Name: Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Bio-Schicht-Interferometrie zur Untersuchung der Wechselwirkungskinetik zwischen dem Ionenkanalprotein hEAG1 und dem Lipidliganden PIP2. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähiges Screening neuer kleiner Moleküle.

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Diese Arbeit wurde von Bio-ID Center und SJTU Cross-Disciplinary Research Fund in Medizin und Technik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217) und National Basic Research Program of China (2014CB910304) unterstützt.

Hinweis: Die HEK-293T-Zell-Linie kontinuierlich auszudrücken Flagge markiert hEAG1 Kanal-Protein wird erstellt, indem die transfecting ein pCDH Lentivirale Plasmid enthält die DNA-Sequenz des hEAG1 mit einer Flagge am distalen C-Terminus in HEK-293T Zellen, gefolgt von der Puromycin-beständige Auswahl beschrieben wie bisher15.
(1) Affinitätsreinigung der Flagge markiert hEAG1 Kanal-Protein von HEK-293T Zellen
<ol><li>Tauen Sie Zellen, die stabil mit dem Ausdruck hEAG1 Kanäle von flüssigem Stickstoff in das warme Wasser (37 ° C) schnell auf. Samen der Zellen (etwa 5 x 106 gefrorene Zellen) in einer 10 cm Petrischale. Wachsen die Zelle über Nacht in Dulbeccos geändert Eagle (DMEM) Medium mit 8 mL 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 4 mM L-Glutamin ergänzt und verändert das Medium am nächsten Tag.</li>
	<li>Überprüfen Sie die GFP Fluoreszenz dieser HEK-293T Zellen mit dem Fluoreszenz-Mikroskop um sicherzustellen, dass der hohe Anteil an Zellen stabil express hEAG1 Kanäle in der Kultivierung System. Trypsinize exponentiell wachsenden Zellen mit 1 mL Trypsin 0,25 % für 1 min bei Raumtemperatur und Thenadd 2 mL Serum-haltigen Kultur Flüssigkeit, die Verdauung zu kündigen. Übertragen Sie 400 μl Zellsuspension auf eine 15 cm Schale mit 15 mL des kompletten DMEM Medium. Bereiten Sie vier 15 cm Gerichte insgesamt.</li>
	<li>
Diese Zellen zu ernten, nach 2 – 3 Tage Kultur, wenn die Zellen bei etwa 90 % erreichen Konfluenz.
	<ol>
<li>Das Wachstumsmedium aus den Zellen zu entfernen und waschen Sie sie zweimal mit 4 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS, pH = 7,4).</li>
		<li>Verwerfen Sie PBS, nach dem Waschen.</li>
		<li>Kratzen Sie die Zellen in 2 mL 1 X PBS für jedes Gericht mit Zelle kratzen und Transfer geschabten Zellen mit 1 mL in einem 15 mL-Tube.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 420 X g bei 4 ° C.</li>
		<li>Dekantieren und den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in insgesamt 4 mL Lyse-Puffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1 % NP-40, pH 7.0 enthalten komplette Protease-Hemmer) für 30 min auf Eis und Vortex gründlich die lysate alle 10 Minuten.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zelle lysate für 10 min bei 12.000 x g bei 4 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand auf eine 5 mL-Tube und halten sie auf dem Eis für den sofortigen Einsatz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie das Anti-FLAG M2 Affinität Harz.
	<ol>
<li>Gründlich aussetzen des Harzes (im Lieferumfang enthalten 50 % Suspension in Speicher-Puffer) durch sanfte Umkehrung um sicherzustellen, dass die Flasche von Anti-FLAG M2 Affinität Gel ist eine homogene Suspension Gel Perlen.</li>
		<li>Sofortüberweisung 400 μl der Aussetzung zu einem gekühlten 1,5 mL-Tube.</li>
		<li>Die Aufhängung für 30 s bei 8, 000 X g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand vorsichtig zum Auswaschen des Speicher-Puffers entsorgen.</li>
		<li>Das Harz 500 μl 1 X PBS hinzu und unterbrechen Sie das Pellet mit 1 mL-Pipette. Zentrifugieren Sie die Suspension für 30 s bei 8, 000 X g bei 4 ° C und entsorgen Sie der Überstand PBS sorgfältig zu. Wiederholen Sie diese Waschschritt gespeicherte Puffer löschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 500 μl Protein Extrakt überstand am Schritt 1.3.8 zum Harz Pellet Pellet auszusetzen und übertragen die Aussetzung zu einem neuen gekühlten 5 mL Schlauch. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut, um sicherzustellen, dass keine Gel Perlen links. Die Mischung der linken Proteinextrakt hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung über Nacht auf einem Boston-Shaker mit 8 u/min bei 4 ° C, die Flagge Schmelzverfahren Protein zu erfassen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mischung nach 12 h Inkubation für 10 min bei 1, 000 X g bei 4 ° C.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und das Pellet dreimal mit 500 μl 1 X PBS waschen. Halten Sie es auf dem Eis für den sofortigen Einsatz.</li>
	<li>
Elution der Flagge hEAG1 Protein mit 3 x Flagge Peptid.
