Name: Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Erfahren Sie ein neuartiges Feeder-freies System zur Massenproduktion hochreiner muriner Natural Killer Cells aus Knochenmark. Diese Methode ermöglicht Gentransfektionen und verbessert Forschung zur angeborenen Immunität sowie Krebsimmuntherapie.

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Diese Studie wurde unterstützt durch die Research Grants Council of Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) und der Innovation und Technology Fund of Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), direkte Finanzhilfe für Forschung-CUHK (2016.035) und Hong Kong Gelehrter Programm.
H.-YL konzipiert und betreut alle Experimente und trugen zum Manuskript Vorbereitung. Uhr-k.t. Experimente durchgeführt, analysiert Daten und trugen zum Manuskript Vorbereitung. P.C.-T. T., D.S.-F.C., j.s.-C., H., f.-M.W., und G.-YL tierische Proben gesammelt und im Tierversuch teilgenommen. J.s., X.-R.H. und K.-f.t. zum Manuskript Vorbereitung beigetragen.

Das Protokoll für Erhalt und Differenzierung Knochenmark stammenden NK Zellen (BM-NK) basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden20,21,22. Alle Verfahren mit Mäusen wurden durch das Tier Ethik experimentelle Ausschuss (AEEC) an der Chinese University of Hong Kong genehmigt.
1. Vorbereitung des OP9 bedingte Medium
<ol><li>Kultur die murinen Stroma-Zell-Linie OP9 in Alpha-MEM mit 20 % FBS, 100 U/mL Penicillin G und 100 µg/mL Streptomycin, bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre von Luft/CO2 (95 %: 5 %).<ol>
<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer, dann Samen 2 x 106 OP9 Zellen jeweils 75 cm2 Kultur Fläschchen mit 15 mL Medium. Kultur für 48 h.</li>
		<li>Wenn die Kultur Zusammenfluss von 80 % erreicht, waschen Sie die Flasche mit 10 mL PBS und 20 mL schlicht Alpha-MEM-Medium (ohne FBS und Antibiotika) pro Flasche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OP9 Zustand Medium aus der Kultur-Flasche um 24 Uhr zu sammeln, säubern Sie herauf Zellenrückstand mit 0,25 µm Polyethersulfone (PES) Filter und bewahren bei 4 ° C (Nutzung innerhalb von 2 Wochen).</li>
</ol>2. Isolierung von Knochenmarkzellen Maus
<ol><li>Eine 12 Wochen altes Baby C57BL/6J Maus mit einer Überdosis Pentobarbitone (100 mg/kg, intraperitoneale Injektion) einschläfern. Bestätigen Sie Tod durch das Fehlen der Atmung, dann ernten Sie die Femur-Knochen mit einer chirurgischen Messer schneiden an den Verbindungsstellen zwischen den Knochen und entfernen Sie die restlichen Muskeln durch sanfte Kratzen mit der Klinge zu.</li>
	<li>Legen Sie die Knochen in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen mit gekühlten sterile Alpha-MEM, und führen Sie dann die folgenden Schritte in eine biologische Kabinett.</li>
	<li>Das Alpha-MEM-Medium zu verwerfen, und spülen Sie die Knochen mit 70 % igem Ethanol für 30 s.</li>
	<li>Waschen Sie die Knochen mit eiskalten sterile PBS zweimal zu bereinigen, die restlichen Ethanol.</li>
	<li>Übertragen Sie die Knochen in einem Mörser mit 5 mL eiskaltem PBS und sanft fragmentize die Knochen mit einem Stößel (nicht pulverisieren sie).</li>
