Name: Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung spezifischer Peptide des Zika-Virus mittels hochdichter Peptid-Mikroarrays für diagnostische Assays. Diese Methode ermöglicht die Detektion von IgM- und IgG-Antikörpern in Serumproben und liefert Klinikern einen Infektionszeitverlauf.

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Von NIDCRR44 DE024456 wird es durch einen SBIR (Small Business Innovation Research) administrative Ergänzung Grant aktuelle unterstützt. NIDCR HIV-Stipendium, das aus NIDCR Zuschuss U01 DE017855 für die Entwicklung einer bestätigenden Point-of-Care-Diagnostik für HIV entwickelt. Wir erkennen dankbar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) für ihre technische Hilfe und freundliche Unterstützung. Wir danken auch NYU Langone Medical Center für die LI-COR Odyssey Imaging System.

Diese Daten sind ein Teil einer laufenden Forschungsstudie an der New York University College of Dentistry und wurden von der Institutional Review Board der New York University School of Medicine, IRB genehmigt # H10-01894. In dieser Studie verwendete klinischen Proben wurden anonymisierte Proben zuvor verwendet, für die Diagnose und mit Erlaubnis von Wadsworth Center der New York State Department of Health, Albany, NY.
1. Installation der ZIKV High-Density-Peptid Microarray Slide in einem bestimmten Fach Inkubation
<ol><li>Die Glas-Folie an den Rändern mit puderfreien Handschuhen zu behandeln. Die Glas-Folie-Dimensionen sind 75,4 mm 25,0 mm und 1 mm dick. Legen Sie die Folie mit der Microarray-Oberfläche nach oben in das Fach der Inkubation.</li>
	<li>Legen Sie die glänzende Seite der Dichtung mit Blick nach unten auf die Microarray bedruckte Oberfläche. Um eine gute Position zu gewährleisten, überschneiden sich die Schraubenlöcher der Dichtung und der Bodenplatte.</li>
	<li>Legen Sie das Oberteil des Behälters auf die Dichtung zu eine Microarray-Kammer schaffen.</li>
	<li>Sichern Sie die Folie in das Fach durch anziehen ebenso die Rändelschrauben nacheinander von Hand in einem wechselnden Muster, ausgehend von der oberen linken Ecke, gefolgt von unten rechts. Setzen Sie den Deckel des Fachs Inkubation.</li>
</ol>2. Hintergrund Interaktion Erkennung: Färbung der Microarray mit Sekundärantikörper
Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösungen (standard und blockierende Puffer, verdünnte Sekundärantikörper) in der Ecke der Microarray-Kammer zu hinterlegen.
<ol><li>Microarray mit einem standard-Puffer (1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05 % Tween 20, pH 7,4, mit einem 0,45 µm-Filter gefiltert) inkubieren (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min.</li>
	<li>Entfernen Sie die standard-Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer. Füllen Sie leere Objekthalter mit leeren Folien, brechen die Microarray-Folie zu verhindern.</li>
	<li>Die Microarray mit dem blockierenden Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) für 60 min bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min zu blockieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die blockierenden Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
	<li>Inkubieren Microarray mit sekundären Antikörper, Anti-Human IgM Fluorochrom konjugiert, verdünnt 1: 5.000 (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) in der Färbung-Puffer (10 % Puffer im standard Puffer blockiert) für 30 min bei RT in der Dunkelheit auf einem Orbitalschüttler bei 140 u / min.</li>
	<li>Entfernen Sie den sekundären Antikörper durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie die Microarray 3 X, 1 min pro Waschgang mit standard-Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min. Entfernen Sie nach jedem Waschen die standard Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
	<li>Tauchen Sie die Folie 2 X in einen frisch zubereiteten Dipp Puffer (1 mM Tris, pH 7,4), (Gesamtvolumen von 200 mL).</li>
	<li>Trocknen der Microarray, für ca. 1 min, durch Absaugen überschüssigen Flüssigkeit sehr sorgfältig von oben nach unten von der Folie ohne Berührung der Oberfläche der Folie. Analysieren Sie die Folie in einem Microarray Scanner Reader.</li>
</ol>(3) Exposition von Microarray Serum hosten
Achtung: Führen Sie diesen Schritt unter Laborbedingungen Sicherheit, Biosafety Level 2 (BSL-2) aufgrund der potenziellen infektiöse Natur der Serumproben. Arbeiten Sie innerhalb einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank (BSC).