	<ol>
<li>3 X Fahne Elution Lösung ansetzen. 3 X Fahne Peptid in 500 μl Stammlösung auflösen (0,5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5) in einer Konzentration von 8 μg/μL.</li>
		<li>390 μl PBS als 200 ng/μl Endkonzentration Lösung fügen Sie 10 μL 3 x Flagge Elution Lösung hinzu.</li>
		<li>Die Gel-Perlen im Schritt 1,8 vorbereitet fügen Sie 400 μl 3 X Flagge Elution Lösung hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Probe in den Shaker mit 8 u/min für 2 h bei 4 ° c</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Harz für 30 s bei 8, 000 X g.</li>
		<li>Den Überstand auf eine frische 1,5 mL-Tube übertragen und bei 4 ° C für den sofortigen Gebrauch zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Konzentration Assay und Bestätigung der gereinigte Fahne Fusion hEAG1 von BCA Protein Assay Kit und Western Blotting
<ol><li>Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten Proteins mit dem BCA Protein Assay Kit nach Anweisung des Herstellers.</li>
	<li>Verwenden Sie 30 μl Probe zur westlichen Analyse um zu bestätigen, dass das Interesse Protein mithilfe eines Antikörpers Anti-FLAG als zuvor beschriebenen15gereinigt hatte.</li>
</ol>3. Kennzeichnung der gereinigten Kanal-Protein mit Biotin für die BLI-Assay
<ol><li>Bereiten Sie 5 mg/mL Biotin-Stammlösung mit PBS-Puffer. Für jeden Test (zwei Biosensoren) hinzufügen einer 3-fold Molaren Überschuss an Biotin 20 μg gereinigtes Protein, ein bevorzugt N-terminalen Biotinylierungen des gereinigten Proteins in PBS zu erreichen.</li>
	<li>Inkubation der Probe in der Dunkelheit für mindestens 30 min auf Eis.</li>
	<li>Vorbereitung der Proben-Verdünnungspuffer (SD): PBS mit 0,02 % Polysorbat 20 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA, pH 7.4).</li>
	<li>Führen Sie durch Ultrafiltration um den Puffer des gereinigten Kanal Proteins in SD Puffer zu ändern. Entfernen Sie die ungebundene Biotin durch Ultrafiltration Gerät mit Molekulargewicht Cutoff von 30 kDa verwenden, Hinzufügen von der SD-Puffer und Zentrifugieren der Probe bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Die Ultrafiltrate von Zentrifugenröhrchen Ultrafiltration Gerät entfernen 200 μL SD Puffer in das Filter-Gerät hinzufügen und Zentrifugieren der Probe bei 12.000 x g für 10 min bei 4° C. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal.</li>
	<li>Um den Puffer ausgetauscht zu sammeln Beispiel umgekehrt einfügen die Filtereinrichtung eine 1,5 mL-Tube und Zentrifugieren sie 2.000 x g, für 5 min bei 4 ° c Halten Sie die Probe auf dem Eis für den sofortigen Einsatz.</li>
</ol>4. Vorbereitung der PIP2 Lösung für Assay
<ol><li>Bereiten Sie Vorratslösung PIP2 (1 mM) in entionisiertem H2O, indem für 30 min auf Eis als zuvor beschriebenen17beschallen. Speichern Sie die Lösung in Glasfläschchen bei-20 ° C und verdünnen Sie es an die Endkonzentrationen unmittelbar vor Experimenten durch kräftig aufschütteln.</li>
</ol>(5) BLI Assay
<ol><li>Schliessen Sie das Gerät und überprüfen Sie das Fenster "Gerätestatus" um zu bestätigen, dass die Maschine auf "bereit" Zustand, das Gerät mindestens 30 Minuten vor der BLI-Studie prewarm ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Tür des Gerätes geschlossen ist, bevor Sie die Datenerfassung Software öffnen und wählen Sie "Neue Kinetik Experiment" im Eingabeassistenten.</li>
	<li>Definieren Sie die Brunnen durch Rechtsklick auf die 96-Well-Platte verwendet werden, um Puffer, Last und Probe zu wählen. Für Probe-Brunnen, sollte die Einheit der Konzentration der biotinylierte Flagge Fusionsproteins hEAG1 eingegeben werden, als Molar (10 μg, 0,09 μm).</li>
	<li>Definieren der Assay-Schritte einschließlich der Grundlinie, Verladung, Assoziation und Dissoziation. Wählen Sie einen Assay Schritt und klicken Sie doppelt auf die entsprechende Spalte. Ein Duplikat der Assay-Definition ist für Sensoren festgelegt. Die u/min als 1.000 festgelegt. Wählen Sie 1 min für Grundlinie Schritt und 5 – 10 min laden, Assoziation und Dissoziation, beziehungsweise. Führen Sie den Test bei Raumtemperatur (ca. 24 ° C). Hinweis: Es gibt zwei Hauptanwendungen: be-biotinylierte Kanal-Protein an den Sensoren und die Interaktion mit niedermolekularer Verbindungen prüfen. Sie können kontinuierlich fort (Grundlinie, laden, Grundlinie, Assoziation und Dissoziation). Alternativ können sie zur Vermeidung von Verschwendung Testverbindungen, wenn das erste Laden Teil erfolglos getrennt vorgegangen werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Spalten enthalten die Sensoren und klicken Sie auf die "Füllung" um die Positionen der Sensoren in der Sensor-Leiste anzuzeigen.</li>