	<li>Schütteln Sie die Knochen sanft durch Umschwenken der Stößel um die Knochenmarkzellen in die PBS zu lösen. Sammeln Sie die PBS enthaltenden Knochenmarkzellen in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6 für vier Mal bis die Knochenfragmente leuchtet weiß in der Farbe geworden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 465 X g für 5 min bei 4 ° C, dann verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen der Pellet mit 18 mL sterilem destilliertem Wasser und lassen Sie sie stehen für 30 s, rote Blutkörperchen zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL eiskaltes 10 X PBS, die Reaktion zu stoppen filtern dann die Mischung durch ein 70 µm Zelle Sieb lysierten Erythrozyten zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 465 X g für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet mit 20 mL eiskaltem PBS aufzuwirbeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen wiederholen Schritt 2.11 ein zweites Mal.</li>
	<li>Übertragen der Zelle Pellet in ein 100 mm sterile Petrischale mit 10 mL OP9 bedingte Medium aus Schritt 1.2 ergänzt mit 20 % FBS und eine Mischung von 0,5 ng/mL murinen IL-7, 30 ng/mL Maus SCF und 100 U/mL murinen flt3L.</li>
	<li>Brüten der Schüssel bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 2 h Transfer ungebunden Zellen in eine neue Kultur-Behälter bei einer Dichte von 5 x 105 lebensfähige Zellen/mL (Anzahl Zellen durch Hemocytometer mit Trypan blau Ausgrenzung) mit der gleichen mittleren Formel wie in Schritt 2.13 , und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Am 4. Tag ergänzt Veränderung der Kultur Bedingung OP9 bedingte Medium mit 20 % FBS und 2.000 U/mL von murinen Il-2.</li>
	<li>Aktualisieren Sie das Kulturmedium alle 3 Tage; Reife NK-Zellen können durch Tag 7 gewonnen und qualifiziert wie in Abschnitt 4.</li>
</ol>(3) SiRNA-mediated Gene Silencing von NK-Zellen unterscheiden
<ol><li>Premix SiRNA oder Unsinn Steuerung (NC) mit einer Transfektion Agent nach dem Produkthandbuch.</li>
	<li>Führen Sie Schritt 3.1 zu jedem Zeitpunkt seit Tag 0.</li>
	<li>Fügen Sie die 50 nM von SiRNA oder NC-Mischung auf die Zellen aus Schritt 2.14.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.1 auf jedes Medium Erfrischung (z. B.Tag 0, 4 und 7) bis zum experimentellen Endpunkt.</li>
</ol>4. Analyse der NK-Zell-Differenzierung mit Durchflusszytometrie
<ol><li>Ein geeigneter Zeitpunkt die Aussetzung der Differenzierung von Zellen zu sammeln und mit eiskaltem PBS waschen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Zellen mit Zelle Fixierung Puffer nach dem Produkthandbuch.</li>
	<li>Die festen Zellen mit eiskaltem PBS waschen und dann erneut 1 x 106 Zellen in 100 µL Flow Cytometry Färbung Puffer enthaltenden Cy3-konjugierten Anti-Maus NKp46 und PE-konjugierten Anti-Maus CD244-Antikörper in einem Verdünnungsverhältnis von 1: 100.</li>
	<li>Färben Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
	<li>Aufschwemmen der gefärbten Proben mit 300 µL PBS, dann FACS Daten erfassen und analysieren mit Cytobank Plattform20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
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<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
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<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
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<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In der vorliegenden Arbeit haben wir eine neuartige Methode zur Herstellung von Knochenmark stammenden murinen NK Zellen in Vitrobeschrieben. Die Zelle Zuführung in das ursprüngliche System21,22 wird erfolgreich durch das Medium bedingte OP9 Zellen, die weitgehend die Stabilität des Systems der Differenzierung erhöht ersetzt. Darüber hinaus kann das System hohen Menge produzieren und Reinheit der Reife NK Zellen in Vitro als auch in Vivo</em...