<ol><li>Serumprobe bei 56 ° C für 30 min und Zentrifuge bei 16.000 Rcf für 5 min bei 4 ° C13zu inaktivieren. Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösungen (Färbung, standard-Puffer und verdünnte Serum) in der Ecke der Microarray-Kammer zu hinterlegen.</li>
	<li>Verdünnen Sie Serumprobe in Färbung Puffer, beginnend mit einer 1:1,000 (Gesamtvolumen von 2.000 μL/Microarray) Verdünnung. Halten Sie es bei 4 ° C bis zur Verwendung.</li>
	<li>15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min die Microarray mit der Färbung Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 μL/Microarray) inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Färbung Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Microarray mit verdünnte Serumprobe über Nacht bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min.</li>
	<li>Entfernen Sie die verdünnte Serumprobe durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie die Microarray 3 X, 1 min pro Waschgang mit standard-Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 μL/Microarray bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min. Entfernen Sie nach jedem Waschen die standard Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
</ol>4. Färben mit Sekundärantikörper und beschrifteten Kontrolle Antikörper
Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösungen (standard-Puffer, verdünnte Sekundar- und Label-Antikörper) in der Ecke der Microarray-Kammer zu hinterlegen.
<ol><li>Verdünnen Sie den sekundäre Antikörper in der Färbung Puffer. Hinweis: Verwendung Anti-Human IgM Fluorochrom konjugierten Antikörper oder Anti-Human-IgG Fluorochrom konjugierten Antikörper bei einer Verdünnung von 1:5,000 (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) in Färbung Puffer.</li>
	<li>Mix-Steuerelement Label Antikörper (monoklonalen Anti-HA Fluorochrom konjugiert) bei einer Verdünnung von 1:1,000 (Gesamtvolumen von 2 000 µL/Microarray) in der Färbung Puffer mit sekundären Antikörper, die zuvor in der Färbung Puffer verdünnt.</li>
	<li>Mit dem Microarray für 30 min bei RT in der Dunkelheit auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Mischung aus verdünnten Sekundar- und Label Antikörper durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
	<li>3 X mit standard-Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) waschen. Jedes waschen ist für 1 min auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min. Entfernen Sie nach jedem Waschen die standard Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.</li>
</ol>(5) Microarray Scannen
<ol><li>Tauchen Sie die Folie 2 X in frisch zubereiteten Dipp Puffer (1 mM Tris, pH 7,4) (Gesamtvolumen von 200 mL).</li>
	<li>Trocknen der Microarray, ca. 1 min, durch Absaugen sehr sorgfältig von oben nach unten von der Folie ohne Berührung der Oberfläche der Folie.</li>
	<li>Scannen Sie die Microarray gemäß den Anweisungen des Scanners. Legen Sie die Folie auf den Scanner mit der bedruckten Oberfläche nach oben.</li>
	<li>Erstellen Sie ein neues Projekt und wählen Sie den Scanbereich. Scannerparameter als einstellen: Auflösung: 21 µm, Intensität für 700 und 800 nm Kanäle: 7.0, Scan-Qualität: Medium und Offset: 0,8.</li>
	<li>Erwerben und die Scan-raw-Bild als ein 16-Bit-Graustufen TIFF-Dateiformat speichern.</li>
</ol>(6) Microarray-Analyse unter Verwendung einer speziellen Software
<ol><li>Öffnen Sie die raw-Bild (TIFF-Bild). Öffnen Sie die Array-Raster-Datei.</li>
	<li>Array-Raster, um das Bild mit der Computer-Maus oder Tastatur-Pfeiltasten ausrichten.</li>
	<li>Wählt "quantifizieren" die spezifische Software, die eine Auslesen-Datei erstellt, die die Signalstärke für jeden Fleck, den Hintergrundwert und die entsprechenden Peptidsequenz enthält. Hinweis: Diese Ausgabe-Datei kann auch in ein Tabellenkalkulations-Programm für die weitere Analyse und grafische Darstellung importiert werden.</li>
</ol>(7) Microarray-Lagerung
<ol><li>Speichern Sie die Microarray versiegelt im Dunkeln bei 4 ° C unter Sauerstoff freien Stickstoff oder Argon Gas.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
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<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir entwarfen ein Protokoll mit Hilfe einer High-Density-Peptid Microarray enthält die gesamte Zika Virus Proteinsequenz (Französisch Polynesischen Stamm). Die Microarray wurde von Druck 3.423 anderen überlappenden lineare Peptide hergestellt. Jedes Peptid war 15 Aminosäuren und durch nur einen Rückstand von seinem nächsten Nachbarn in der Reihenfolge (d.h. 14 Rückstände Überlappung) variiert. Obwohl kürzere Überschneidungen gedruckt werden können, ist Epitop Mapping präziser mit längeren Überschneidungen. Jedes...

