Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Bioschicht-Interferometrie- oder BLI-Assays ist es, die potenzielle Wechselwirkung zwischen gereinigtem hEAG1-Ionenkanalprotein und niedermolekularen Lipiden zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ionenkanalpharmakologie zu beantworten, z. B. ob das kleine Molekül von Interesse direkt mit diesem Ionenkanal interagieren kann und wie die Kinetik der Wechselwirkung aussieht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine arbeitsfreie Methode mit hohem Durchsatz handelt.

Es wird nur eine kleine Menge an immobilisiertem Protein benötigt. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da ein erfolgreicher Assay mehrere Schritte umfasst, einschließlich Proteinexpression, Reinigung, Markierung, genau abgestimmter Sensor und Datenanalyse. Nach der Kultivierung von HEK293-T-Zellen, die hEAG1 exprimieren, für zwei bis drei Tage ernten Sie die Zellen, indem Sie das Wachstumsmedium entfernen, und verwenden Sie vier Milliliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.

Verwerfen Sie die PBS. Geben Sie die Zellen in zwei Milliliter PBS pro Schale und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen in die Zellen zu überführen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei der 420-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius.

Dekantieren Sie dann den Überstand und verwenden Sie vier Milliliter Lysepuffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie das Lysat alle 10 Minuten gründlich ein. Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 12.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Füllen Sie dann den Überstand in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen um und bewahren Sie ihn für den sofortigen Gebrauch auf Eis auf. Um das Anti-FLAG M2 Affinitätsharz vorzubereiten, suspendieren Sie das Harz gründlich durch sanfte Inversion, um sicherzustellen, dass die Flasche mit dem Anti-FLAG M2 ffinity Gel eine gleichmäßige Suspension aus Gelkügelchen ist. Sofort 400 Mikroliter Suspension in ein gekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Zentrifugieren Sie dann die Suspension 30 Sekunden lang bei 8.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um den Speicherpuffer auszuwaschen. Um das Harzpellet wieder zu resuspendieren, fügen Sie dem Harz 500 Mikroliter Proteinextraktüberstand hinzu und überführen Sie die Suspension in ein neues, gekühltes Fünf-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie weitere 500 Mikroliter Proteinextrakt in das Originalröhrchen, um alle verbleibenden Kügelchen zu sammeln, und übertragen Sie den Extrakt in das Fünf-Milliliter-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei acht Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius auf einem Shaker, um das FLAG-Fusionsprotein an das Harz zu binden. Dann zentrifugieren Sie die Mischung bei der 1.000-fachen Schwerkraft bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet dreimal mit 500 Mikrolitern eines x PBS.

Bewahren Sie es für den sofortigen Gebrauch auf Eis auf. Geben Sie 10 Mikroliter der dreifachen FLAG-Elutionslösung zu 390 Mikrolitern PBS für eine Endkonzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter. Geben Sie dann 400 Mikroliter der drei x FLAG-Elutionslösung zu den zuvor vorbereiteten Gelkügelchen.

Inkubieren Sie die Probe auf einem Schüttelinkubator bei acht U/min und vier Grad Celsius für zwei Stunden. Zentrifugieren Sie dann das Harz 30 Sekunden lang bei 8000-facher Schwerkraft. Füllen Sie den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen um und lagern Sie ihn für den sofortigen Gebrauch bei vier Grad Celsius.

Verwenden Sie den BCA-Protein-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Konzentration des gereinigten Proteins zu bestimmen. Verwenden Sie dann eine 30-Mikroliter-Probe für die Western-Blot-Analyse mit einem Anti-Flag-Antikörper, um zu bestätigen, dass das Protein von Interesse gereinigt wurde. Um das gereinigte Protein mit Biotin zu markieren, bereiten Sie fünf Milligramm pro Milliliter Biotin-Stammlösung in PBS vor.

Für jeden Test von zwei Biosensoren wird ein dreifacher molarer Überschuss an Biotin zu 20 Mikrogramm gereinigtem Protein hinzugefügt, um eine bevorzugte N-terminale Biotinylierung des gereinigten Proteins in PBS zu erreichen. Inkubieren Sie die Probe mindestens 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Um das ungebundene Biotin und den Puffer zu entfernen, tauschen Sie das Protein in SD-Puffer aus.