	<li>Überprüfen Sie alle geplanten Schritte aus, um auf Fehler zu überprüfen und wieder um zu korrigieren.</li>
	<li>Legen Sie den Speicherort der Datendateien und klicken Sie auf "Go", um den Test zu starten. Hinweis: Die Sensoren müssen prewetted für mindestens 10 min in SD Puffer, wenn dieser Schritt getan hat, dann die "Startverzögerung Experiment" Einstellung übersprungen werden sollen. Wenn dies nicht der Fall ist, stellen eine 600 s Verzögerung vor Vorbefeuchten der Sensoren.</li>
	<li>Legen Sie eine schwarze 96-Well-Platte in den Boden der Schale und legen Sie die A1-Ecke der Platte in die Kerbe auf dem Tablett, die Platte zu setzen. Für die Brunnen, die Sensoren zu laden fügen Sie 200 μL der Testpuffer pro Bohrloch in 2 Brunnen in Reihe A und 2 Brunnen in Zeile B der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie einer anderen schwarz 96-Well-Platte als Probenteller vor und füllen Sie die Brunnen mit 200 μL SD Puffer in Reihe B als Kontrolle oder biotinylierte hEAG1 Proteinlösung (10 μg) in Zeile A wie bei der Programmierung im Schritt 5.3 zugewiesen. Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen einzuführen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Tür des Gerätes und setzen Sie die Sensor-Schale und probieren Sie Platte in der linken und rechten Kennzeichenhalter bzw.. Prüfen Sie, ob die Sensorplatte Tablett und Probe liegen korrekt anhand der Form des linken Kennzeichenhalter und der "A1"-Marker auf der oberen rechten Ecke des rechten Kennzeichenhalter. Schließen Sie die Tür und starten Sie den Test zu.</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Die Datenanalyse-Software öffnen und den Ordner mit den Test-Daten zu laden. Klicken Sie auf "Verarbeitung" um in der Verarbeitung-Menü-Oberfläche zu bekommen und wir sehen die bunten rohe kinetischen Kurven.</li>
	<li>Unter Schritt 1: "Die Datenauswahl", klicken Sie auf "Sensor-Auswahl". Auf "Sensor Schacht #1", klicken Sie auf die Sensor-Brunnen, nur mit SD-Puffer benetzt und Rechtsklick auf "Change Sensor Type" auf "Referenz-Sensor". Auf der "Platte Beispielkarte", die alle unspezifischen Bindung Brunnen zu benennen und einen Rechtsklick auf "Gut Typ ändern", "Referenz gut".</li>
	<li>Kreuzen Sie das Kästchen vor "Subtraktion" von Schritt2 und zeigen Sie "Doppelte Referenz".</li>
	<li>In Schritt 3: "Y-Achse ausrichten", "Baseline" als die Achse Schritt auswählen. "Zeitbereich", geben Sie in den letzten 10 s die Baseline (d. h. aus: 0,1 bis: 59,8).</li>
	<li>In Schritt 4: "Inter Schritt Korrektur", wählen Sie "ausrichten an Grundlinie" Signal Verschiebungen zwischen den Schritten Assoziation und Dissoziation zu minimieren.</li>
	<li>In Schritt 5: "Prozess", Savitzky-Golay Filter Funktion in den meisten Fällen auswählen und fortfahren "Prozessdaten".</li>
	<li>Raw-Daten für weitere Datenanalyse mit einer anderen Software in Step 7 zu retten: "Ergebnisse speichern".</li>
	<li>
Klicken Sie auf "Analyse | Kurvenanpassung".
	<ol>
<li>Wählen Sie für "Schritt zu analysieren", "Verein | Dissoziation". Wählen Sie für "Model" 1:1. Hinweis: Wir wählen 1:1-Modell, weil es gut auf unseren ursprünglichen Daten passte und die Möglichkeit, über Fitting unter verhindert 1:2 oder 2:1-Modell aufgrund ihrer hohen Freiheit. Aber andere Optionen stehen hier zur Verfügung und können für andere passende Analyse für verschiedene Bindungsmodelle des Analyten entsprechend gewählt werden.</li>
		<li>Wählen Sie für die "Montage" Global (voll). Wählen Sie für "Group By" "Farbe". Wählen Sie "Rmax unverknüpfte durch Sensor" unabhängige Montage der maximalen Signalantwort (Rmax) zu ermöglichen.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Fit Kurven!" um die nicht-lineare Regressionsanalyse zu starten. In unserer Studie wurden Hill-Gleichung und einzelne exponential-Funktion verwendet.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Daten exportieren | Bericht speichern"um passende Ergebnisse zu speichern. Oder klicken Sie auf "Daten exportieren | Passende Ergebnisse exportieren", die unformatierten Daten für weitere grafische Darstellung und Analyse der Daten mit anderer Software zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Membran-Ionenkanäle sind als die primäre therapeutische Ziele von über 13 % der derzeit bekannten Medikamente zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf- und neurologischen Störungen18überprüft worden. Patch-Clamp-Aufnahme, der goldene Standard zur Messung der funktionellen Ionenkanäle mit kleinen Molekülen, hat wurde am meisten benutzt für Ionen-Kanal Liganden screening. Jedoch können nicht solche elektrophysiologische Ansätze zeigen, ob die kleinen Moleküle bind...