Zika Virus (ZIKV) Diagnose anhand der klinischen Symptome ist schwierig, weil es Vektoren, geographische Verbreitung und Symptome mit Dengue-Fieber und Chikungunya-Virus-Infektion1teilt. Angesichts des Risikos für unerwünschte Schwangerschaft Ergebnisse bei Frauen während der Schwangerschaft mit ZIKV infiziert, ist es wichtig, zwischen den 3 Viren zu unterscheiden. Obwohl die aktuellen molekularer diagnostischer Tests spezifisch sind, sind sie nur während der relativ kurzen Zeit der akuten Infektion2,3nützlich im Blut oder Speichel. Serologische Tests sind unerlässlich für die Diagnose außerhalb dieser Phase der Infektion4.
Die Entwicklung eines spezifischen serologischen ZIKV-Assays ist anspruchsvoll, aus zwei Gründen: Erstens der Zika-Antigene, die auf das menschliche Immunsystem reagiert sind derzeit nicht bekannt; und zweitens konservierten Flaviviren Aminosäuresequenzen veranlassen Antikörper Kreuzreaktivität. Unser Ziel war es, entdecken einzigartige ZIKV spezifische Peptide in der Diagnostik verwendet werden. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um einen Bildschirm Peptid Bibliotheken für ganze Proteine einschließlich Phagen, bakterielle, und Hefe Oberfläche display5,6,7,8,9, 10. Unsere Strategie war es, ein High-Density-Peptid-Microarray verwenden, die schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-serologische Untersuchungen11,12 erlaubt und anschließend die identifizierten Peptide können zur Verbesserung der serologischen Assays für die Erkennung von ZIKV Infektion.
Dieses Protokoll ermöglicht die Entdeckung von Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid Microarray (Abbildung 1). Die High-Density-Peptid-Microarray wurde mit der Peptid-Laserdrucktechnologie hergestellt. Die gesamte ZIKV Proteinsequenz bestehend aus 3.423 Aminosäurereste basierend auf dem französischen polynesischen Stamm (GenBank: KJ776791.2), wurde gedruckt auf einer standard-Glas-Folie in Blöcken von 15 lineare Rückstände mit einer Überlappung von 14 Aminosäurereste in doppelter Ausführung für eine insgesamt 6.846 Peptid Flecken. Neben der gesamten Zika Protein Sequenz Peptide, nutzt die Microarray Influenza Hämagglutinin (HA) Peptide für interne Kontrollen.
Ein Zika bestätigt positive Serumprobe gewonnenen Wadsworth Center (Albany, NY), verwendet wurde, um spezifische Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) reaktive Peptide zu identifizieren. Nach Inkubation mit der Probe über Nacht, war die Microarray gebeizt mit einem sekundären Fluorochrom konjugierten Antikörper (Anti-Human IgM oder Anti-Human-IgG) und auf einem Microarray Scanner analysiert. Quantifizierung der spot Intensitäten und Peptid-Annotation erfolgte mit einer speziellen Software zur Verfügung gestellt von der gleichen Firma, die die Microarray hergestellt.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Custom Peptide Micarray: Unser Microarray enthält die gesamte Zika-Virus-Proteinsequenz</td></tr><tr><td>PEPperCHIP Inkubationstablett 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP Färbekit (680 nm) (Anti-HA, DyLight-Beschriftung)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14 Tage kostenlose Lizenz für Windows</td></tr><tr><td>Rockland Blocking-Puffer</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgM (mu-Kette) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital-Shaker-Gerät</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 digitaler Mikrotiterschüttler</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika-virus spezifische diagnostische epitop entdeckung