Übertragen Sie das Protein in ein Ultrafiltrationsgerät mit einem molekularen Cutoff von 30 Kilodalton. Fügen Sie dann SD-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei der 12.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Ultrafiltrat aus dem Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie 200 Mikroliter SD-Puffer in die Filtervorrichtung und zentrifugieren Sie die Probe erneut. Wiederholen Sie den Vorgang mindestens dreimal. Entnehmen Sie die ausgetauschte Probe des Puffers, indem Sie das Filtrationsgerät umklappen und in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben.

Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei der 2.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius. Bewahren Sie die Probe zur sofortigen Verwendung auf Eis auf. Um den BLI-Assay 30 Minuten vor der Studie durchzuführen, wärmen Sie das Gerät vor, indem Sie das Gerät einschalten.

Überprüfen Sie das Statusfenster des Geräts, um zu bestätigen, dass sich das Gerät im Bereitschaftszustand befindet, bevor Sie beginnen. Vergewissern Sie sich, dass die Klappe des Instruments geschlossen ist, bevor Sie die Datenerfassungssoftware öffnen, und wählen Sie im Experimentassistenten das Neue Kinetik-Experiment aus. Definieren Sie die Wells, die auf der 96-Well-Platte verwendet werden sollen, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, um den Puffer, die Last und die Probe auszuwählen.

Für Probenvertiefungen sollte die Konzentrationseinheit von PIP2 in Form von Molaren eingegeben werden. Um die Assay-Schritte zu definieren, wählen Sie einen Schritt aus und doppelklicken Sie auf die entsprechende Spalte. Für die Kontrollsensoren wird ein Duplikat der Assay-Definition festgelegt.

Stellen Sie die Drehzahl auf 1.000 ein. Wählen Sie eine Minute für den Basisschritt und fünf bis 10 Minuten für das Laden, Zuordnen und Trennen aus. Führen Sie den Test bei Raumtemperatur durch.

Klicken Sie auf die Spalten, die die Sensoren enthalten, und klicken Sie auf Füllen, um die Position der Sensoren im Sensorfach anzugeben. Überprüfen Sie alle geplanten Schritte, um nach Fehlern zu suchen, und gehen Sie zurück, um sie zu korrigieren. Bei der gesamten Durchführung des BLI-Assays kann der Schritt der Überprüfung aller geplanten Schritte vom Forscher vernachlässigt werden.

Es ist jedoch sehr wichtig, zu überprüfen, ob alle geplanten Schritte korrekt sind. Legen Sie den Speicherort der Datendateien fest und klicken Sie auf Los, um den Assay zu starten. Führen Sie den Assay durch und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll.

Wie in diesem Patch-Clamp-Experiment in einer HEK293 T-Zelle, die hEAG1 stabil exprimiert, zu sehen ist, deuten die spannungsabhängigen nach außen gerichteten Kaliumströme darauf hin, dass funktionelle hEAG1-Kanäle in den Zellen stark exprimiert werden. Unter Verwendung des Anti-FLAG-Antikörpers zeigt dieser Western Blot von hEAG1 aus gereinigten Proteinproben die Qualität und Spezifität des gereinigten Proteins an. Das gereinigte Kanalprotein wurde biotinyliert, um einen Interaktionsassay mit dem Lipid PIP2 unter Verwendung des Echtzeit-BLI-Assays durchzuführen.

Hier ist eine typische Bindungskurve zwischen hEAG1 und PIP2 dargestellt, die konzentrationsabhängig an PIP2 gebunden ist. Die akkumulierten Konzentrationen von PIP2 entsprechen den Datenspuren des Biosensors.

Dieser repräsentative Assay zeigt die Veränderungen der optischen Interferenz in verschiedenen Konzentrationen von PIP2. Schließlich wurde aus dem Spitzenwert des optischen Interferenzsignals, der bei verschiedenen PIP2-Konzentrationen gemessen wurde, eine Kurvenanpassung mit der Hill-Gleichung erhalten und die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten zwischen hEAG1 und PIP2 bestimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es sehr wichtig, daran zu denken, alle geplanten Schritte zu überprüfen, um sicherzustellen, dass dieses Verfahren korrekt ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. Patch Clamp durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der Funktion dieses Ionenkanals nach der Bindung des kleinen Moleküls. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Liganden-Screenings von Ionenkanälen, um die neuartigen Liganden in der Ionenkanal-Wirkstoffforschung zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Ionenkanalprotein präpariert und wie man seine Wechselwirkung mit kleinen Molekülen mit der BLI-Methode testet.