Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Ganzorgan- und histologische Analyse des embryonalen Hinterhirns der Maus während der Entwicklung zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht es, die Entwicklungen der Neurogenese im Hinterhirn eines Säugetiermodellorganismus zu untersuchen. Das sich entwickelnde Hinterhirn der Maus ist aufgrund seiner flachen Architektur, die die Beobachtung von Neurogenesemustern im gesamten Organ erleichtert, ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Aktivität der neuronalen Progenese.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Einschläferung einer zeitlich begrenzten schwangeren weiblichen Maus mit einem ethisch anerkannten Verfahren im erforderlichen Schwangerschaftsstadium. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere die Bauchhöhle auf und exzitieren Sie vorsichtig die Gebärmutter. Legen Sie die herausgeschnittene Gebärmutter mit den Embryonen in eine 60 Millimeter große Plastikschale mit 20 Millilitern eiskaltem PBS.

Führen Sie alle weiteren Dissektionen mit einem Präpariermikroskop durch. Reißen Sie mit der Uhrmacherzange Nummer fünf die Gebärmuttermuskulaturswand auf, um die Embryonen freizulegen. Geben Sie jeden Embryo frei, indem Sie die Nabelschnur durchtrennen und den Dottersack entfernen.

Nachdem Sie jeden Embryo in eine saubere Plastikschale mit eiskaltem PBS übertragen haben, verwenden Sie die Uhrmacherzange Nummer 55, um den Kopf abzutrennen. Optional können Sie ein kleines Stück Gewebe für die genomische DNA-Isolierung und die anschließende Genotypisierung aufbewahren. Mit der Uhrmacherzange Nr. 55 das Gewebe, das das Hinterhirn parallel und unmittelbar unter dem Neuroepithel des Hinterhirns enthält, herausschneiden, um es vom Gesichts- und Vorderhirngewebe zu trennen.

Positionieren Sie das Hinterhirn und das kaudale Kopfgewebe mit der Rückenseite nach oben und identifizieren Sie den vierten Ventrikel, der von einer dünnen Gewebeschicht bedeckt ist, die als Dachplatte bekannt ist. Durchstechen Sie die Dachplatte vorsichtig mit der Uhrmacherzange Nummer 55 und ziehen Sie überschüssiges Gewebe mit einer Pinzette ab, indem Sie sich rostral entlang der Mittellinie über das Mittelhirn und dann kaudal über das hintere Hinterhirn und das Rückenmark bewegen. Das Hinterhirn soll nun in einer Open-Book-Präparation freigelegt werden.

Um das Hinterhirn für die Immunmarkierung vorzubereiten, verwenden Sie die Uhrmacherzange Nummer 55, um den verbleibenden Mesenchymkopf und alle Hirnhäute, die an der Schalenseite des Hinterhirns befestigt sind, vorsichtig zu entfernen. Entfernen Sie das Mittelhirn- und Rückenmarksgewebe, so dass nur das Gewebe des Hinterhirns übrig bleibt. Um das Hinterhirn für das Vibratom und die Kryo-Schnitte vorzubereiten, verwenden Sie die Uhrmacherzange Nummer 55, um das Mittelhirn- und Rückenmarksgewebe zu entfernen.

Übertragen Sie das Hinterhirn aus der Kunststoffschale mit einer Pasteur-Pipette in zwei Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Nachdem Sie das gesamte PBS abgesaugt haben, fixieren Sie das Hinterhirn zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius unter sanftem Rühren in frisch aufgetautem Formaldehyd mit 4 Gew.-% pro Volumen, das in PBS gelöst ist. Zum Schluss spülen Sie das Hinterhirn dreimal mit PBS aus.

Falls erforderlich, rehydrieren Sie das Hinterhirn in seriell abnehmenden Wahnvorstellungen von Methanol in PBS bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei jeder Konzentration. Übertragen Sie dann das Hinterhirn auf PBS. Permeabilisieren Sie das Hinterhirn 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius in PBS-haltigem PBS unter sanfter Bewegung.

Dann inkubieren Sie das Hinterhirn eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in PBT mit 10 % hitzeinaktiviertem Ziegenserum. Als nächstes inkubieren Sie das Hinterhirn wie zuvor über Nacht in PBT, das 1%hitzeinaktiviertes Serum und primäre Antikörper enthält. Am nächsten Tag waschen Sie das Hinterhirn bei vier Grad Celsius jeweils eine Stunde lang mit PBT.

Nach dem Waschen wird das Hinterhirn über Nacht bei vier Grad Celsius in PBT inkubiert, das die entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper enthält, die gegen die verwendeten Primärantikörper gerichtet sind. Halten Sie das Hinterhirn von diesem Zeitpunkt an im Dunkeln, um Fluorophore vor Photobleiche zu schützen. Nach dem Waschen wie zuvor mit PBT wird das Hinterhirn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%igem Formaldehyd in PBS fixiert, um die Antikörperbindung langfristig zu erhalten.

Decken Sie in der Zwischenzeit einen Glasobjektträger mit zwei Lagen schwarzem Isolierband ab und schneiden Sie ein kleines Quadrat aus dem Schichtband heraus, um eine Tasche zu schaffen, die groß genug ist, um das Hinterhirn aufzunehmen. Nachdem Sie das Hinterhirn zweimal kurz in PBS gespült haben, übertragen Sie es mit einer Pasteur-Pipette in die Tasche. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit und geben Sie ein geeignetes Anti-Fade-Reagenz in die Tasche.