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-Density-Peptid Microarrays erlauben Screening von mehr als sechs tausend Peptide auf einer einzigen Standard-Mikroskopie-Folie. Diese Methode kann für Arzneimittelforschung, therapeutischen Target-Identifizierung und Entwicklung von Diagnostika. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um spezifische Zika Virus (ZIKV) diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Eine menschliche Serumprobe für ZIKV Infektion mit einer High-Density-Peptid Microarray enthält das gesamte ZIKV Protein übersetzt 3.423 einzigartige 15 linear (aa) Aminosäureresten mit einer 14-aa Rückstände Überlappung inkubiert wurde validiert in zweifacher Ausfertigung gedruckt. Färbung mit verschiedenen Sekundärantikörper innerhalb desselben Arrays, erkannt wir Peptide, die Bindung an Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) Antikörper im Serum vorhanden. Diese Peptide wurden für weitere Validierung Experimente ausgewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Strategie zu entwerfen, zu verarbeiten und ein High-Density-Peptid-Microarray zu analysieren.

Die erzielten Ergebnisse mit dem beschriebenen Protokoll sind in Abbildung 2 dargestellte und Abbildung 3. Keine Hintergrund-Wechselwirkungen festgestellt wurden, wenn die Microarray mit sekundären Anti-Human IgM (Daten nicht gezeigt) Pre-Färbung. Färbung mit einem Anti-Human IgM führte Konjugat in mehreren Bereichen über dem Hintergrund grün fluoreszieren Intensitäten, unter Angabe der Bindung dieser Peptide mit...

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Dieses Protokoll kann für andere neu auftretende Infektionskrankheiten readly angepasst werden.

