Erstellen eines strukturell realistische Finite-Elemente geometrischen Modells von einer Cardiomyocyte zur Untersuchung der Rolle von zellulären Architektur in Cardiomyocyte Systembiologie
April 18th, 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode um ein räumlich detaillierte finite-Elemente-Modell der intrazellulären Architektur der Herzzellen von Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bilder zu erstellen. Die Kraft dieses räumlich detaillierte Modell zeigt anhand von Fallbeispielen in Kalzium Signal- und Bioenergetik.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein räumlich detailliertes Finite-Elemente-Modell der intrazellulären Architektur einer Herzzelle zu erstellen. Dieses Modell wurde aus Elektronen- und konfokalen Mikroskopiedaten erstellt. Solche Modelle können verwendet werden, um die Rolle der zellulären Architektur für die Funktion von Herzzellen zu untersuchen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie sich Veränderungen in der internen Organisation der Zelle sowie Gesundheits- und Krankheitszustände auf die Biologie der kardiologischen Zellsysteme auswirken können. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie es ermöglicht, komplementäre Informationen aus der Elektronenmikroskopie und der konfokalen Mikroskopie zu integrieren, um ein räumlich detailliertes Modell der zellulären Architektur zu erstellen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Biologie des kardialen Zellsystems geben kann, kann sie mit diesem allgemeinen Gesamtansatz auch auf andere Zellen angewendet werden, bei denen wir die Wirkung der Zellstruktur auf die Funktion der Zelle verstehen müssen.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Simulation und Zuordnung der Ionenkanäle auf das feinere Elementnetz so neu sind. Nach der Präparation von linksventrikulären Freiwandgewebeschnitten und deren Darstellung mittels Elektronentomographie gemäß dem Textprotokoll führen Sie das IMOD-Programm 3dmod aus. Geben Sie in der grafischen Benutzeroberfläche die Adresse der rec- oder mrc-Datei, die den 3D-rekonstruierten Bilddatensatz der Zelle enthält, in das Eingabefeld mit der Bezeichnung Bilddateien ein und drücken Sie dann OK.
Wählen Sie anschließend im Menü Datei die Option Neues Modell aus. Speichern Sie dann über den Menüpunkt Modell speichern unter die Datei unter einem geeigneten Namen. Wählen Sie im Menü Spezial die Option Zeichenwerkzeuge, wählen Sie dann die Option Formen und bewegen Sie die Maus zum Bildfenster.
Es wird eine kreisförmige Kontur angezeigt, die auf dem Mauszeiger zentriert ist. Halten Sie die mittlere Maustaste über einem Mitochondrium gedrückt, bei dem es sich um einen dunkleren Bereich der Bilddateien handelt, und ziehen Sie den Umfang der Kreiskontur in die Form seiner Grenze. Sobald die Konturierung der Mitochondriengrenze abgeschlossen ist, lassen Sie die mittlere Taste los und wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Mitochondrium in den Daten.
Jede Kontur wird vom IMOD automatisch als neue Kontur innerhalb desselben Objekts erkannt. Wählen Sie im Menü Objekt bearbeiten die Option Neu aus, um ein neues Objekt zu erstellen. Dadurch wird die Gesamtzahl der Objekte automatisch um eins erhöht und diese Anzahl dem neuen Objekt zugewiesen.
Verwenden Sie die Option Formen, um Myofibrillenkonturen zu segmentieren und zu speichern. Segmentieren Sie auch die Zellenumgrenzung, und speichern Sie dann im Menü Datei die Modelldatei. Laden Sie nach dem Download von iso2mesh gemäß dem Textprotokoll die Quellcodes und Daten zur Simulation von RyR-Clustern auf dem Mesh von der hier gezeigten GitHub-Website herunter.
Starten Sie die MATLAB-Anwendung Cardiac Cell Mesh Generator. Laden Sie dann mit den drei Drucktasten oben links in der GUI die verschiedenen Organellenkomponentenmasken in MATLAB. Um einen weiteren binären Bildstapel zu erstellen, der Lücken zwischen Myofibrillen und Mitochondrien abgrenzt, öffnen Sie Bild J und laden Sie dann über das Dialogfeld Datei öffnen die TIFF-Stapel der Myofibrillen und Mitochondrien in das Programm.
Initiieren Sie das Plug-In "Image Addition", indem Sie "Prozessrechner Plus" auswählen. Wählen Sie den Myofibrillen-Bildstapel als I1 und den Mitochondrien-Bildstapel als I2 aus, wählen Sie den Hinzufügen-Operator aus und klicken Sie dann auf OK. Nachdem ein neuer Bildstapel angezeigt wird, der das Ergebnis darstellt, wählen Sie "Invertieren bearbeiten" aus, um einen Bildstapel zu erstellen.
