Die Dialyse ist eine in der Biochemie gängige Technik zur Trennung von Molekülen auf der Grundlage der Diffusion. Bei diesem Verfahren ermöglicht eine semipermeable Membran die Bewegung bestimmter Moleküle basierend auf der Größe. Diese Methode kann auf die Entfernung von Puffern angewendet werden, die als Entsalzung bezeichnet wird, oder auf den Austausch von Puffermolekülen oder Ionen aus einer Proteinlösung.
In diesem Video werden die Prinzipien der Dialyse sowie ein allgemeines Verfahren erläutert. Mehrere Anwendungen der Dialyse werden untersucht, darunter die Entfernung von Gradientenreagenzien nach der Ultrazentrifugation, die Entfernung von Detergenzien nach einer Membranproteinextraktion und die Rekonstitution von Proteinen durch Veränderung der Lösungsumgebung.
Dialyse ist ein verbreitetes Verfahren zur Trennung von Molekülen basierend auf Diffusion in der Biochemie verwendet. In diesem Verfahren ermöglicht eine halbdurchlässige Membran die Bewegung von bestimmten Molekülen basierend auf Größe. Diese Methode kann zur Entfernung von Puffer, Entsalzung, genannt oder den Austausch von Puffer Moleküle oder Ionen von einer Proteinlösung.
Dieses Video behandelt die Grundsätze der Dialyse nebst einer allgemeinen Verfahren mehrere Anwendungen der Dialyse überprüft werden, einschließlich der Beseitigung von gradient Reagenzien nach Ultrazentrifugation, Waschmittel nach einem Membranprotein entfernen Extraktion und die Wiederherstellung von Proteinen durch Ändern der Lösungsumgebung.
biochemischen Proben haben in der Regel hohe Puffer-Konzentrationen, die Weiterverarbeitung und Analyse stören können. Dialyse ist eine gemeinsame, kostengünstige Technik verwendet, um Moleküle, die basierend auf Diffusion zu trennen. Die Methode nutzt eine semipermeable Membran, die die Bewegung bestimmter Komponenten, basierend auf Größe ermöglicht. Dieses Video zeigt die Konzepte der Dialyse, ein allgemeines Verfahren, und einige seiner Verwendungen in Biochemie.
der wichtigste Aspekt der Dialyse ist eine semipermeable Membran, die Poren, die ein Molekulargewicht Cut-off, so dass Moleküle einer bestimmten Größe passieren zu verhängen. Beispielsweise wird ein 10 k-Membran in der Regel Moleküle größer als 10 Kilodaltons beibehalten. Die Molekulargewicht Cutoff ist jedoch keine diskrete oder genaue Grenze. Die Membran enthält in der Regel eine Vielzahl von Porengrößen, also ein kleiner Bruchteil der Moleküle in der Nähe des Grenzwertes verloren gehen kann.
Da die Molekulargewicht Cutoff über kugelförmige Proteine, lineare Moleküle ähnliche Masse, wie DNA oder RNA, definiert ist kann durch Rutschen. Membranen sind in der Regel gewählt, eine Hälfte auf ein Drittel das Molekulargewicht des gewünschten Moleküls.
, Das Verfahren, eine Probe durchzuführen befindet sich in der Membran, die wiederum ein großes Volumen der Lösung, als das Dialysat hinzugefügt wird. Im Laufe der Zeit werden kleinere Moleküle frei durch die Membran zwischen der Probe und das Dialysat, diffundieren, während die größeren Biomoleküle im Rahmen gehalten werden. Dialyse ist ein langsamer Prozess. Es ist üblich, über Nacht laufen lassen, oder auch über mehrere Tage.
Wenn das Dialysat reines Wasser ist, wird die Gesamtkonzentration Puffer, ein Prozeß bekannt als Entsalzung verringern. Wenn die Lösung andere kleine Partikel enthält, werden einige in der Probe führt zu Buffer Tausch bewegen. Da Dialyse ein Gleichgewicht Prozess ist, kann das Dialysat mehrmals aktualisiert, um kleine Moleküle weiter zu verdrängen. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist wird die Probe wieder gesammelt für die Weiterverarbeitung.