Ausrichtung der Zelle Oberfläche zugänglich Ion Kanalproteinen mit kleinen Molekülen, bietet ein enormes Potenzial für die Liganden Screening und biologische Drug Discovery1,2,3. Somit ist ein geeignetes Instrument für die Untersuchung der Interaktion zwischen Ionenkanal und kleine Moleküle und ihre entsprechende Funktion erforderlich. Die Patch-Clamp-Aufnahme wurde zu einer einzigartigen und unersetzlichen Technik in Ionen-Kanal funktionelle Assay nachgewiesen. Feststellung, ob die kleinen Moleküle direkt Ionenkanäle Ziel erfordern jedoch andere Technologien. Traditionell wurde radioaktives Ligand-Bindung-Assay verwendet, die Kinetik der Bindung zwischen niedermolekularer und seine Zielprotein Ionen-Kanal zu beobachten. Allerdings beschränkt sich die Nutzung dieser Technik wegen seiner Anforderung in radioaktiven Markierung und Erkennung. Darüber hinaus verhindert, dass der erforderliche Schritt, den kleinen Liganden in der Studie zu kennzeichnen seine Verwendung in vielen Arten von Ionenkanälen ohne bekannte spezifische Liganden. Einige markierungsfreie Techniken wie NMR-Spektroskopie, x-ray Diffraction, Microscale Thermophorese (MST)4 und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden verwendet, um die Protein-kleine Molekül-Interaktionen zu messen. Aber diese Art von Tests in der Regel können nicht wegen der Schwierigkeit, in voller Länge Protein, niedrige Auflösung von Dynamik, niedriger Durchsatz und hohe Kosten5zu erhalten ausreichenden Informationen zur Verfügung stellen. Im Gegensatz zu diesen Techniken taucht Bio-Schicht Interferometrie (BLI) als eine neuartige markierungsfreie Methodik zur Überwindung dieser Nachteile zum Nachweis von Protein-kleine Molekül Interaktionen durch eine winzige Mengen des Proteins Probe auf den Oberflächen der Immobilisierung Biosensor und Messung der optischen Veränderung signalisiert6,7. Als eine vielversprechende Biosensor-Plattform BLI Technik wird bereits durchgeführt, um die Interaktion von kleinen Molekülen mit natürlichem Wasser lösliche Proteine wie ein menschlicher monoklonaler Antikörper CR80208 beobachten und die detaillierte Testverfahren ist berichtet worden, einem vorherige Artikel9. Obwohl die Schlüsselrolle der Ionen-Kanal-Protein für neue therapeutische Targets Entdeckung erkannt wurde, wurde die Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül Interaktion Assay anhand BLI nicht beschrieben.
Der Mensch Äther À Gogo- Kanäle (hEAG1) werden in verschiedene Arten von Krebszellen und zentrale Nervensystem, wodurch der Kanal A möglichen therapeutischen Angriffspunkt vieler Krebsarten und neuronalen Erkrankungen10,11, ausgedrückt 12,13,14. Die elektrophysiologische Untersuchung in unserem Labor hat die inhibitorische Wirkung von Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP2) am hEAG1-Kanal15bestätigt. Anhand unserer Ergebnisse, PIP2 Tests, direkt als Modell für andere Arten von Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül zusammengesetzte Interaktion vor allem für diese Kanäle fehlen spezifische Liganden Interaktion mit den hEAG1 mit BLI Technik sein kann. Entsprechend den Anweisungen des BLI Assays, wir vorbereitet biotinylierte hEAG1 Proteine und immobilisiert ihnen auf der Oberfläche des Streptavidin (SA) Biosensor Tipps gefolgt von Interaktion sie PIP2 Lösungen zu beobachten, deren direkte Bindung zwischen den Protein und die Lipid. Nach die Befestigung des PIP2 an die hEAG1 Protein beschichtete Oberfläche, die Dicke der Schicht auf der Oberfläche erhöht, die direkt korreliert die spektrale Verschiebung und können in Echtzeit-16gemessen werden. Die verbindliche Kinetik kann durch eine positive Wende im Verein Schritt und eine negative Verschiebung der Dissoziation Schritt ermittelt werden. Nach diesem Prinzip wir gereinigt die funktionale hEAG1 Ionen-Kanal-Protein von HEK-239T stabile Expressionssystem mit Affinität Reinigung Methode, die in-vitro- funktionellen Zustand beizubehalten, dann gemessen die Kinetik der Bindung von unterschiedlicher Konzentration2PIP und ergab eine semblable kinetischen Daten wie Elektrophysiologische Messungen15beobachtet. Die enge Korrespondenz zwischen den Ergebnissen aus den BLI und Elektrophysiologische Messungen zeigen zum ersten Mal die Eignung von BLI als geeignete analytisches Werkzeug für Ionen-Kanal Membran-Protein-kleine Molekül Interaktion.

