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Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist ein gängiger Ansatz zur Isolierung und Aufreinigung von Zellstrukturen für biochemische Experimente. Bei der Technik wird eine Hochgeschwindigkeits- oder Ultrazentrifuge verwendet, um zelluläre Komponenten in einem Dichtegradienten zerstörungsfrei zu trennen. Dieses Video beschreibt die Prinzipien der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, bietet ein allgemeines Verfahren mit einem Saccharosegradienten und diskutiert einige Anwendungen.
Beginnen wir mit der Untersuchung der Prinzipien von Ultrazentrifugen und Dichtegradienten. Eine Suspension enthält Partikel in einem flüssigen Lösungsmittel. Aufgrund der Schwerkraft sedimentieren Partikel, die dichter als das Lösungsmittel sind, nach außen, während Partikel, die weniger dicht als das Lösungsmittel sind, schwimmen. Je größer der Dichteunterschied zwischen dem Partikel und dem Lösungsmittel ist, desto schneller erfolgt die Trennung.
Eine Ultrazentrifuge enthält eine Einheit, die als Rotor bezeichnet wird und sich mit stark kontrollierten Drehzahlen dreht und ein starkes Gravitationsfeld simuliert. In diesem Bereich werden die Dichteunterschiede zwischen Partikeln und dem Lösungsmittel vergrößert.
Die Stärke des Feldes hängt von der Drehzahl ab. Selbst ein kleiner Rotor mit einer relativ niedrigen Drehzahl kann eine Kraft erzeugen, die tausendmal stärker ist als das Schwerefeld der Erde.
Wenn ein Röhrchen mehrere Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte enthält, werden sie durch Zentrifugation in getrennten Schichten in der Reihenfolge ihrer Dichte gehalten, wobei die dichteste Flüssigkeit der Basis am nächsten ist. Eine solche Schichtung mehrerer Flüssigkeiten wird als "Dichtegradient" bezeichnet. Es gibt zwei Arten. In Stufengradienten werden Flüssigkeiten mit abnehmender Dichte sorgfältig übereinander geschichtet. In kontinuierlichen Gradienten werden die Flüssigkeiten in unterschiedlichen Anteilen gemischt, so dass die Dichte von der Basis nach oben gleichmäßig abnimmt.
Zelluläre Organellen können mit Hilfe eines Stufengradienten durch "isopyknische Dichtegradientenzentrifugation" getrennt werden. Dies ist das einfachste und gebräuchlichste Zentrifugationsverfahren.
Dieses Verfahren wird verwendet, um die zellulären Strukturen zu trennen. Je dichter das Organell ist, desto weiter sinkt es ab - mit Mitochondrien an der Spitze und Nukleinsäuren an der Unterseite.
Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter der Technik kennen, sehen wir sie uns im Labor an.
Bevor das Verfahren gestartet wird, sollten die Drehzahl- und Dichtewerte des Herstellers notiert und die Ultrazentrifuge auf Korrosion überprüft werden. Bei diesem Verfahren kommt ein Ausschwingrotor zum Einsatz.
Zunächst wird das Zellmaterial durch Homogenisierung der Zellen präpariert, wodurch ihre Organellen zerstörungsfrei freigesetzt werden. Das Homogenat kann durch vorherige Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit fraktioniert werden, um Komponenten mit geringer Dichte zu entfernen. Als nächstes werden die Saccharoselösungen hergestellt.
Saccharose wird in zunehmenden Mengen zugegeben, so dass jede Lösung konzentrierter und daher dichter ist als die vorhergehende. Die genaue Dichte der Lösungen hängt von den zu trennenden Komponenten ab, die von Organismus zu Organismus variieren. Die Lösungen sollten Dichten zwischen denen der zu trennenden Komponenten aufweisen, wobei die letzte Lösung dichter ist als die dichteste Komponente des Analyten. Techniken zur Trennung von Komponenten, die dichter als Saccharose sind, wie z. B. Nukleinsäuren, werden in den Anwendungen beschrieben.
Der Saccharosegradient wird nun in einem sauberen Zentrifugenröhrchen erzeugt. Mit einer Pipette wird die am stärksten konzentrierte Saccharoselösung hergestellt. Wenn das Röhrchen aufrecht gehalten wird, wird die Pipettenspitze hoch an der Wand platziert und die Flüssigkeit gleichmäßig nach unten abgegeben. Wichtig ist, dass der Arbeitsbereich frei von Vibrationen und anderen Störungen gehalten wird.