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Zika-Virus-spezifische Peptide für die Verwendung in einem diagnostischen Assay zum Nachweis von Zika-Virus-Antikörpern zu identifizieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da das Virus in etwa 10 Tagen aus dem Blut verschwindet, während Antikörper jahrelang bestehen bleiben. Diese Methode ermöglicht es uns, Antigene und Epitope zu identifizieren, indem wir einen Microarray des gesamten Zika-Proteoms verwenden, um Peptide zu identifizieren, die entweder IgM- oder IgG-Antikörper in einer Serumprobe einer infizierten Person einfangen.Der Hauptvorteil beim Nachweis sowohl von frühen Antikörpern (IgM) als auch von späteren Antikörpern (IgG) besteht darin, dass der Arzt eine Zeitleiste der Infektion erhält. Und das ist besonders wichtig bei Schwangeren. Während dieses Protokoll einen Einblick in die Ursache der Zika-Virus-Infektion bietet, kann es auf andere Krankheitserreger angewendet werden, wobei ein für diesen Erreger spezifischer Microarray verwendet wird, wenn seine Proteinsequenz bekannt ist.Fassen Sie den Glasschieber mit puderfreien Handschuhen an den Rändern an. Die Abmessungen des Glasobjektträgers betragen 75,4 Millimeter x 25,0 Millimeter und 1 Millimeter Dicke. Legen Sie den Objektträger mit der Microarray-Oberfläche nach oben in die Inkubationsschale.Füllen Sie die leeren Objektträgerhalter mit leeren Objektträgern, um zu verhindern, dass der Microarray-Objektträger zerbricht. Legen Sie die glänzende Seite des Siegels nach unten auf die bedruckte Microarray-Oberfläche. Um eine gute Position zu gewährleisten, überlappen Sie die Schraubenlöcher der Dichtung und der Grundplatte.Setzen Sie den oberen Teil des Tabletts auf die Dichtung, um eine Microarray-Kammer zu erstellen. Sichern Sie den Schieber in der Schublade, indem Sie die Rändelschrauben gleichmäßig nacheinander von Hand abwechselnd festziehen. Beginnen Sie oben links und fahren Sie nach unten rechts fort.Legen Sie den Deckel auf die Inkubationsschale. Ein sorgfältiger Umgang mit dem Microarray ist unerlässlich, um Kratzer auf der Microarray-Oberfläche zu vermeiden. Lösungen werden in die Ecke der Microarray-Kammer gegeben und dann wieder entfernt.Auch das Trocknen des Microarrays ist wichtig, um ein gutes Scanbild zu erhalten. Inkubieren Sie den Microarray mit 2.000 Mikrolitern Standardpuffer pro Microarray für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie den Standardpuffer, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren, und blockieren Sie dann den Microarray 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min mit einem Blockpuffer.Entfernen Sie den Blockierungspuffer, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Geben Sie einen anti-humanen IgM-Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper, der im Färbepuffer verdünnt ist, in den Microarray. Dann inkubieren Sie den Microarray 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min.Verwenden Sie eine Pipette, um den Sekundärantikörper zu entfernen, indem Sie aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Waschen Sie den Microarray eine Minute lang mit 2000 Mikrolitern mit Standardpuffer pro Microarray bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie den Standardpuffer mit der gezeigten Technik und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.Tauchen Sie den Objektträger anschließend zweimal in 200 Milliliter eines frisch zubereiteten Tauchpuffers. Trocknen Sie den Microarray etwa eine Minute lang vorsichtig, indem Sie überschüssige Flüssigkeit sehr vorsichtig von der Ober- zur Unterseite des Objektträgers ansaugen, ohne die Oberfläche des Objektträgers zu berühren. Analysieren Sie den Objektträger in einem Microarray-Scanner-Lesegerät, wie weiter unten in diesem Video gezeigt.Inaktivieren Sie die Serumprobe bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 16.000 RCF bei vier Grad Celsius. Bewahren Sie die Probe bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius auf.Inkubieren Sie dann den Microarray mit dem Färbepuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie den Färbepuffer, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Verdünnen Sie die Serumprobe und den Färbepuffer beginnend mit einer Verdünnung von 1:1.000.Inkubieren Sie die verdünnte Probe mit dem Microarray über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entnehmen Sie die verdünnte Serumprobe mit der gezeigten Technik. Waschen Sie den Microarray dann dreimal wie zuvor.Verdünnen Sie den Sekundärantikörper im Färbepuffer. Verwenden Sie einen anti-humanen IgM-Fluorochrom-konjugierten Antikörper oder einen anti-humanen IgG-Fluorochrom-konjugierten Antikörper in einer Verdünnung von 1:5.000 in Färbepuffer. Mischen Sie dann den kontrolliert markierten Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 in Färbepuffer mit dem verdünnten Sekundärantikörper.Inkubieren Sie mit dem Microarray 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln und auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie die Mischung aus verdünnten Sekundär- und markierten Antikörpern, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Waschen Sie dann den Microarray dreimal mit Standardpuffer.Jede Wäsche erfolgt eine Minute lang auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie abschließend den Waschpuffer wie zuvor aus der Microarray-Kammer. Um Microarray-Scans durchzuführen, tauchen Sie den Objektträger zweimal in 200 Milliliter frisch zubereiteten Tauchpuffer.Trocknen Sie den Microarray etwa eine Minute lang, indem Sie sehr vorsichtig von der Ober- zur Unterseite des Objektträgers aspirieren, ohne die Oberfläche des Objektträgers zu berühren. Scannen Sie den Microarray gemäß den Anweisungen des Scanners. Legen Sie den Objektträger mit der bedruckten Oberfläche nach oben auf den Scanner.Erstellen Sie ein neues Projekt und wählen Sie den Scanbereich aus. Stellen Sie die Scannerparameter mit einer Auflösung von 21 Mikrometern, einer Intensität von 7,0 für die 700- und 800-Nanometer-Kanäle, einer Scanqualität des Mediums und einem Offset von 0,8 ein. Erfassen und speichern Sie das Scan-Zeichnungsbild im 16-Bit-Graustufen-TIF-Dateiformat.Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie das Rohbild. Öffnen Sie dann die Array-Rasterdatei. Richten Sie das Array-Raster mit den Pfeiltasten der Maus oder Tastatur des Computers am Scanbild aus.Wählen Sie die Auswahl quantifizieren in der spezifischen Software, die eine Auslesedatei erstellt, die die Signalintensität für jeden Spot, den Hintergrundwert und die entsprechende Peptidsequenz enthält. Lagern Sie den Microarray abschließend verschlossen im Dunkeln bei vier Grad Celsius unter sauerstofffreiem Stickstoff oder Argongas. Hier sehen Sie das rohe Fluoreszenzbild der Färbung des Microarrays mit Anti-Human-IgG nach der Inkubation mit einer spezifischen Zika-Virus-Serumprobe, die im Verhältnis 1:250 verdünnt war.HA-Kontrollpeptide umrahmen den Microarray. Peptide, die stark auf IgG reagieren, werden im Zoom-Panel angezeigt. In ähnlicher Weise ist hier ein rohes Fluoreszenzbild gezeigt, das zeigt, wie der Microarray mit Anti-Human-IgM gefärbt wurde, nachdem er mit einer spezifischen Zika-Virus-Serumprobe inkubiert wurde, die 1:250 verdünnt war.Auch hier bilden die HA-Kontrollpeptide den Rahmen für den Microarray. Peptide, die stark auf IgM reagieren, werden im Zoom-Panel angezeigt. Hier ist eine repräsentative Konsensussequenz des Zika-Virusepitops zu sehen, die mit IgM in den Peptiden der Wirtsserumprobe reagiert.Peptide aus der Epitop-Konsensussequenz sind rot hervorgehoben, und das Peptid mit der höchsten Fluoreszenzintensität ist fett markiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Peptid-Microarray mit hoher Dichte verarbeitet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Microarray vorsichtig zu behandeln, um Kratzer auf der Microarray-Oberfläche zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie ELISA oder ein Oberflächenplasmonenresonanz-Bindungsassay durchgeführt werden, um festzustellen, ob die identifizierten Peptide spezifisch an Zika-Virus-Antikörper und nicht an andere Flavivirus-Antikörper binden. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Diagnostik den Weg für die Entdeckung diagnostischer Peptide anhand von Serum- und Speichelproben ebnen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Infektionserregern wie dem Zika-Virus äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Hitzeinaktivierung der Serumprobe und die Arbeit in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 2 getroffen werden sollten.

