Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Zika-Virus-spezifische Peptide für die Verwendung in einem diagnostischen Assay zum Nachweis von Zika-Virus-Antikörpern zu identifizieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da das Virus in etwa 10 Tagen aus dem Blut verschwindet, während Antikörper jahrelang bestehen bleiben. Diese Methode ermöglicht es uns, Antigene und Epitope zu identifizieren, indem wir einen Microarray des gesamten Zika-Proteoms verwenden, um Peptide zu identifizieren, die entweder IgM- oder IgG-Antikörper in einer Serumprobe einer infizierten Person einfangen.

Der Hauptvorteil beim Nachweis sowohl von frühen Antikörpern (IgM) als auch von späteren Antikörpern (IgG) besteht darin, dass der Arzt eine Zeitleiste der Infektion erhält. Und das ist besonders wichtig bei Schwangeren. Während dieses Protokoll einen Einblick in die Ursache der Zika-Virus-Infektion bietet, kann es auf andere Krankheitserreger angewendet werden, wobei ein für diesen Erreger spezifischer Microarray verwendet wird, wenn seine Proteinsequenz bekannt ist.

Fassen Sie den Glasschieber mit puderfreien Handschuhen an den Rändern an. Die Abmessungen des Glasobjektträgers betragen 75,4 Millimeter x 25,0 Millimeter und 1 Millimeter Dicke. Legen Sie den Objektträger mit der Microarray-Oberfläche nach oben in die Inkubationsschale.

Füllen Sie die leeren Objektträgerhalter mit leeren Objektträgern, um zu verhindern, dass der Microarray-Objektträger zerbricht. Legen Sie die glänzende Seite des Siegels nach unten auf die bedruckte Microarray-Oberfläche. Um eine gute Position zu gewährleisten, überlappen Sie die Schraubenlöcher der Dichtung und der Grundplatte.

Setzen Sie den oberen Teil des Tabletts auf die Dichtung, um eine Microarray-Kammer zu erstellen. Sichern Sie den Schieber in der Schublade, indem Sie die Rändelschrauben gleichmäßig nacheinander von Hand abwechselnd festziehen. Beginnen Sie oben links und fahren Sie nach unten rechts fort.

Legen Sie den Deckel auf die Inkubationsschale. Ein sorgfältiger Umgang mit dem Microarray ist unerlässlich, um Kratzer auf der Microarray-Oberfläche zu vermeiden. Lösungen werden in die Ecke der Microarray-Kammer gegeben und dann wieder entfernt.

Auch das Trocknen des Microarrays ist wichtig, um ein gutes Scanbild zu erhalten. Inkubieren Sie den Microarray mit 2.000 Mikrolitern Standardpuffer pro Microarray für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie den Standardpuffer, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren, und blockieren Sie dann den Microarray 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min mit einem Blockpuffer

Entfernen Sie den Blockierungspuffer, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Geben Sie einen anti-humanen IgM-Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper, der im Färbepuffer verdünnt ist, in den Microarray. Dann inkubieren Sie den Microarray 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min.

Verwenden Sie eine Pipette, um den Sekundärantikörper zu entfernen, indem Sie aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Waschen Sie den Microarray eine Minute lang mit 2000 Mikrolitern mit Standardpuffer pro Microarray bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie den Standardpuffer mit der gezeigten Technik und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.

Tauchen Sie den Objektträger anschließend zweimal in 200 Milliliter eines frisch zubereiteten Tauchpuffers. Trocknen Sie den Microarray etwa eine Minute lang vorsichtig, indem Sie überschüssige Flüssigkeit sehr vorsichtig von der Ober- zur Unterseite des Objektträgers ansaugen, ohne die Oberfläche des Objektträgers zu berühren. Analysieren Sie den Objektträger in einem Microarray-Scanner-Lesegerät, wie weiter unten in diesem Video gezeigt.

Inaktivieren Sie die Serumprobe bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 16.000 RCF bei vier Grad Celsius. Bewahren Sie die Probe bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius auf.

Inkubieren Sie dann den Microarray mit dem Färbepuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie den Färbepuffer, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Verdünnen Sie die Serumprobe und den Färbepuffer beginnend mit einer Verdünnung von 1:1.000.

Inkubieren Sie die verdünnte Probe mit dem Microarray über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entnehmen Sie die verdünnte Serumprobe mit der gezeigten Technik. Waschen Sie den Microarray dann dreimal wie zuvor.