<table><tbody><tr><td>DMEM/High Glucose Medium</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>1697550</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Ersatz</td><td>Amresco</td><td>E109</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610440</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600332</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG Peptid</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssoftware</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Version 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Datenanalyse-Software</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Version 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor/Streptavidin</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalmaschine</td><td>ThermoFisher</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter</td><td>ThermoScientific</td><td>318120</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltrationsgerät</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC503008</td><td>NMWL von 30 kDa</td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2)</td><td>Sigma</td><td>P9763</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler ANTI-FLAG M2 Antikörper</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>1:2000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus HRP-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td> 1<td>:5000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten</td><td>Roche</td><td>04693159001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600 Bildgebungssystem</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western-Blot-System</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erfassung der interaktion kinetics eines ionenkanals proteins mit kleinen molekülen durch die bio-schicht interferometrie assay

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Die Bio-Layer-Interferometrie (BLI)-Assay ist ein wertvolles Instrument zur Messung von Protein-Protein und Protein-kleine Molekül Interaktionen. Hier beschreiben wir zunächst die Anwendung dieser neuartigen markierungsfreie Technik auf der Wechselwirkung des menschlichen EAG1 Kanalproteine (hEAG1) mit dem kleinen Molekül-PIP-2. hEAG1 Kanal ist wegen seiner abweichenden Überexpression in Krebs und ein paar Gain-of-Function-Mutationen in einigen Arten von neurologischen Erkrankungen beteiligt als mögliche therapeutische Ziel anerkannt. Wir hEAG1 Kanal-Proteine von einem Säugetier stabile Expressionssystem gereinigt und die Interaktion mit PIP2 von BLI gemessen. Die erfolgreiche Messung der Kinetik der Bindung zwischen hEAG1 Protein und PIP2 zeigt, dass die BLI-Assay eine potenzielle Hochdurchsatz-Ansatz für neuartige Small-Molecule-Liganden Screening in der Ionen-Kanal Pharmakologie ist.

