drei Spitzenwaschgänge für das Protokoll aus und stellen Sie jeden Waschschritt so ein, dass er die passende Waschflüssigkeit, einen Waschgang, eine schnelle Pumpendrehzahl und fünf Hübe pro Waschgang umfasst.

Verwenden Sie die Pipettierpause-Funktion, um eine Pipettierpause von 300 Sekunden einzuschließen, und verwenden Sie die Einstellung "Mit Transferflüssigkeit mischen", um das automatische Mischen der CXCL12-Lösung in der Chemokinplatte zu ermöglichen. In der anschließenden Registerkarte Transferflüssigkeit setzen Sie 25 Mikroliter aus jeder Vertiefung der Chemokinplatte, die auf die Messplatte übertragen werden soll, ein und positionieren Sie die Spitzen 20 Mikroliter unter der Flüssigkeitsoberfläche. Stellen Sie die Aspirationsgeschwindigkeit auf 50 Mikroliter pro Sekunde und die Abgabegeschwindigkeit auf 25 Mikroliter pro Sekunde ein.

Verwenden Sie die Taste "Mit Flüssigkeit übertragen", um das erste Intervall so einzustellen, dass es 145 Lesevorgänge mit einer Leseintervallzeit von einer Sekunde umfasst. Legen Sie das zweite Intervall auf eine Leseintervallzeit von sechs Sekunden und 20 Lesevorgängen fest. Wählen Sie drei weitere Waschtipp-Zyklen aus.

Klicken Sie dann auf Bühnentemperatur einstellen und stellen Sie die Gerätetemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Entsorgen Sie am Ende der Inkubation des Ladefarbstoffs den Puffer von der Messplatte und trocknen Sie die Platte auf einem Laborgewebe. Waschen Sie die Zellen mit 150 Mikrolitern Assay-Puffer pro Vertiefung und ersetzen Sie den Puffer nach zwei Minuten durch 80 Mikroliter Assay-Puffer.

Platzieren Sie die Messplatte in der Leseposition, die Verbindungsplatte an der Quelle an der zweiten Position, die Chemokinplatte an der Quelle an der dritten Position und eine Schachtel mit schwarzen Spitzen an der Quelle an einer Position. Schließen Sie das Gerät und klicken Sie auf Protokollsignaltest, um die relativen Lichteinheiten des Hintergrunds und die Fluoreszenzvarianz auf der Platte zu bestimmen. Wählen Sie im Popup-Fenster Testsignal aus.

Wenn Hintergrundwerte von 8.000 bis 10.000 relativen Lichteinheiten erhalten werden, wählen Sie Aktualisieren und klicken Sie auf Speichern, um das Hauptprotokoll zu speichern. Drücken Sie dann auf Run, um den Assay zu starten. In dieser Grafik ist ein dosisabhängiger Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten, der mit dem dosisabhängigen Anstieg der Freisetzung von Kalzium korreliert.

Steigende Mengen an CXCL12-induzierter Fluoreszenz ermöglichen die Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve, die auf der Differenz zwischen dem minimalen und dem maximalen Ansprechen gegenüber dem Ausgangswert zwischen der ersten Messung nach Zugabe des Chemokins und der abschließenden Messung im Protokoll basiert. Selbst bei hohen Konzentrationen wurde von CXCL12 keine fluoreszierende Kalzium-bezogene Reaktion hervorgerufen, wenn Zellen verwendet wurden, denen der entsprechende funktionelle Chemokinrezeptor CXCR4 fehlte, was die Rezeptorspezifität der CXCL12-evozierten Messung zeigt. Eine wichtige Anwendung für diesen zellbasierten Assay ist die Identifizierung kleiner Moleküle, die nach der Vorinkubation die CXCL12-induzierte Kalziummobilisierung in den Zellen dosisabhängig hemmen, im Vergleich zu nicht-aktiven Verbindungen, die die Reaktion nicht hemmen

Um die inhibitorische Potenz kleiner Moleküle zu bestimmen, kann für die inhibitorischen Moleküle mittels nichtlinearer Regression eine Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt werden. Dieser Assay kann verwendet werden, um andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ohne oder mit nur minimaler weiterer Optimierung zu untersuchen, sowie in diesem Experiment, in dem ein dosisabhängiger Anstieg der Fluoreszenz beobachtet wurde, wenn ein anderer Chemokinrezeptor, CCR5, mit seinem natürlichen Chemokin-Agonisten CCL5 stimuliert wurde. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie verwendet werden, um viele andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu untersuchen, die über die Mobilisierung intrazellulärer Kalziumionen bei der Rezeptoraktivierung signalisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dieser zelluläre Assay zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten des CXCL4-Chemokinrezeptors verwendet werden kann.