2.15: Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie)

1. Vorbereitung der NMR Ausgangsmaterial

1. Fügen Sie ~ 10 mg Ausgangsmaterial für ein sauberes NMR-Röhrchen.
2. Lösen Sie das Ausgangsmaterial in ~0.7 mL deuterierter Lösungsmittel (Beispiel CDCl-₃). Eine passende Höhe des Lösungsmittels für ein gutes Spektrum beträgt 4,5-5 cm.
3. Röhrchen Sie die NMR vorsichtig und schreiben Sie den Probennamen auf der Kappe.
4. Schütteln Sie die Probe vorsichtig, um sicherzustellen, dass alles Material aufgelöst hatte. Achten Sie darauf, vermeiden Sie den Kontakt zwischen dem Lösungsmittel und die Kappe, die zu möglichen Kontamination der Probe führen könnten.
5. Die NMR-Röhrchen vorsichtig in ein Spinner einführen. Der Spinner dreht sich nach dem Einlegen in den Magneten um sicherzustellen, dass die gesamte Probe ein homogenes Magnetfeld erfährt. Reinigen Sie die Außenseite der NMR-Röhrchen und Spinner mit 2-Propanol und Labor Gewebe, um Fingerabdrücke und Schmutz entfernen.
6. Ort der Spinner in einer Probe Tiefe messen um sicherzustellen, dass unten die NMR-Röhrchen nicht zu weit in der NMR-Sonde eingefügt wird, da, dass das Spektrometer möglicherweise beschädigen könnte. Verschiedene Sonden haben unterschiedlichen Tiefen und der Benutzer muss die spezifischen Tiefenmesser beachten.
7. Legen Sie die Probe in der NMR-Spektrometer. Hier wurde ein Varian 400 MHz-Spektrometer, ausgestattet mit einem Autosampler verwendet.
8. Verarbeiten Sie nach Beendigung der NMR-Messung das Spektrum zu und weisen Sie die Peaks im Spektrum.

2. Vorbereitung des 3 M NaOH und Chalcone Synthese

1. 60 mg NaOH hinzu kommt eine volumetrische 50 mL-Flasche.
2. Auflösen der NaOH durch Zugabe von entionisiertem Wasser auf die Hälfte des Kolbens. Verdünnen Sie die Lösung durch Zugabe von mehr Wasser, bis die Markierung erreicht ist.
3. Fügen Sie 10 mL Ethanol in einer 50 mL Rundboden-Kolben ausgestattet mit einer magnetischen Stir Bar.
4. Danach fügen Sie 680,5 mg 4-Methoxybenzaldehyde und 5 mL NaOH-Lösung, die in Schritt 2.1 in den gleichen Kolben vorbereitet.
5. 671 mg 4-Methylacetophenone Folge der gerührten Lösung und den Kolben Mütze und rühren bei Raumtemperatur.
6. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion von ¹H NMR in 30 min Abständen (siehe Schritt 3) bis zum vollständigen Verbrauch der Ausgangsstoffe.
7. Fügen Sie 5 mL Wasser hinzu, wenn die Reaktion Abschluss (~ 3 h) erreicht hat. Filtern Sie den entstehenden Niederschlag zu und waschen Sie es mit 20 mL Ethanol/Wasser 1:2. Lassen Sie der Niederschlag der Luft trocknen.
8. Berechnen Sie die Rendite des erworbenen Produkts. Eine NMR-Probe gemäß Schritt 1.2.2.7 vorbereiten. Überprüfen Sie die Reinheit mit ¹H NMR. Wenn nicht rein, reinigen Sie das Produkt über Rekristallisation mit Ethanol.
9. Ein NMR-Röhrchen mit einer Pasteurpipette ca. 3 Tropfen des Reaktionsgemisches hinzu und spülen Sie die Pipette mit deuterierte Lösungsmittel.
10. Wiederholen Sie die Schritte 1,2 – 1,8.

3. kurze Interpretation von NMR-Spektrum

1. Das Spektrum mit einem geeigneten Programm (Beispiel MestReNova) zu verarbeiten.
2. Die verschiedenen Gipfeln der NMR Verschiebungen in der Tabelle 1zu korrelieren. Die chemischen Verschiebungen verleiht einen Hauch von welche Art von Umgebung, die die Protonen existiert in.
3. Integrieren Sie die Spitzen um die Anzahl der Wasserstoffatome entspricht jede Spitze zu geben. Integration aller Peaks gibt eine relative Anzahl der gesamten Protonen.
4. Die Aufspaltung der Proton-Gipfel, die die Anzahl der Nachbarn zu bewerten.
5. Messen Sie die J-Kupplung um zu sehen, wie die Protonen miteinander verbunden sind.

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist eine wichtige Methode zur Bestimmung der molekularen Struktur und Reinheit von Proben in der organischen Chemie.

Bei der NMR-Spektroskopie werden Proben einem starken Magnetfeld ausgesetzt. Bei der Exposition gehen bestimmte Kerne zwischen diskreten Energieniveaus über oder schwingen mit. Die Energielücke zwischen diesen Niveaus kann gemessen und in Form von Spektren visualisiert werden. Diese Daten können verwendet werden, um die chemische Struktur der Probe aufzuklären.