Tumorprogression ist weitgehend abhängig von den Tumor Mikroumgebung1,2, einschließlich Host abgeleitet Immunzellen, z.B., NK-Zellen. Mehrere Studien gezeigt, dass die intratumorale NK-Zellen mit dem Tumor Progression3,4negativ korreliert sind. Klinische Studien zeigten darüber hinaus, dass NK-Zell-Adoptiv-Therapie eine mögliche Strategie für Krebs5,6,7,8,9 ist. NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie wurde vor kurzem als eine Therapieoption bei soliden Tumoren vorgeschlagen, aber Herausforderungen gibt es durch die Sekretion von immunsuppressive Zytokine und Downregulation Liganden in der Mikroumgebung von soliden Tumoren zu aktivieren 10,11. Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) ist eine suppressive Rolle in der Karzinogenese vorgeschlagen worden, aber paradoxerweise Krebszellen produzieren auch TGF-β1 zur Unterstützung der Tumor Entwicklung12,13,14 , 15. TGF-β-Signalisierung kann die zytolytischen Aktivität von NK-Zellen über Down-Regulierung Interferon Reaktionsfähigkeit und CD16-vermittelten Interferon-Gamma (IFN-γ) Produktion in-vitro-16,17, unterdrücken 18.
Obwohl Störungen von TGF-β-Signalisierung in der Mikroumgebung Tumor eine Möglichkeit zur Beseitigung von Krebs sein kann, wird vollständige Sperrung der TGF-β-Signalisierung Autoimmunerkrankungen durch seine entzündungshemmende Funktion dazu führen, dass ausweislich der Entwicklung Nebenwirkungen einschließlich systemische Entzündung, modelliert Herz-Kreislauf-Mängel und Autoimmunität in Maus19. So wird Verständnis der Arbeitsmechanismus der TGF-β-vermittelten Immunsuppression zur Identifizierung einer zugänglichen therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebs führen.
Um die molekularen Ereignisse notwendig für NK-Zell-Entwicklung zu erhellen, gegründet Williams Et Al. eine in Vitro -System Differenzierung murinen Knochenmark hämatopoetischen Stammzellen in NK20Zellen. Dieses System erleichtert vor allem die mechanistische Untersuchung der NK-Zell-Entwicklung, einschließlich der Ermittlung der neuartigen Stammväter von NK-Zellen-21. Jedoch Knochenmark Stammväter sollten im System mit OP9 Stromazellen Stützzellen als ein Feeder Schicht20,21kultiviert werden, und diese heterogene Zellpopulation weitgehend beschränkt die weitere Anwendung der gen-Störung Werkzeuge (z.B., SiRNA-vermittelten Gen-silencing) speziell auf die differenzierenden NK-Zellen angewendet.
Hier beschreiben wir ein Feeder-freie System, das durch eine weitere Änderung der in-vitro- System von Williams Et Al20entwickelt wurde. In unserem System der OP9 Stromazellen Feeder-Zellen sind nicht erforderlich, und stattdessen OP9 bedingte Medium verwendet wird, ohne Auswirkungen auf die Differenzierung der NK Zellen in Vitro, und dies vor kurzem führen uns zu entdecken, dass TGF-β Tumorprogression über fördern kann E4bp4-abhängige NK-Zell-Entwicklung in den Tumor Mikroumgebung22zu unterdrücken. Dieses neuartige System bietet erfolgreich eine Hintergrund-freie Methode für die Aufklärung des molekularen Mechanismus der NK-Zell-Entwicklung unter bestimmten Bedingungen (z.B.hohe TGF-β1, SiRNA-vermittelten Gen-silencing, etc..) in Vitro.

<table><tbody><tr><td>OP9 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CRL-2749&etagen; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, ohne Nukleoside</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus Flt3-Ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Maus IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>IC Fixierungspuffer&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Färbepuffer für die Durchflusszytometrie&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE-konjugierte Anti-Maus CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-konjugierte Anti-Maus NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Nonsense-Kontrolle (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA gegen Maus E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& prim;</td></tr></tbody></table>

ein neuartiges feeder-freie system für die massenproduktion von murinen natural killer cells in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natürliche killer (NK) Zellen des angeborenen Immunsystems gehören und sind eine Erstlinien Anti-Krebs-Immunabwehr; aber sie werden in den Tumor Mikroumgebung unterdrückt und der zugrunde liegende Mechanismus ist noch weitgehend unbekannt. Das Fehlen einer einheitlichen und zuverlässigen Quelle von NK-Zellen begrenzt den Forschungsfortschritt NK Zelle Immunität. Hier berichten wir über eine in-vitro- System, die hohe Qualität und Quantität der Knochenmark-abgeleitete murinen NK-Zellen unter einem Feeder-freie Zustand zur Verfügung stellen kann. Noch wichtiger ist, zeigen wir auch, dass SiRNA-vermittelten Gen-silencing erfolgreich die E4bp4-abhängige NK Zelle Reifung hemmt durch den Einsatz dieses Systems. Somit ist diese neuartige in-vitro- NK-Zelle Unterscheidung System eine Biomaterial-Lösung für Immunitäts-Forschung.