Laden Sie die Datei mit dem binären Bildstapel der Lücken zwischen Myofibrillen und Mitochondrien, indem Sie die Schaltfläche RyR Gaps file im Cardiac Cell Mesh Generator-Programm drücken und dann auf Generate Mesh in der GUI drücken. Generieren Sie die notwendigen Eingaben für den RyR-Simulator, indem Sie auf der GUI auf die Schaltfläche Generate RyR-Simulator Inputs klicken. Überprüfen Sie nach dem Ausführen der Funktion, ob die folgenden Dateien in dem Verzeichnis erstellt wurden, das als OUT_DIR Pfad angegeben ist, dem d_axial_micron.
txt-Datei, die den axialen Abstand zwischen der Position der Z-Disc und dem Rest der Pixel im Bildstapel darstellt, die d_radial_micron. txt-Datei, die den euklidischen Abstand darstellt, wobei die axiale Komponente von jedem Pixel in der Menge der möglichen RyR-Cluster-Positionen zu den Pixeln auf der Z-Disc-Ebene ausgeschlossen wird, Die W_micro. txt-Datei, die die Liste der räumlichen Koordinaten aller verfügbaren Positionen für RyR-Cluster darstellt, die vorhanden sein sollen.
Die verbleibenden drei Dateien im Ordner enthalten das Suffix pixel anstelle von micron, um anzuzeigen, dass die Werte in diesen Dateien in Pixelkoordinatenform ausgeschrieben wurden. Um RyR-Cluster-Verteilungen auf dem binären Image-Stack von Myofibrillen zu simulieren, drücken Sie die Schaltfläche Open RyR-Simulator in R, um das R-Programm zu starten. Wählen Sie in der R-GUI die Option Datei öffnen aus, und suchen Sie im RyR-Simulator-Paket nach den Dateieinstellungen.
R.Detaillierte Erläuterungen zu den Parametern in diesem Feld und den Standardwerten finden Sie im Textprotokoll. Benutzer sollten die simulierte Verteilung von RyR-Clustern im R-Fenster untersuchen und die Einstellungen anpassen, um sicherzustellen, dass sich die Cluster in der Nähe der Z-Scheiben befinden und gleichmäßig über den gesamten Querschnitt der Zelle verteilt sind. Um Punkte als räumliche Dichten mit dem Cardiac Cell Mesh Generator auf ein Rechenmodell abzubilden, wählen Sie die Schaltfläche Select RyR Points File (RyR-Punktedatei auswählen) und wählen Sie eine simulierte Textdatei für die RyR-Clusterverteilung aus den vom RyR-Simulator ausgegebenen Textdateien aus.
Führen Sie abschließend auf der GUI in MATLAB den RyR Density Mapper aus. Benutzer sollten visuell überprüfen, ob die Dichtewerte so verteilt sind, dass die Nachbarschaften mit hohen Dichtewerten der Größe von RyR-Clustern in experimentellen Daten ähneln. Diese Hellfeldbilder zeigen, wie Zellen aussehen, wenn sie in Längs-, Schräg- und Querschnittsrichtung in Bezug auf die Schnittebene ausgerichtet sind.
Schräg- und Längsproben weisen Streifen auf, während Querschnittsproben dies nicht tun. Auch die Kapillaren erscheinen in Schnittansichten eher kreisförmig als in Schrägansichten. Dieses Panel stellt einen Tomogramm-Stack von guter Qualität dar, der erfasst werden kann, wenn der Gewebevorbereitungsteil dieses Protokolls befolgt wird.
Sorgfalt und Erfahrung sind notwendig, um sicherzustellen, dass die Gewebeblöcke ausreichend verfärbt sind und eine gleichmäßige Verteilung der kolloidalen Goldpartikel im Gewebevolumen erfolgt. Hier ist ein segmentiertes 3D-Modell von Myofibrillen und Mitochondrien zu sehen. Dieses 3D-Rendering des Tetraedernetzes wird von iso2mesh erstellt.
Solange der ursprüngliche Bildstapel und die Segmentierungsaufgaben von guter Qualität sind, ist dieser Schritt ziemlich robust. Schließlich zeigen diese Panels drei Beispiele für simulierte RyR-Cluster auf derselben Mesh-Topologie nach Verwendung des Algorithmus zur Schätzung der sphärischen Kernintensität. Beachten Sie die Unterschiede in der Organisation der RyR-Cluster.
Sobald es gemeistert und richtig ausgeführt wird, kann es mit unserer Technik innerhalb weniger Stunden ein strukturell realistisches Finite-Elemente-Modell einer Herzzelle erstellt werden. Nach diesem Verfahren, Finite-Elemente-Simulationen des Kalzium-Signalwegs, der kardialen Bioenergetik und der zellulären Mechanik können Fragen zur Rolle der zellulären Architektur auf die Funktion von Kardiomyozyten beantwortet werden.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung eines räumlich detaillierten Finite-Elemente-Modells der intrazellulären Architektur von Kardiomyozyten unter Verwendung von Elektronen- und Konfokalmikroskopie-Bildern. Dieses Modell hilft beim Verständnis der Auswirkungen der zellulären Architektur auf die Funktion der Herzzellen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Kardiovaskuläre Biologie
- Zelluläre Architektur
- Mikroskopie-Techniken
Hintergrund
- Kardiomyozyten spielen eine entscheidende Rolle für die Herzfunktion.
