Experimentelles Protokoll zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten, die Organochlor-Pestiziden ausgesetzt sind

Es ist ein Messer, das eine Schlüsselfrage beantwortet, die Sie auch in einer Funktion von Feld wie ATP-Niveau und die Sauerstoffverbrauchsraten haben. Die neue oder die eine Seite alt, diese Technik ist, dass es einfach durchzuführen ist und es ist eine Menge für eine spezielle Bewertung der zellulären mitochondrialen Funktion. Um dieses Experiment zu starten, Samen 20 000 HepG2-Zellen in einem Glasboden Petrischale.

Fügen Sie Beta-Hexachlorcyclohexan oder B-HCH im Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 für 24 Stunden hinzu. Bereiten Sie eine millimolar mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde-Lösung vor, indem Sie dem DMEM-Zellkulturmedium wasserfreies DMSO hinzufügen. Dann fügen Sie einen Milliliter pro Schale dieser Lösung zu den Zellen in Glasboden Petri schalen.

Und bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten brüten. Entfernen Sie nach der Inkubation die mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde aus den Zellen. Fügen Sie einen Milliliter pro Gericht frisch zubereitet bei 37 Grad Celsius DMEM Zellkulturmedium.

Um grüne Fluoreszenz in Mitochondrien zu erkennen, beobachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. Um die Konzentrationen von zellulären ATP zu bewerten, Samen bis 20.000 HepG2-Zellen in sechs Brunnenplatten. Fügen Sie Beta-HCH und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.

Fügen Sie den Zellen in jedem Brunnen 200 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Zentrifuge bei 12.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, und fahren Sie mit dem Sammeln überstand, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 100 Mikroliter ATP-Erkennungspuffer auf die Platte.

Fügen Sie 100 Mikroliter gesammelten Zellüberstandes zu einer 96-Well-Platte bei Raumtemperatur hinzu und detektierten das zelluläre ATP durch ein Leuchtkraftmesser, wie im Textprotokoll beschrieben. Zur Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials wachsen HepG2-Zellen in sechs Brunnenplatten mit der Zugabe von Beta-HCH, wie zuvor beschrieben. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie mit 0,5 Millilitern 0,25%EDTA für eine Minute bei 37 Grad Celsius verdauen.

Fügen Sie einen Milliliter DMEM hinzu, um die Verdauung zu stoppen und die verdauten Zellen in 1,5 Milliliter-Röhren zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1000 mal G für drei Minuten, und entsorgen Sie dann den Überstand. Verdünnen Sie das Zellpellet mit 0,5 Milliliterzellkulturmedium und 0,5 Milliliter JC1 mitochondrialem Membranpotentialfarbstoff.

Und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes zentrieren Sie die Rohre bei 600 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius, und waschen Sie dann das Zellpellet nach dem Textprotokoll. Nach dem Zentrieren des gewaschenen Pellets den Überstand entfernen.

Und setzen Sie das Pellet in 0,5 Milliliter JC1 Färbepuffer wieder auf. Analysieren Sie die JC1-Gefärbten Zellen über die Durchflusszytometrie, um grüne und rote Fluoreszenz zu erkennen. Wenn das JC1-Monomer nachgewiesen wird, stellen Sie das Anregungslicht auf 490 Nanometer und das Emissionslicht auf 530 Nanometer ein.

Wenn das JC1-Polymer nachgewiesen wird, stellen Sie das Anregungslicht auf 525 Nanometer und das Emissionslicht auf 590 Nanometer ein. Um die Sauerstoffverbrauchsrate zu analysieren, säen HepG2-Zellen in einer 96-Well-Zell-Kulturplatte in einer Dichte von 4, 500 Zellen pro 100 Mikroliter pro Brunnen. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius, stellen Sie sicher, dass die Zellen in jedem Brunnen mit Medium bedeckt sind.

Laden Sie vor dem Ausführen der OCR-Software die Mikroplatte mit der Patrone und die Zellkulturplatte in einen extrazellulären Flussanalysator, wie im Textprotokoll beschrieben. Öffnen Sie die OCR-Software und wählen Sie im Dropdown-Menü Apps das Mito-Stresstest-Kit für Zellenmito und klicken Sie auf die Schaltfläche App starten. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Stresstest ausführen.

Wenn der Zellstresstest-Bildschirm angezeigt wird, geben Sie die Anzahl der Zellen, die pro Bohrung pro Bohrung im Feld für die Zellensaatnummer aussäen, und die durchschnittliche OCR im Durchschnitt des OCR-Felds der Basalzelle ein. Geben Sie die endgültige Arbeitskonzentration für jedes Reagenz ein und injizieren Sie dann die Reagenzien. Klicken Sie auf die nächste Schaltfläche.

Wenn der Gruppeninfobildschirm angezeigt wird, weisen Sie eine Gruppe nicht zugewiesenen Brunnen zu, indem Sie eine Farbe auswählen und einen Namen geben. Dann klicken Sie auf die entsprechenden Brunnen. Klicken Sie auf die nächste Schaltfläche, und klicken Sie im angezeigten Spannungstest-Injektionslayout auf Start, um den Stresstest auf dem Analysator auszuführen.

Folgen Sie nach dem abgeschlossenen Durchlauf den Anweisungen in der Software, und entfernen und entsorgen Sie dann die Patrone und die Zellplatte. Die durchschnittliche Intensität der mitochondrialen grünen Fluoreszenzfärbung verringerte sich in HepG2-Zellen, die Beta-HCH ausgesetzt waren. Dies zeigt, dass es einen Rückgang der mitochondrialen Zahl und Einen Anstieg der beschädigten Mitochondrien im Einklang mit der Erhöhung der Pestizidkonzentration gibt.

Darüber hinaus verringerten sich die ATP-Spiegel in HepG2-Zellen mit den erhöhten Konzentrationen der Beta-HCH-Exposition, was die verminderte Funktion von Mitochondrien in diesen Zellen zeigte. Nach DER JC1-Färbung für mitochondriales Membranpotential (MMP) zeigte das Durchflusszytometer eine hohe rotgrüne JC1-Fluoreszenz in intakten HepG2-Zellen. Dies war auf das Vorhandensein von roten fluoreszierenden JC1-Aggregaten zurückzuführen, die ein Zeichen für hohe MMP sind.

In Zellen, die mit Beta-HCH behandelt wurden, verringerte sich die rotgrüne JC1-Fluoreszenz aufgrund des Vorhandenseins von grünen fluoreszierenden JC1-Monomeren, ein Zeichen für niedrigemme MMP. Schließlich sank auch die Sauerstoffverbrauchsrate mit den erhöhten Konzentrationen der Beta-HCH-Exposition, was weiter zeigt, dass dieses Pestizid die richtige mitochondriale Funktion beeinträchtigt. Oh, nun, versuchen Sie, dieses Verfahren, es ist wichtig, sich daran zu erinnern, diese Zellen als geeignet zu sehen, um es zu testen.

Nach seiner Entwicklung ebnet dies definitiv einen Weg für Forschungen auf dem Gebiet der grundlegenden Funktion, um relevante Organismen in der damit verbundenen medizinischen Rolle zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Menge oder Qualität, Kapazität, jetzt Mitglied oder Potenzial unter Spoutage Sheet-Funktion erkennen können.