Question 1

Wie erzeugt eine Ultrazentrifuge ein stärkeres Gravitationsfeld als die Erdanziehungskraft der Erde?

Accepted Answer

Eine Ultrazentrifuge enthält einen Rotor, der mit hochkontrollierten Geschwindigkeiten rotiert und ein starkes Gravitationsfeld simuliert. Selbst ein kleiner Rotor bei relativ niedriger Rotationsgeschwindigkeit kann eine Tausendmal stärkere Kraft erzeugen als das Gravitationsfeld der Erde. Dieses verstärkte Feld erhöht die Dichteunterschiede zwischen Partikeln und Lösungsmittel und beschleunigt die Trennung.

Question 2

Was ist der Unterschied zwischen Stufengradienten und kontinuierlichen Gradienten?

Accepted Answer

Bei Stufengradienten werden Flüssigkeiten mit abnehmender Dichte sorgfältig übereinander geschichtet und schaffen so deutliche Grenzen. Bei kontinuierlichen Gradienten werden Flüssigkeiten in unterschiedlichen Anteilen gemischt, sodass die Dichte vom Boden nach oben hin gleichmäßig abnimmt. Beide Typen halten Flüssigkeiten in separaten Schichten, die nach Dichte geordnet sind, während der Zentrifugation.

Question 3

Warum ist isopycnische Dichtegradienten-Zentrifugation das gängigste Trennverfahren?

Accepted Answer

Isopyknische Dichtegradientenzentrifugation ist das einfachste und häufigste Verfahren zur Trennung von Zellorganellen unter Verwendung eines Stufengradienten. Organellen sedimentieren basierend auf ihrer Dichte, wobei dichtere Strukturen weiter absinken. Dieser unkomplizierte Ansatz isoliert effektiv Mitochondrien, Zellkerne und andere zelluläre Strukturen ohne zerstörerische Kraft.

Question 4

Wie sollten Saccharose-Lösungen zur Erstellung eines Dichtegradienten vorbereitet werden?

Accepted Answer

Saccharose wird in zunehmenden Mengen hinzugefügt, sodass jede Lösung konzentrierter und dichter ist als die vorherige. Die Lösungsdichten müssen zwischen den zu trennenden Komponenten liegen, wobei die endgültige Lösung dichter ist als die dichteste Komponente. Die genauen Dichten hängen von den spezifischen Organellen oder Molekülen ab, die vom Organismus isoliert werden.

Question 5

Warum wird die ratenzonale Zentrifugation anstelle der isopycnischen Zentrifugation für Nukleinsäuren verwendet?

Accepted Answer

Da Nukleinsäuren dichter sind als Saccharose, kann isopycnische Zentrifugation sie nicht zerstörungsfrei von Organellen trennen. Die Raten-Zonal-Zentrifugation verwendet ein kontinuierliches Gradient und trennt Komponenten basierend auf Sedimentationsraten, die sowohl von der Dichte als auch von der Konformation abhängen. Diese Technik bewahrt die Integrität der Nukleinsäuren bei gleichzeitiger Trennung.

Question 6

Welches Gradientenmedium wird verwendet, um Nukleinsäurestränge nach Dichte zu trennen?

Accepted Answer

Cesiumchlorid-Gradienten, die typischerweise zwischen 1,65 und 1,75 g/mL liegen, werden zur Trennung von Nukleinsäuresträngen verwendet. Saccharose kann nicht verwendet werden, da sie weniger dicht als Nukleinsäuren ist. Cesiumchlorid bietet ausreichende Dichte und niedrige Viskosität, was die Trennung von DNA-Strängen basierend auf dem Guanin-Cytosin- versus Adenin-Thymin-Gehalt ermöglicht.

Question 7

Wie werden fraktionierte zelluläre Komponenten nach der Ultrazentrifugation gesammelt?

Accepted Answer

Nach der Zentrifugation bilden zelluläre Komponenten diskrete Bänder zwischen den Lösungsschichten. Fraktionen können mit einer Spritze gesammelt werden oder indem der Rohrboden mit einer sterilisierten Nadel punktiert und der Abfluss in sterilen Röhrchen gesammelt wird. Die isolierten Komponenten können dann bei -80 Grad Celsius für weitere Analysen oder Experimente unter Verwendung von Chromatographiebasierte Biomolekül-Reinigungsmethoden gelagert werden.

Dichte Gradienten Ultrazentrifugation

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