Decken Sie dann das Hinterhirn langsam mit einem Glasdeckglas ab, um zu vermeiden, dass Luftblasen unter dem Deckglas eingeschlossen werden. Versiegeln Sie das Deckglas und befestigen Sie es mit einer dünnen Schicht Nagellack auf dem Objektträger. Lagern Sie das Dia bis zur Bildaufnahme bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Einbettung des Hinterhirns in geschmolzene Agarose mit 3 Gew.-% pro Volumen, die in destilliertem Wasser hergestellt wurde. Beim Schnitt werden Hinterhirnschnitte mit Hilfe eines Vibratoms auf eine Dicke von 70 Mikrometern übertragen. Übertragen Sie jeden frisch geschnittenen Abschnitt mit einem Pinsel in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit eiskaltem PBS.

Nachdem Sie die schwebenden Abschnitte wie im Textprotokoll beschrieben beschriftet haben, waschen Sie sie kurz in PBS. Übertragen Sie schwebende Schnitte vorsichtig mit einem Pinsel auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Wischen Sie das überschüssige PBS um den Abschnitt herum mit Löschpapier oder Taschentuch auf.

Nicht die Abschnitte, die 80% Glycerin in PBS verwenden. Und decken Sie sie langsam mit einem Glasdeckglas ab, um Luftblasen nicht einzuschließen. Lagern Sie das Dia bis zur Bildaufnahme bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Inkubieren Sie das Hinterhirn in 30 % Gewichtsprozent pro Volumen Saccharose in PBS bei vier Grad Celsius, um das Hinterhirn vor dem Einfrieren kryosicher zu schützen. Tauchen Sie das Hinterhirn in eine optische Schnitttemperaturmasse oder OCT. Frieren Sie sie dann schnell ein, indem Sie die Formen mit dem Hinterregen in Isopentan überführen, das auf Trockeneis auf 40 bis 50 Grad Celsius abgekühlt ist.

Schneiden Sie anschließend die Hinterhirnabschnitte mit einem Kryostaten auf eine Dicke von 10 Mikrometern zu. Übertragen Sie die Hinterhirnschnitte auf elektrostatisch klebende Objektträger. Inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Schnitte zu den Objektträgern zu trocknen.

Waschen Sie dann die Kryo-Schnitte mit PBS, um das OCT aufzulösen. Markieren Sie mit einem PAP-Pen eine hydrophobe Barriere um die Kryo-Schnitte. Nehmen Sie die Proben mit einem Epi-Fluoreszenz- oder konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ab, das mit Linsen ausgestattet ist, die für wässrige Medien geeignet sind, sowie optischen Filtern, die für die Fluorophore geeignet sind, die für die Immunmarkierung verwendet werden.

Um das gesamte Hinterhirn oder einen Hinterhirnabschnitt abzubilden, verwenden Sie ein Objektiv für eine 10-fache Vergrößerung. Um die Bereiche des Hinterhirns für die Quantifizierung sichtbar zu machen, verwenden Sie eine 40-fache Vergrößerung. Und um einzelne Zellen sichtbar zu machen, verwenden Sie eine Linse mit einer 63-fachen Vergrößerung.

Hier sind repräsentative Ergebnisse von Wholemount-Immuno-markierten Hinterhirnen zur Beobachtung sich teilender neuraler Vorläuferzellen in der ventrikulären Zone zu sehen. Diese Bilder wurden unter Verwendung des mitotischen Markers Phosphohiston H3 in aufeinanderfolgenden Entwicklungsstadien erhalten. Transversale Vibratomschnitte wurden nach einem einstündigen EdU-Impuls markiert, um neurale Vorläuferzellen des Hinterhirns, die eine interkinetische Kernmigration durchlaufen, sowie mitotische Phospho-Histon-H3-positive Zellen an der ventrikulären Oberfläche hervorzuheben.

Der Gesamtanteil der selbsterneuernden neuralen Vorläuferzellen kann bestimmt werden, indem der Prozentsatz der doppelt positiven Ki67-BrdU-Zellen in Gelb unter allen BrdU-positiven Zellen in Rot und Gelb in Kryoschnitten des Hinterhirns von Embryonen einen Tag nach der Verabreichung von BrdU berechnet wird. Vibratomschnitte im Hinterhirn können auch mit einem Antikörper für das intermediäre Filamentprotein Nestin, auch bekannt als RC-2, immunmarkiert werden, um die Endfüße und Vorsprünge der neuralen Vorläuferzellen sichtbar zu machen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Flat-Mount-Präparat oder Querschnitte des Hinterhirns analysiert.

Einmal gemeistert, können bis zu 10 Hinterhirne in weniger als einer Stunde präpariert werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eiskaltes PBS zu verwenden, wenn Sie sich zuerst mit der Mikrodissektion des Hinterhirns vertraut machen, da dies die Trennung von den Hirnhäuten erleichtert und den Erhalt des Gewebes gewährleistet. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Durchflusszytometrie an Einzelzellsuspensionen des Hinterhirns durchgeführt werden, um neurale Vorläuferzellen von anderen Zelltypen zu trennen.

Die Etablierung dieser Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsneurobiologie den Weg geebnet, die Mechanismen der Neurogenese von Säugetieren zu erforschen, indem sie das Hinterhirn als Alternative zu den herkömmlich verwendeten Rückenmarks- und Vorderhirnmodellen verwenden. Diese Methode kann Einblicke in die Neurogenese des Hinterhirns von Säugetieren geben, kann aber aufgrund des Grades der strukturellen und molekularen Ähnlichkeit zwischen den Arten auch auf andere sich entwickelnde Wirbeltiere angewendet werden. Diese Technik kann bei der Entdeckung neuer Mechanismen helfen, die die Neurogenese steuern, und dabei helfen zu bestimmen, ob diejenigen, die an anderer Stelle in der Achse identifiziert wurden, in diesem Teil des Wirbeltiergehirns rekapituliert werden.