Verdünnen Sie den Sekundärantikörper im Färbepuffer. Verwenden Sie einen anti-humanen IgM-Fluorochrom-konjugierten Antikörper oder einen anti-humanen IgG-Fluorochrom-konjugierten Antikörper in einer Verdünnung von 1:5.000 in Färbepuffer. Mischen Sie dann den kontrolliert markierten Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 in Färbepuffer mit dem verdünnten Sekundärantikörper.

Inkubieren Sie mit dem Microarray 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln und auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie die Mischung aus verdünnten Sekundär- und markierten Antikörpern, indem Sie mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer aspirieren. Waschen Sie dann den Microarray dreimal mit Standardpuffer.

Jede Wäsche erfolgt eine Minute lang auf einem Orbitalschüttler bei 140 U/min. Entfernen Sie abschließend den Waschpuffer wie zuvor aus der Microarray-Kammer. Um Microarray-Scans durchzuführen, tauchen Sie den Objektträger zweimal in 200 Milliliter frisch zubereiteten Tauchpuffer

Trocknen Sie den Microarray etwa eine Minute lang, indem Sie sehr vorsichtig von der Ober- zur Unterseite des Objektträgers aspirieren, ohne die Oberfläche des Objektträgers zu berühren. Scannen Sie den Microarray gemäß den Anweisungen des Scanners. Legen Sie den Objektträger mit der bedruckten Oberfläche nach oben auf den Scanner.

Erstellen Sie ein neues Projekt und wählen Sie den Scanbereich aus. Stellen Sie die Scannerparameter mit einer Auflösung von 21 Mikrometern, einer Intensität von 7,0 für die 700- und 800-Nanometer-Kanäle, einer Scanqualität des Mediums und einem Offset von 0,8 ein. Erfassen und speichern Sie das Scan-Zeichnungsbild im 16-Bit-Graustufen-TIF-Dateiformat.

Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie das Rohbild. Öffnen Sie dann die Array-Rasterdatei. Richten Sie das Array-Raster mit den Pfeiltasten der Maus oder Tastatur des Computers am Scanbild aus.

Wählen Sie die Auswahl quantifizieren in der spezifischen Software, die eine Auslesedatei erstellt, die die Signalintensität für jeden Spot, den Hintergrundwert und die entsprechende Peptidsequenz enthält. Lagern Sie den Microarray abschließend verschlossen im Dunkeln bei vier Grad Celsius unter sauerstofffreiem Stickstoff oder Argongas. Hier sehen Sie das rohe Fluoreszenzbild der Färbung des Microarrays mit Anti-Human-IgG nach der Inkubation mit einer spezifischen Zika-Virus-Serumprobe, die im Verhältnis 1:250 verdünnt war.

HA-Kontrollpeptide umrahmen den Microarray. Peptide, die stark auf IgG reagieren, werden im Zoom-Panel angezeigt. In ähnlicher Weise ist hier ein rohes Fluoreszenzbild gezeigt, das zeigt, wie der Microarray mit Anti-Human-IgM gefärbt wurde, nachdem er mit einer spezifischen Zika-Virus-Serumprobe inkubiert wurde, die 1:250 verdünnt war.

Auch hier bilden die HA-Kontrollpeptide den Rahmen für den Microarray. Peptide, die stark auf IgM reagieren, werden im Zoom-Panel angezeigt. Hier ist eine repräsentative Konsensussequenz des Zika-Virusepitops zu sehen, die mit IgM in den Peptiden der Wirtsserumprobe reagiert.

Peptide aus der Epitop-Konsensussequenz sind rot hervorgehoben, und das Peptid mit der höchsten Fluoreszenzintensität ist fett markiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Peptid-Microarray mit hoher Dichte verarbeitet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Microarray vorsichtig zu behandeln, um Kratzer auf der Microarray-Oberfläche zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie ELISA oder ein Oberflächenplasmonenresonanz-Bindungsassay durchgeführt werden, um festzustellen, ob die identifizierten Peptide spezifisch an Zika-Virus-Antikörper und nicht an andere Flavivirus-Antikörper binden. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Diagnostik den Weg für die Entdeckung diagnostischer Peptide anhand von Serum- und Speichelproben ebnen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Infektionserregern wie dem Zika-Virus äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Hitzeinaktivierung der Serumprobe und die Arbeit in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 2 getroffen werden sollten.