Repräsentative Ergebnisse nach dem beschriebenen Protokoll. Insgesamt Knochenmarkzellen Aussetzung wurden unter dem Zubringer-freie Unterscheidung System für 11 Tage kultiviert; deutlichen Anstieg der Proliferationsrate wurde von Tag 7 im Vergleich mit der Anzahl der gesamten Zellen am Tag 0 (Abb. 1A) beobachtet. Reife NK-Zellen mit hohen Kernenergie bis zytoplasmatischen Verhältnis und Granulat-reiche Zytoplasma Morphologie wurden von Tag 6 ...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gen-silencing murine NK-Zellen durch ein Feeder-freie Unterscheidung System für mechanistischen Studie in Vitro und in Vivoin Serienfertigung herzustellen.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Das übergeordnete Ziel dieses neuartigen feederfreien Systems ist es, eine Methode zur Massenproduktion hochreiner natürlicher Killerzellen für in vitro und in vivo Assays bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen der angeborenen Immunologie zu beantworten, einschließlich der Entwicklung natürlicher Killerzellen und der Krebsimmunität. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieses neuartige feederfreie System die Reinheit der produzierten natürlichen Killerzellen erheblich erhöhen kann.Dies erleichtert die folgenden Assays in vitro und in vivo erheblich. Die Indikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die natürliche Killerimmunität, da die Massenproduktion von murinen natürlichen Killerzellen aus dem Knochenmark von Krebspatienten zur Analyse und Modifikation für die persönliche Immuntherapie hergestellt werden kann. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das verbrauchte Medium aus der OP9-Zelle entnommen werden sollte, die sich in der Lastphase befindet.Die Gesichtsdemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Knochenmarkanleitung schwer zu erlernen sind, da die Knochen mit Ethanol und zum optimalen Zeitpunkt steril sein müssen, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Um diesen Vorgang zu beginnen, entnehmen Sie die OP9-Zellen aus einem Kulturkolben. Fügen Sie FBS hinzu, um die Trypsinverdauung zu stoppen.Sammeln Sie die OP9-Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei der 465-fachen Schwerkraft. Suspendieren Sie danach das Zellpellet erneut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Dann säen Sie zwei mal 10 bis sechs Zellen in 15 Milliliter Alpha-Mem-Medium in einem 75 Zentimeter großen Kulturkolben aus und inkubieren Sie 48 Stunden lang. Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen mit 10 Millimeter phosphatgepufferter Kochsalzlösung und fügen Sie den Zellen 20 Milliliter reines Alpha-Mem-Medium ohne Antibiotika und fötales Rinderserum hinzu. 24 Stunden inkubieren.Am nächsten Tag sammeln Sie das OP9-konditionierte Medium, indem Sie die Zelltrümmer mit einem Filter entfernen und bei vier Grad Celsius konservieren. Injizieren Sie eine Überdosis von 100 Milligramm pro Kilogramm Pentobarbiton intraperitoneal, um eine 12 Wochen alte Maus einzuschläfern. Nachdem Sie die Atemnot bestätigt haben, entfernen Sie die Oberschenkelknochen mit einem chirurgischen Messer.Entfernen Sie die restlichen Muskeln, indem Sie vorsichtig mit einer Klinge kratzen. Die Knochen werden in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben, das mit gekühltem, sterilem Alpha-Mem-Medium gefüllt ist, und in einer Biosicherheitswerkbank aufbewahrt. Stoßen Sie dann das Alpha-Mem-Medium aus und waschen Sie die Knochen 30 Sekunden lang mit 70%igem Ethanol.Waschen Sie die Knochen erneut zweimal mit eiskalter, steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das restliche Ethanol zu entfernen. Nach dem Waschen die Knochen in einen Mörser mit fünf Millilitern eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung geben und die Knochen mit einem Stößel fragmentieren. Schwenken Sie den Stößel vorsichtig, um die Knochenmarkzellen in die phosphatgepufferte Kochsalzlösung freizusetzen.Übertragen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die Knochenmarkzellen enthält, in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei der 465-fachen Schwerkraft. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen.Extrakte, bis sich der Knochen weiß verfärbt, um eine maximale Ausbeute zu erzielen. Als nächstes suspendieren Sie das Pellet wieder mit 18 Millilitern sterilem destilliertem Wasser und warten Sie 30 Sekunden, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Fügen Sie dann zwei Milliliter 10-fache eiskalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um die Reaktion zu stoppen.Verwenden Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb, um die lysierten roten Blutkörperchen zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 465-facher Schwerkraft. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 20 Millilitern eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Zentrifugieren Sie die Zellen noch einmal. Als nächstes wird das Zellpellet in eine sterile 100-Milliliter-Petrischale mit 10 Millilitern OP9-bedingtem Medium gegeben, ergänzt mit zusätzlichen Reagenzien. Übertragen Sie die Petrischale in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für zwei Stunden.Entnehmen Sie alle nicht gebundenen Zellen und den Samen in eine neue Kulturschale, die OP9-bedingtes Medium enthält, und legen Sie ihn fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Am vierten Tag wird das Kulturmedium durch OP9-bedingtes Medium ersetzt, das mit 20 % fötalem Rinderserum und 2.000 Einheiten interleukin 2 pro Milliliter muriner Haut ergänzt wird. Wechseln Sie das Kulturmedium alle drei Tage bis zum siebten Tag, um die reifen natürlichen Killerzellen zu erhalten.Befolgen Sie das Produkthandbuch, um die kleine interferierende RNA oder die Nonsense-Kontrolle mit dem Transfektionsreagenz am null., vierten und siebten Tag nach dem Wechsel des Mediums bis zum experimentellen Endpunkt vorzumischen. Geben Sie 50 Nanomolare kleine interferierende RNA oder Nonsense-Mischung während der mittleren Auffrischung zu den nicht gebundenen Zellen. Sammeln Sie die differenzierenden Zellen zu einem geeigneten Zeitpunkt.Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei der 465-fachen Schwerkraft. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nachdem Sie die fixierten Zellen mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen haben, suspendieren Sie die Zellen erneut in 100 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Färbepuffer, der SY3-konjugierte Antikörper enthält.Danach werden die Proben für die Faxanalyse in 300 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert. Eine repräsentative Wachstumskurve, die die Proliferationsrate der Knochenmarkzellen zeigt, die sich in einem feederfreien System zu natürlichen Killerzellen differenzieren. Die Grafik zeigt einen signifikanten Anstieg der Proliferationsrate der Zellen bis zum siebten Tag.Ein repräsentatives Hellfeldbild, das differenzierte natürliche Killerzellen in einem neuartigen Feeder-freien System zeigt. Reife natürliche Killerzellen wiesen ein hohes Verhältnis von Kern zu Zytoplasma mit einer granularen zytoplasmatischen Morphologie auf. Ein repräsentatives Balkendiagramm, das die Wirkung von kleiner interferierender RNA auf die Knochenmarkzellen zeigt, die am sechsten Tag zu natürlichen Killerzellen differenziert werden.Das Diagramm zeigt eine signifikante Reduktion der E4bp4-mRNA-Spiegel und der mit kleiner interferierender RNA behandelten natürlichen Killerzellen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Ein repräsentativer durchflusszytometrischer Daten, der die Wirkung von stillgelegtem E4bp4 auf die Differenzierung von natürlichen Killerzellen aus dem Knochenmark in einer TGF beta-1 Smad3-abhängigen Weise zeigt. Die Daten zeigen, dass der Knockdown von E4bp4-mRNA die Produktion reifer natürlicher Killerzellen am sechsten Tag im Vergleich zur Nonsense-Kontrolle stark abnimmt.Es wurde gezeigt, dass eine durch kleine interferierende RNA vermittelte verminderte Produktion natürlicher Killerzellen durch die Unterdrückung von TGF beta-1 Smad3 mit einem mikromolaren SIS3 Smad3-Inhibitor im Vergleich zur kleinen interferierenden RNA-transfizierten Gruppe gerettet werden kann. Sobald diese Studie gemeistert ist, kann sie in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Mit diesem Verfahren können genetische Modifikationen wie Gen-Lockdown und Überexpression durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Regulationsmechanismen für die Aktivität natürlicher Killerzellen sowie die Entwicklung zu beantworten.Die erste Idee zu dieser Methode hatte ich, als ich die natürlichen Killerzellen im alten System vermehrte. Das Vorhandensein der fötalen Zellen verringerte die Belastung und Effizienz der siRNA für das interessierende Gen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie massive, hochwertige natürliche Killerzellen aus diesem lokalen System in vitro herstellen können.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit RNA-Extraktionsreagenzien äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Expansion von natürlichen Killerzellen (NK) direkt aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Feeder-Zelllinie. PBMCs werden mit genetisch veränderten lymphoblastoiden Feeder-Zellen co-kultiviert, die membrangebundenes Interleukin-21 (mIL-21) exprimieren, und die Kultur wird mit den Zytokinen Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-15 (IL-15) ergänzt. Zusammen führt dieser Ligandencocktail zu einer verlängerten Expansion...