Wir reinigen das FLAG hEAG1 Kanal Fusionsproteins von HEK-293T Zellen stabil überexprimieren hEAG1. Die Funktion dieses Schmelzverfahren Protein nachgewiesen mithilfe der Patch-Clamp-Methode und die Qualität und Besonderheit des gereinigten Protein von Western-Blot (Abbildung 1) bestätigt werden. Die gereinigten Kanal-Protein ist biotinylierte einen Interaktion Assay mit Lipiden (PIP2) ausführen mithilfe von Echtzeit-BLI-Assay. Die Bindungskonfigur...

Hier das Protokoll beschreibt die Wechselwirkungen von gereinigten hEAG1 Ionen-Kanal-Protein mit niedermolekularer Lipid Liganden Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Die Messung zeigt, dass BLI eine mögliche Methode für neue kleine Molekül-Ion Channel Liganden Screening werden könnte.

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Das übergeordnete Ziel dieses Bioschicht-Interferometrie- oder BLI-Assays ist es, die potenzielle Wechselwirkung zwischen gereinigtem hEAG1-Ionenkanalprotein und niedermolekularen Lipiden zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ionenkanalpharmakologie zu beantworten, z. B. ob das kleine Molekül von Interesse direkt mit diesem Ionenkanal interagieren kann und wie die Kinetik der Wechselwirkung aussieht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine arbeitsfreie Methode mit hohem Durchsatz handelt.Es wird nur eine kleine Menge an immobilisiertem Protein benötigt. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da ein erfolgreicher Assay mehrere Schritte umfasst, einschließlich Proteinexpression, Reinigung, Markierung, genau abgestimmter Sensor und Datenanalyse. Nach der Kultivierung von HEK293-T-Zellen, die hEAG1 exprimieren, für zwei bis drei Tage ernten Sie die Zellen, indem Sie das Wachstumsmedium entfernen, und verwenden Sie vier Milliliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.Verwerfen Sie die PBS. Geben Sie die Zellen in zwei Milliliter PBS pro Schale und verwende

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In diesem Video demonstrieren wir die Biolayer-Interferometrie (BLI)-Technologie, um die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Liganden und Zielanalyten in Echtzeit zu detektieren. BLI misst Veränderungen im Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierter Liganden auf einer Biosensoroberfläche reflektiert wird, wenn sie mit Analyten in Lösung interagieren.

Biolayer-Interferometrie-Technologie zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Ligand und Analyt

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren (TFs) mit der RNA-Polymerase werden in der Regel mit Pulldown-Assays untersucht. Wir wenden eine Biolayer Interferometry (BLI) Technologie an, um die Wechselwirkung von GrgA mit der Chlamydien-RNA-Polymerase zu charakterisieren. Im Vergleich zu Pulldown-Assays erkennt BLI Echtzeit-Assoziation und Dissoziation, bietet eine höhere Empfindlichkeit und ist sehr quantitativ.

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Wir beschreiben die detaillierte Verfahren und Strategien zur Messung der mechanischen Eigenschaften und mechanische entfaltenden Wege der einzelnen Protein-Moleküle mit einem Rasterkraftmikroskop. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse als Referenz für die Auswahl und Begründung der gute einzelne Protein-Molekül-Aufnahmen.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Erfahren Sie die Bio-Schicht-Interferometrie zur Untersuchung der Wechselwirkungskinetik zwischen dem Ionenkanalprotein hEAG1 und dem Lipidliganden PIP2. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähiges Screening neuer kleiner Moleküle.

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

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