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"Chromatographie" bezieht sich auf eine breite Palette von Methoden, die verwendet werden, um eine Komponente aus einem komplexen Gemisch zu isolieren, ein wesentlicher Schritt, bevor die Eigenschaften und Aktivitäten eines Biomoleküls bestimmt werden können. Jede chromatographische Technik hat einen anderen Trennmechanismus, abhängig von der Probenmatrix und der Zielverbindung. Dieses Video konzentriert sich auf die Prinzipien und die Funktionsweise von zwei Methoden, die in der Biochemie üblich sind: die Größenausschluss- und die Affinitätschromatographie.
Die Größenausschlusschromatographie oder SEC basiert auf der Größe der Verbindungen in der Probe. Eine mobile Phase, die die Probe enthält, wird zu einer Säule mit einem porösen Material gegeben: der stationären Phase. Die Moleküle in der Probe fallen in 1 von 3 Kategorien.
Moleküle, die zu groß sind, um in die Poren einzudringen, legen den kürzesten Weg durch die Säule zurück. Jede Spezies, deren Molekulargewicht über dieser "Ausschlussgrenze" liegt, verlässt die Spalte gleichzeitig. Moleküle, die klein genug sind, um ungehindert in die Poren einzudringen, werden am längsten zurückgehalten und verlassen die Säule gemeinsam. Das Molekulargewicht, das einen vollständigen Poreneintritt ermöglicht, ist die "Permeationsgrenze".
Nur Moleküle zwischen diesen Grenzen werden voneinander getrennt, da sie unterschiedlich viel Zeit damit verbringen, in die Poren hinein und aus ihnen heraus zu diffundieren. Kleinere Moleküle bleiben länger auf der Säule, weil sie mehr Zeit in der stationären Phase verbringen, während größere Moleküle innerhalb dieser Grenzen früher austreten.
Molekulargewichte von 1 bis 2 Größenordnungen liegen innerhalb dieser Grenzen. Die Säulen werden unter diesem Gesichtspunkt ausgewählt, oder es können mehrere Säulen in Reihe verwendet werden, wenn es eine große Bandbreite an gewünschten Verbindungen gibt.
Nachdem Sie nun die Theorie der SEC gesehen haben, schauen wir uns an, wie sie durchgeführt wird.
Um das SEC-Verfahren zu starten, muss die Säule mit deionisiertem Wasser und Chromatographiepuffer äquilibriert werden. Nach der Vorbereitung wird der Puffer mit der Probe auf die Säule injiziert. Der Puffer wird dann mit einer niedrigen Durchflussrate durchgeschoben. Ein Detektor überwacht, was aus der Säule austritt, um das Vorhandensein des gewünschten Analyten zu bestimmen. Große Moleküle mit Molekulargewichten oberhalb der Ausschlussgrenze verlassen die Säule gleichzeitig. Kleine Fraktionen aus der Kolonne werden in Röhrchen gesammelt. Jede Fraktion wird durch Gelelektrophorese oder andere Analysetechniken auf die Qualität des Zielmoleküls getestet.
Werfen wir nun einen Blick auf die Affinitätschromatographie oder AC, eine der effizientesten Methoden zur Aufreinigung von Proteinen. Viele Biomoleküle binden selektiv an bestimmte Liganden – eine Eigenschaft, die sich AC zunutze macht, indem es einen zielspezifischen Liganden an die stationäre Phase bindet.
Wenn das Gemisch durch die Säule fließt, binden sich die Zielmoleküle an den Liganden, und der Rest fließt hindurch. Nachdem das Gemisch die Säule durchlaufen hat, kann das Zielmolekül durch eine von zwei Elutionsmethoden basierend auf der Spezifität gesammelt werden.
Man kann sagen, dass die biospezifische Elution eine "normale" oder "umgekehrte Rolle" hat. Bei der biospezifischen Elution in normaler Rolle wird ein Wirkstoff hinzugefügt, der mit dem adhärenten Liganden konkurriert, um an das Zielbiomolekül zu binden.