Ex-vivo-Expansion natürlicher Killerzellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung, Expansion und in-vivo-Bildgebung von NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

In dieser Studie stellen wir ein in vitro Kultursystem vor, das effizient pDCs erzeugen kann, indem gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen mit AC-6-Feederzellen in Gegenwart von Flt3-Liganden co-kultiviert werden.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Hier stellen wir ein angepasstes Protokoll vor, das zur Erzeugung einer großen Anzahl von murinen invarianten natürlichen Killer-T-Zellen aus der Milz der Maus verwendet werden kann. Das Protokoll beschreibt einen Ansatz, mit dem Milz-iNKT-Zellen in vitro mit einer begrenzten Anzahl von Tieren und Reagenzien angereichert, isoliert und expandiert werden können.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

Hier stellen wir eine Methode zur Erweiterung von peripheren Blut-Naturkillern (PBNK), NK-Zellen aus Lebergeweben und chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen vor, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) stammen. Dieses Protokoll demonstriert die Expansion von NK- und CAR-NK-Zellen unter Verwendung von 221-mIL-21-Feederzellen zusätzlich zur optimierten Reinheit expandierter NK-Zellen.

Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.

Generierung natürlicher Killerzellen aus humanen Stammzellen mit erweitertem Potenzial

Natürliche, aus Killerzellen gewonnene extrazelluläre Vesikel (NK-EVs) bergen vielversprechendes Potenzial als Krebsbiotherapeutika. Diese methodenbasierte Studie stellt einen skalierbaren geschlossenen Bioproduktions-Workflow vor, der darauf ausgelegt ist, kontinuierlich große Mengen hochreiner NK-EVs zu produzieren und zu isolieren. Während des gesamten Bioproduktions-Workflows werden In-Prozess-Kontrolltests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Elektrofahrzeuge die Qualitätsstandards...

Skalierbarer Biomanufacturing-Workflow zur Herstellung und Isolierung von natürlichen, aus Killerzellen gewonnenen extrazellulären Krebs-Biotherapeutika auf Vesikelbasis

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare Methode zur Erweiterung von Adoptive Cell Therapies (ACT)-Produkten, nämlich Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-Zellen und Cytokine-Induced Killer (CIK)-Zellen, mit gasdurchlässigen Rapid Expansion (G-Rex)-Geräten, die ein effizientes und robustes Wachstum in einem klinisch relevanten Kontext nachweisen.

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

Erfahren Sie ein neuartiges Feeder-freies System zur Massenproduktion hochreiner muriner Natural Killer Cells aus Knochenmark. Diese Methode ermöglicht Gentransfektionen und verbessert Forschung zur angeborenen Immunität sowie Krebsimmuntherapie.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

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