Nicht alle Zellkerne haben die erforderlichen Eigenschaften, um NMR-aktiv zu sein. Die häufig untersuchten Isotope sind 1H, 2H, 13C, 19F und 31P.

Dieses Video stellt die Prinzipien der NMR vor, führt beispielhafte Präparationen von NMR-Proben aus verschiedenen Stadien einer chemischen Reaktion durch und diskutiert verschiedene Anwendungen.

Im NMR-Instrument werden flüssiger Stickstoff und Helium verwendet, um einen supraleitenden Magneten zu kühlen. Der Magnet wendet ein konstantes Magnetfeld an eine Probe an. Innerhalb der Probe richten sich Atomkerne mit einer ungeraden Anzahl von Protonen und/oder Neutronen entweder mit dem Feld aus und nehmen einen Zustand mit niedriger Energie oder gegen das Feld aus und nehmen einen Zustand mit hoher Energie an.

Die Energiedifferenz zwischen den beiden Niveaus ist die Resonanzfrequenz, die von der Stärke des angelegten Feldes und der Art des Kerns abhängt. Bei den Magneten, die in der NMR verwendet werden, liegt der Wert im Hochfrequenz- oder HF-Bereich.

Eine HF-Spule regt die Probe mit einem Hochfrequenzimpuls an, wodurch die Kerne mit niedriger Energie in den höheren Zustand versetzt werden, bevor sie wieder zurückkehrt. Die Spule erkennt diese Änderungen in der Magnetisierung, die als Peaks dargestellt werden.

Die Stärke der NMR liegt in ihrer Fähigkeit, Kerne, in diesem Fall Wasserstoff, anhand ihrer chemischen Umgebung zu unterscheiden. Elektronen auf benachbarten Atomen blockieren oder "schirmen" die Kerne vor einem Teil des Magnetfelds ab. Dieses effektive Feld ändert die Resonanzfrequenz für die jeweiligen Kerne, was als chemische Verschiebung bezeichnet wird. In Ethanol haben die Methylen-, Hydroxyl- und Methylprotonen alle einzigartige Resonanzfrequenzen. Die Bestimmung der Fläche unter jedem Peak verdeutlicht die Anzahl der einzelnen Protonentypen.

Da Geräte mit unterschiedlichen magnetischen Stärken die Resonanzfrequenzen verschieben, beziehen sie sich auf ein Standardmolekül, das der Probe zugesetzt wird, oft Tetramethylsilan oder TMS. Die chemische Verschiebung der Frequenzen ist sehr gering und wird oft in Teilen pro Million oder ppm angegeben.

Bei Verwendung eines starken Magneten mit hoher Auflösung werden Peaks manchmal in Subpeaks aufgeteilt. Dies wird durch die benachbarten Kerne verursacht, von denen einige mit dem Magnetfeld ausgerichtet sind, andere gegen; das effektive Feld, das auf die Zellkerne angewendet wird, weiter zu verändern. In Ethanol spalten die 2 Methylenprotonen den Methylpeak zweimal in ein Triplett auf, und die 3 Methylprotonen spalten den Methylenpeak dreimal in ein Quartett. Der Abstand der Spaltung oder J-Kopplung hängt mit dem Abstand der Kerne zusammen, was bei der qualitativen Entdeckung hilft.

Nachdem Sie nun die Grundprinzipien der NMR verstanden haben, sehen wir uns ein Beispielverfahren an, bei dem die Protonen-NMR verwendet wird, um die Synthese von Chalkon aus einem Aldehyd und Keton zu überwachen.

Beginnen Sie damit, mit einer Pasteur-Pipette eine winzige Menge des Ausgangsmaterials in ein Becherglas zu geben. Schieben Sie es in den Abzug und verdünnen Sie das Ausgangsmaterial mit 0,7 ml deuteriertem Lösungsmittel. Es werden deuterierte Lösungsmittel verwendet, da die Resonanzfrequenz von Deuterium außerhalb des Bereichs von Protonen liegt.

Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um 0,7 ml des verdünnten Ausgangsmaterials in ein sauberes 5-mm-NMR-Röhrchen zu geben und den Boden 4,5 bis 5 cm zu füllen. Verschließen Sie das NMR-Röhrchen und beschriften Sie es. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig und achten Sie darauf, dass es nicht mit der Probe in Berührung kommt. Führe dann das Rohr in den Spinner ein.

Reinigen Sie die Außenseite des Röhrchens und des Spinners mit 2-Propanol und Labortüchern. Setzen Sie dann die Probenbaugruppe in den Tiefenmesser ein und kalibrieren Sie die Einstecktiefe.

Laden Sie die Probenanordnung nach der Kalibrierung entweder manuell oder mit einem Autosampler in das NMR-Spektrometer. Verwenden Sie schließlich einen Computerarbeitsplatz, um das NMR-Spektrum zu erfassen.

Erzeugen Sie mit diesem Verfahren NMR-Spektren für jedes Ausgangsmaterial der Reaktion. Für die Synthese von Chalkon sollten Spektren sowohl für Methoxybenzaldehyd als auch für Methylacetophenon erzeugt werden.