- Das Verständnis der zellulären Architektur ist wesentlich für die Untersuchung der Herzgesundheit und Herzkrankheiten.
- Elektronen- und Konfokalmikroskopie liefern komplementäre Daten für die Modellierung.
- Räumlich detaillierte Modelle können Einblicke in die Kalzium-Signalübertragung und Bioenergetik liefern.
Zweck der Studie
- Erstellung eines Finite-Elemente-Modells der Kardiomyozyten-Architektur.
- Untersuchung, wie Veränderungen in der zellulären Organisation die Herzfunktion beeinflussen.
- Bereitstellung eines Rahmens für die Untersuchung anderer Zelltypen in Bezug auf Struktur-Funktions-Beziehungen.
Verwendete Methoden
- Integration von Elektronenmikroskopie-Daten.
- Nutzung von Konfokalmikroskopie-Bildern.
- Finite-Elemente-Modellierungstechniken.
- Fallstudien zur Kalzium-Signalübertragung und Bioenergetik.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erstellung eines detaillierten Modells der Kardiomyozyten-Architektur.
- Einblicke in die Rolle der zellulären Struktur für die Herzfunktion.
- Demonstrierte Anwendung bei der Untersuchung der Kalzium-Signalübertragung.
- Potenzial für eine breitere Anwendung bei anderen Zelltypen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung der Herzzellbiologie.
- Die Integration von Mikroskopie-Daten erhöht die Genauigkeit des Modells.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Forschungen zur Herzgesundheit und Herzkrankheiten beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to develop spatially resolved finite element models of cardiomyocyte architecture, providing a computational platform to interrogate structure-function relationships in cardiac cells. By integrating high-resolution electron and confocal microscopy data, the method supports mechanistic de-risking in target validation and assay development for cardiovascular therapeutics. The resulting models facilitate predictive simulations of calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, enhancing confidence in early discovery decisions and reducing reliance on empirical screening alone.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how subcellular architecture influences calcium handling and contractile function, supporting target hypothesis testing in cardiomyocyte systems biology.
- Operational Value: Provides a reusable computational framework to evaluate the impact of genetic or pharmacological perturbations on cellular architecture without requiring new wet-lab experiments for each condition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs such as organelle distribution and RyR cluster localization, enabling standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Supports assay standardization by defining structural baselines against which compound-induced remodeling can be measured and quantified.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery-scale imaging with preclinical functional assessment by modeling calcium signaling dynamics linked to cellular ultrastructure.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by simulating how structural remodeling in disease models affects electrophysiological and metabolic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural phenotyping and informing lead identification by providing architecture-informed functional readouts for compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of how changes in mitochondrial positioning, myofibril alignment, or calcium release site distribution affect cardiomyocyte function.
- Screening: Enables generation of quantitative structural metrics (e.g., organelle volume fraction, nearest-neighbor distances) that can serve as imaging-based biomarkers in high-content screening.
- Analytics: Produces spatial density maps and geometric descriptors that allow computational comparison of architectural states across genetic, environmental, or drug-treated conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical studies by linking observed structural changes to simulated functional deficits in calcium handling and energy transfer.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modality-agnostic pipeline for integrating multi-resolution imaging data into mechanistic models applicable across cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in structure-function relationships within cardiomyocytes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of architectural quantification across laboratories and imaging platforms.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling in silico prioritization of targets before committing to costly in vivo validation.
- Portfolio Impact: Supports de-risked advancement decisions by providing mechanistic rationale for selecting compounds that normalize pathological architectural phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron and confocal microscopy image processing, segmentation, and finite element modeling.
- Depends on access to high-resolution 3D imaging data and computational tools such as IMOD, iso2mesh, MATLAB, and R-based simulators.
- Necessitates cross-team standardization of segmentation protocols and file naming conventions to ensure model comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to different cell types or disease models with varying ultrastructural complexity.
- Practical limitations include current exclusion of transverse-tubule and sarcoplasmic reticulum details, which may affect completeness of calcium signaling simulations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:19
Segment Myofibrils and Mitochondria Regions from the EM 3D Image Dataset
3:05
Create a Finite Element Mesh from the Segmented Components
4:36
Mathematically Map the Spatially Varying Density of Ion-channels of Interest onto the Finite Element Mesh
6:51
Results: A Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte
8:13
Conclusion