Nach dem Austausch der Spitze werden die restlichen Lösungen in der Reihenfolge abnehmender Dichte hinzugefügt. Sie werden vorsichtig dosiert, um unterschiedliche Schichten zu bilden und eine Vermischung zu vermeiden. Schließlich wird etwa ein halber Milliliter der zellulären Probe auf den Gradienten gegeben und das Röhrchen gewogen. Dies wird verwendet, um die Gewichtsverteilung auszugleichen, den nächsten Schritt des Prozesses.
Die Zentrifugation sollte so bald wie möglich beginnen. Das Rohr wird in den Rotor eingesetzt, der dann ausbalanciert wird, indem Rohlinge gleichen Gewichts in gegenüberliegende Schlitze gelegt werden. Der Rotor wird in die Ultrazentrifuge eingesetzt und das System abgedichtet. Die Temperatur und die Drehzahl sowie die Zeit werden eingestellt. Typische Werte sind 4 ? C mit einer Kraft von über 100.000 x g für 16 h.
Nach dem Zentrifugieren wird das Röhrchen aus dem Rotor gezogen, wobei darauf geachtet wird, dass es aufrecht und ungestört bleibt. Die verschiedenen zellulären Komponenten sind zwischen den Lösungsschichten in diskrete Banden fraktioniert. Die Fraktionen können mit einer Spritze aufgefangen werden. Alternativ kann der Boden des Röhrchens mit einer feinen, sterilisierten Nadel durchstochen und der Abfluss in sterilen Röhrchen aufgefangen werden. Die zellulären Bestandteile wurden nun isoliert. Sie können bei -80 °C gelagert werden.
Nachdem wir nun das grundlegende Verfahren gesehen haben, schauen wir uns einige Anwendungen an.
Eine typische Anwendung ist die Isolierung von Multiproteinkomplexen in Pflanzenzellen. In diesem Beispiel werden Komplexe, die für den zyklischen Elektronenfluss verantwortlich sind, aus dem Thylakoid, dem Ort der Lichtreaktion bei der Photosynthese, isoliert. Bei diesem Verfahren werden diskrete Lösungen von 14 bis 45 % Saccharose verwendet. Die Zentrifugation erfolgt über 100.000 x g für 14 h bei 4 °C.
Da Nukleinsäuren dichter als Saccharose sind, können sie durch isopyknische Zentrifugation nicht zerstörungsfrei von Organellen getrennt werden.
Eine andere Technik, die als "ratenzonale Zentrifugation" bekannt ist, wird verwendet. Es trennt Organellen anhand ihrer Sedimentationsgeschwindigkeiten, die nicht nur von ihrer Dichte, sondern auch von ihrer Konformation abhängen. Ein kontinuierlicher Gradient wird verwendet, um die Komponenten basierend auf dieser Eigenschaft zu trennen.
Die Verfahrensschritte sind ähnlich wie bei isopyknischen Fällen. In diesem Beispiel werden RNA-Ribosomenkomplexe mit einem kontinuierlichen Gradienten von 5 % bis 20 % isoliert und bei 230.000 x g zentrifugiert. Die Zentrifugation wird nach einigen Stunden unterbrochen, um eine Mitfällung zu verhindern.
Nukleinsäurestränge können anhand der Dichte voneinander getrennt werden.
Dies liegt daran, dass Stränge, die reich an Guanin und Cytosin sind, dichter sind als solche, die reich an Adenin und Thiamin sind. In diesem Fall kann der Gradient nicht aus Saccharose bestehen, da Saccharose weniger dicht ist als Nukleinsäuren. Stattdessen werden Cäsiumchlorid-Gradienten, typischerweise von 1,65 bis 1,75 g/ml, verwendet, da sie eine ausreichende Dichte und eine niedrige Viskosität aufweisen.
Hier sehen wir, wie die Plankton-DNA mit Hilfe eines kontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten aufgereinigt wird. Die Zentrifugation erfolgt bei über 1.000.000 x g für 18 h unter Vakuum.
Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die Ultrazentrifugation mit einem Saccharose-Dichtegradienten angesehen. Sie sollten nun verstehen, wie ein Dichtegradient funktioniert, wie man einen Stufengradienten konstruiert und wie man eine Ultrazentrifuge lädt und bedient. Danke fürs Zuschauen!