Führen Sie als Nächstes die Probensynthese durch, indem Sie die Ausgangsmaterialien und Reagenzien in einem Kolben kombinieren, um die Reaktion zu starten.

Entfernen Sie in Abständen von 30 Minuten ein kleines Aliquot des Reaktionsgemisches mit einer Pasteurpipette und geben Sie 3 Tropfen in ein sauberes NMR-Röhrchen.

Verdünnen Sie dieses rohe Reaktionsprodukt mit deuteriertem Lösungsmittel und bereiten Sie die NMR mit dem zuvor beschriebenen Verfahren vor.

Wenn die Reaktion fortschreitet, bildet sich ein gelber Niederschlag. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, waschen und filtern Sie den Niederschlag und erzeugen Sie NMR-Spektren für das gereinigte Reaktionsprodukt.

Nachdem wir nun NMR-Spektren in jeder Phase der chemischen Reaktion erzeugt haben, wollen wir sie analysieren.

Die Peaks der NMR-Spektren für jedes der Ausgangsmaterialien werden entsprechend ihrer chemischen Verschiebungen und der Anzahl der Protonen, die zu jedem Peak beitragen, verschiedenen Protonengruppen innerhalb des Moleküls zugeordnet. Hier ordnen wir die 4 Hauptprotonengruppen für Methylacetophenon und Methoxybenzaldehyd zu, wobei der Aldehydpeak zwischen 9,5 und 10,5 ppm liegt. Durch den Vergleich der NMR-Spektren der rohen Reaktionsprodukte zu verschiedenen Zeitpunkten wird die Entwicklung der chemischen Reaktion, die Chalkon synthetisiert, aufgeklärt. Zum Beispiel ist der Aldehyd-Peak aus dem Ausgangsstoff Methoxybenzaldehyd nach 30 Minuten der Reaktion noch vorhanden, aber nach 3 Stunden vollständig verschwunden, was den Abschluss der Reaktion bedeutet.

Durch die Untersuchung des Spektrums des gereinigten Produkts können wir jeden Peak einer Protonengruppe in der Chalkonstruktur zuordnen. Wenn wir zum Beispiel die Peaks 3 und 4 untersuchen, sehen wir, dass ihre Integrale beide eins sind, was Gruppen entspricht, die nur ein Proton enthalten.

Die Peaks 3 und 4 sind sogenannte Dubletten, die auf ein benachbartes Proton hinweisen. Beide haben J-Kopplungskonstanten von 16 Hz, was darauf hindeutet, dass sich die Protonen über einer E-Doppelbindung befinden. Durch die Zuordnung aller NMR-Peaks des gereinigten Reaktionsprodukts bestätigen wir die Synthese eines reinen Chalkons.

Die NMR-Spektroskopie hat ein breites Anwendungsspektrum und wird in vielen wissenschaftlichen und medizinischen Bereichen eingesetzt.

In dieser Anwendung wird die Protonen-NMR verwendet, um die Synthese und Struktur von Diamidocarben und Mononoamidocarbin zu verifizieren, deren NMR-Spektren unterschiedliche Peak-Splitting-Muster aufweisen. Diese Carbene erzeugten auch scheinbar unterschiedliche Reaktionsprodukte, wenn sie mit weißem Phosphor kombiniert wurden; DAC1 erzeugte ein hellrotes Reaktionsprodukt, während MAAC2 ein hellorangefarbenes Produkt erzeugte. Diese Unterschiede in den Reaktionsprodukten wurden durch eine zweite Anwendung von NMR, 31P? NMR, die Spektren erzeugt, die auf Unterschieden in der Resonanzfrequenz von Phosphorkernen basieren.

Hier wurde die Kernspintomographie (MRT) verwendet, um eine anatomische Karte des Gehirns zu erstellen und die interessierenden Hirnregionen auszuwählen. Dann wurde die NMR-Spektroskopie verwendet, um Spektren von Schlüsselmetaboliten zu erzeugen. Schließlich wurden mit Hilfe der MRT Veränderungen im Hirnstoffwechsel unter verschiedenen experimentellen Bedingungen evaluiert.

In dieser Anwendung wurde NMR verwendet, um die Bindungseigenschaften zu analysieren und eine 3D-Struktur eines kupferbindenden Peptids vorzuschlagen. Zunächst wurden NMR-Spektren für den ungebundenen und den kupfergebundenen Zustand des Peptids verglichen. Anschließend wurden mit Hilfe fortschrittlicherer 2-dimensionaler NMR-Techniken verschiedene potenzielle Konformationen der Peptidstruktur bewertet. Schließlich wurden diese NMR-abgeleiteten strukturellen Einschränkungen verwendet, um eine vorgeschlagene 3-dimensionale Struktur für das ungebundene Peptid zu entwickeln.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die NMR-Analyse gesehen. Sie sollten nun die zugrunde liegenden Prinzipien hinter der Generierung und Analyse von NMR-Spektren sowie ein Verfahren zur Vorbereitung von NMR-Proben verstehen.

Danke fürs Zuschauen!