zika-virus-specific-diagnostic-epitope-discovery

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zika-Virus (ZIKV), ein neu auftretender Erreger, wird mit fetalen Entwicklungsstörungen und Mikrozephalie in Verbindung gebracht. Die Etablierung eines effektiven infektiösen Zellkultursystems ist entscheidend für die Erforschung der ZIKV-Replikation sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten. In dieser Arbeit werden verschiedene virologische Assays zum ZIKV dargestellt und diskutiert.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation

Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassays werden zu einer Referenz für serologische Tests. Ihre Anwendung ist jedoch durch die Komplexität und zeitaufwändigen Bead-Analyt-Kopplungsprozesse begrenzt. In diesem Bericht wird ein halbautomatisches, reproduzierbares Multiplex-Mikrosphären-Bead-Kopplungsprotokoll vorgestellt, das mit der Standardmethode vergleichbar ist und gleichzeitig die Zeit bis zum Ergebnis erheblich verkürzt.

Ein serologischer Multiplex-Assay zum Nachweis von Antikörperantworten auf Arboviren

Erfahren Sie die Identifizierung spezifischer Peptide des Zika-Virus mittels hochdichter Peptid-Mikroarrays für diagnostische Assays. Diese Methode ermöglicht die Detektion von IgM- und IgG-Antikörpern in Serumproben und liefert Klinikern einen Infektionszeitverlauf.

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

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