Bei der biospezifischen Elution mit umgekehrter Rolle konkurriert ein Wirkstoff mit dem Ziel, um an den angehafteten Liganden zu binden. Die zweite Elutionsart, die "unspezifische" Elution, senkt die Bindung zwischen Ziel und Ligand, indem sie den pH-Wert, die Ionenstärke oder die Polarität der Lösung ändert. Wenn ein Protein nicht an einen Liganden bindet, der immobilisiert werden kann, kann das Protein mit einem "Tag" exprimiert werden: kurze Peptidsequenzen, die so konstruiert sind, dass sie an den Liganden binden.
Eine Variante ist die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, kurz "IMAC", bei der ein anhaftender Metallligand, wie Nickel oder Kobalt, an Histidinreste auf dem modifizierten Protein bindet. Durch molekularbiologische Techniken werden Zielproteine mit sich wiederholenden Histidinresten erzeugt, die als Polyhistidin-Tag bezeichnet werden und über die Imidazol-Seitenkette auf Histidin an das Metall binden. Einmal gebunden, kann das Protein mit freiem Imidazol über eine Reverse-Role-spezifische Elution gesammelt und später in einer Vielzahl von Downstream-Anwendungen eingesetzt werden. Nachdem Sie nun die Theorie der Affinitätschromatographie kennengelernt haben, schauen wir uns ein IMAC-Verfahren im Labor an.
Bei IMAC kann die stationäre Phase direkt zu dem Gemisch aus mobiler Phase und Probe hinzugefügt werden, was die Bindung des his-markierten Proteins ermöglicht. Dieser Schlamm wird dann in die Säule gegossen, wo die ungebundenen Verbindungen in den Abfall tropfen, während der Schlamm verbleibt. Der Güllebehälter wird gespült, um Restharz und Probe aufzufangen, die in die Säule gegeben wird.
Das Harz wird gerührt, um sicherzustellen, dass die ungebundenen Komponenten frei fließen. Ein zusätzlicher Waschpuffer hilft, sie wegzuspülen. Sobald alle ungebundenen Bestandteile entfernt wurden, wird der Abfall durch einen Behälter ersetzt, in dem das Zielprotein gesammelt wird.
Imidazolhaltiger Puffer wird zugegeben, gerührt und ruhen gelassen, um das Zielmolekül zu lösen. Das Imidazol bindet an das Metall, ersetzt und gibt das markierte Protein wieder frei. Das freigesetzte Protein wird gesammelt, und der Imidazol-Schritt wird wiederholt, um eine vollständige Sammlung sicherzustellen. Um die Probe weiter zu reinigen, kann SEC vor der Analyse auf die Probe angewendet werden.
Nachdem wir nun die Theorie und das Verfahren dieser beiden Techniken kennengelernt haben, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie sie im biochemischen Bereich angewendet werden.
Ein häufiger Grund für die Reinigung von Proteinen ist die Untersuchung ihrer Rolle bei Krankheiten. Mukoviszidose wird durch Defekte im Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulatorprotein (CFTR) verursacht. Nach der Züchtung des Proteins mit einem His-Tag in Hefe ermöglichen sowohl die Affinitäts- als auch die Größenausschlusschromatographie die Isolierung des Proteins, gefolgt von der Untersuchung seiner Funktion.
In einigen Fällen kann das Vorhandensein eines Polyhistidin-Tags die Struktur eines Proteins verändern und dadurch seine Funktion beeinträchtigen. Eine weitere häufige Markierung ist das Maltose-bindende Protein oder MBP, das in einer Säule an gebundene Amylose bindet. Maltose wird dann verwendet, um den Komplex freizusetzen. Das MBP kann dann gespalten und mit SEC entfernt werden, um das reine gewünschte Protein herzustellen.
Sie haben sich gerade das Video von JoVE über Größenausschluss und Affinitätschromatographie angesehen. Es behandelte die Theorie der Techniken, ging auf allgemeine Verfahren ein und behandelte einige der Anwendungen der Techniken.
Danke fürs Zuschauen!