Nun, dass Sie ' Ve gesehen die Grundlagen der Dialyse, lassen Sie ' s werfen Sie einen Blick auf ein allgemeines Verfahren.
vor Beginn des Verfahrens, die Membran ist presoaked im Dialysat. Dies macht es einfacher zu bedienen, und keine Konservierungsmittel entfernt. Einmal fertig, die Probe ist in der Regel mit einer Spritze gesammelt und wird dann an die Dialyse-Container hinzugefügt. Dies kann nackten Schläuche, oder in einer Kassette enthalten. Überschüssige Luft wird entfernt, der Dialyse-Einrichtung, um die Probe zu maximieren ' s Fläche mit der Membran. Die Einrichtung befindet sich dann in das Dialysat unter Rühren um die Verbreitung zu maximieren. Es sollte um nicht rühren hemmen schweben.
Das Dialysat wird geändert in entsprechenden Abständen als Gleichgewicht zwischen Probe und Dialysat erreicht ist. Nach der letzten Änderung bleibt die Reaktion in der Regel über Nacht laufen. Nach einer ausreichenden Zeit wird die Puffer frei oder -ausgetauschte Probe aus der Kassette entfernt. Einmal gesammelt, kann die Probe analysiert oder weiterverarbeitet, abhängig von der Art des Experiments.
nun, dass wir ' Ve sah eine allgemeine Dialyse-Verfahren, lassen Sie ' s sehen Sie einige der Möglichkeiten, die diese Technik wird in der Biochemie verwendet.
-Dichtegradienten sind eine gängige Methode, komplexe biologische Proben zu trennen. Dieses Konzept stützt sich auf die Verteilung auf kleine Partikel, in der Regel Saccharose oder Cäsium Chlorid-Ionen. Nach Abschluss dieser Reagenzien in der Regel müssen entfernt werden, bevor die gesammelten Probe verarbeitet werden kann. Dialyse macht es möglich, die gereinigte Probe für spätere Analysen zu nutzen.
Bestimmter Proteine befinden sich innerhalb einer Zelle ' s Lipid Bilayer und sind in der Regel von ihnen zu kugelförmig Lipid Vesicles bekannt als Liposomen einstreuen untersucht. Die Proteine und Lipide werden zuerst mit einem Reinigungsmittel extrahiert. Dialyse kann verwendet werden, um langsam zu entfernen, das Waschmittel, bilden Proteoliposomes.
Nach der Reinigung, einigen Proteinen misfolded oder denaturiert, was zu einem Verlust an Funktionalität. Die Verbindungen, die dazu führen, diese Änderungen in der Struktur dass mit Dialyse, führt zur Reformation von funktionierenden Analyten entfernt werden können.
Sie ' Ve beobachtete, wie Jupiter ' s-video an der Dialyse. Sie sollten jetzt verstehen diese Diffusion-basierte Methode, ein einfaches experimentelle Verfahren und die Verwendung dieser Technik.
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Die Dialyse ist eine in der Biochemie gängige Technik zur Trennung von Molekülen auf der Grundlage der Diffusion. Bei diesem Verfahren ermöglicht eine semipermeable Membran die Bewegung bestimmter Moleküle basierend auf der Größe. Diese Methode kann auf die Entfernung von Puffern angewendet werden, die als Entsalzung bezeichnet wird, oder auf den Austausch von Puffermolekülen oder Ionen aus einer Proteinlösung.
In diesem Video werden die Prinzipien der Dialyse sowie ein allgemeines Verfahren erläutert. Mehrere Anwendungen der Dialyse werden untersucht, darunter die Entfernung von Gradientenreagenzien nach der Ultrazentrifugation, die Entfernung von Detergenzien nach einer Membranproteinextraktion und die Rekonstitution von Proteinen durch Veränderung der Lösungsumgebung.
Biochemische Proben weisen in der Regel hohe Pufferkonzentrationen auf, die die nachgelagerte Verarbeitung und Analyse stören können. Die Dialyse ist eine gängige, kostengünstige Technik, die zur Trennung von Molekülen auf der Grundlage der Diffusion verwendet wird. Bei dem Verfahren wird eine semipermeable Membran verwendet, die die Bewegung bestimmter Komponenten je nach Größe ermöglicht. Dieses Video zeigt die Konzepte der Dialyse, ein allgemeines Verfahren und einige seiner Anwendungen in der Biochemie.
Der wichtigste Aspekt der Dialyse ist eine semipermeable Membran mit Poren, die eine Molekulargewichtsgrenze festlegen, durch die Moleküle unter einer bestimmten Größe passieren können. Zum Beispiel hält eine 10k-Membran im Allgemeinen Moleküle zurück, die größer als 10 Kilodalton sind. Der Molekulargewichtsgrenzwert ist jedoch keine diskrete oder präzise Grenze. Die Membran enthält typischerweise einen breiten Bereich von Porengrößen, so dass ein kleiner Teil der Moleküle in der Nähe des Cutoffs verloren gehen kann.
Da der Molekulargewichtsgrenzwert anhand von globulären Proteinen definiert wird, können lineare Moleküle ähnlicher Masse, wie DNA oder RNA, durchschlüpfen. Membranen werden typischerweise um die Hälfte bis zu einem Drittel des Molekulargewichts des gewünschten Moleküls ausgewählt.
Um das Verfahren durchzuführen, wird eine Probe in die Membran gegeben, die wiederum zu einem großen Volumen der Lösung, dem Dialysat, hinzugefügt wird. Im Laufe der Zeit diffundieren kleinere Moleküle frei über die Membran zwischen der Probe und dem Dialysat, während die größeren Biomoleküle im Inneren gehalten werden. Die Dialyse ist ein langsamer Prozess. Es ist üblich, es über Nacht oder sogar über mehrere Tage laufen zu lassen.
Wenn es sich bei dem Dialysat um reines Wasser handelt, nimmt die Gesamtpufferkonzentration ab, ein Prozess, der als Entsalzung bezeichnet wird. Wenn die Lösung andere kleine Partikel enthält, gelangen einige in die Probe, was zu einem Pufferaustausch führt. Da es sich bei der Dialyse um einen Gleichgewichtsprozess handelt, kann das Dialysat mehrmals aufgefrischt werden, um kleine Moleküle weiter zu verdrängen. Sobald der Prozess abgeschlossen ist, wird die Probe für die weitere Verarbeitung erneut entnommen.
Nachdem Sie nun die Grundlagen der Dialyse kennengelernt haben, werfen wir einen Blick auf ein allgemeines Verfahren.
Vor Beginn des Eingriffs wird die Membran in Dialysat vorgetränkt. Dies erleichtert die Anwendung und entfernt alle Konservierungsstoffe. Sobald die Probe fertig ist, wird sie entnommen, in der Regel mit einer Spritze, und dann in den Dialysebehälter gegeben. Dabei kann es sich um einen blanken Schlauch oder eine Kassette handeln. Überschüssige Luft wird aus der Dialyseanlage entfernt, um die Oberfläche der Probe mit der Membran zu maximieren. Das Setup wird dann unter Rühren in das Dialysat gegeben, um die Diffusion zu maximieren. Es sollte schwimmen, um das Rühren nicht zu hemmen.
Das Dialysat wird in relevanten Intervallen gewechselt, wenn ein Gleichgewicht zwischen Probe und Dialysat erreicht ist. Nach der letzten Änderung läuft die Reaktion in der Regel über Nacht. Nach einer ausreichenden Zeit wird die pufferfreie oder -ausgetauschte Probe aus der Kassette entnommen. Nach der Entnahme kann die Probe je nach Art des Experiments analysiert oder weiterverarbeitet werden.
Nachdem wir uns nun ein allgemeines Dialyseverfahren angesehen haben, wollen wir uns einige der Möglichkeiten ansehen, wie diese Technik in der Biochemie eingesetzt wird.
Dichtegradienten sind eine gängige Methode, um komplexe biologische Proben zu trennen. Dieses Konzept beruht auf der Verteilung auf kleinen Partikeln, typischerweise Saccharose- oder Cäsiumchlorid-Ionen. Sobald dies abgeschlossen ist, müssen diese Reagenzien in der Regel entfernt werden, bevor die entnommene Probe verarbeitet werden kann. Die Dialyse ermöglicht es, die gereinigte Probe für zukünftige Analysen zu verwenden.
Bestimmte Proteine befinden sich in der Lipiddoppelschicht einer Zelle und werden normalerweise untersucht, indem sie in kugelförmige Lipidvesikel eingestreut werden, die als Liposomen bekannt sind. Die Proteine und Lipide werden zunächst mit einem Detergens extrahiert. Die Dialyse kann verwendet werden, um das Reinigungsmittel langsam zu entfernen und Proteoliposomen zu bilden.
Nach der Reinigung werden einige Proteine falsch gefaltet oder denaturiert, was zu einem Verlust der Funktionalität führt. Die Verbindungen, die diese Strukturveränderungen verursachen, können mit der Dialyse entfernt werden, was zu einer Neubildung der funktionierenden Analyten führt.
Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die Dialyse angesehen. Sie sollten nun diese diffusionsbasierte Methode, ein einfaches experimentelles Verfahren und die Anwendung dieser Technik verstehen.
Danke fürs Zuschauen!
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