4.8: Metabolische Kennzeichnung

Die metabolische Markierung wird verwendet, um die Maschinerie einer Zelle zu untersuchen. Dies wird mit chemischen Analoga erreicht, um die auftretenden biochemischen Umwandlungen und Modifikationen zu untersuchen. Dieses Video zeigt die Prinzipien der metabolischen Markierung, typische isotopische und photoreaktive Markierungsverfahren und einige Anwendungen.

Die metabolische Markierung kann mit einer Reihe von Strategien durchgeführt werden. Hier werden wir die isotopische, photoreaktive und bioorthogonale Markierung beschreiben.

Die Isotopenmarkierung wird unter Verwendung von strukturellen Analoga durchgeführt, die chemisch identisch mit ihren natürlichen Gegenstücken sind, aber ungewöhnliche Isotope in ihre Struktur integriert haben. In diesem L-Lysin-Analogon werden die Kohlenstoff- und Stickstoffatome durch Kohlenstoff-13 und Stickstoff-15 ersetzt. Zellen, die in Gegenwart von Isotopenanaloga kultiviert werden, bauen diese in ihre biochemischen Strukturen ein. Metaboliten werden aus den Zellen entnommen und für die Analyse gereinigt. Proben mit stabilen Isotopen werden mit Techniken wie Massenspektrometrie oder NMR-Spektroskopie analysiert. Proben mit radioaktiven Markierungen werden mittels Flüssigszintillationszählung und Röntgenfilmen analysiert, was im Isotopenmarkierungsprotokoll demonstriert wird.

Photoreaktive Markierungen sind funktionelle Gruppen, die in Proteine eingebaut sind und stabil sind, bis sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden. Die funktionelle Gruppe bildet ein reaktives Radikal, das an das nächstgelegene Protein bindet. Ein gängiges Beispiel, L-Photo-Leucin, enthält einen Diazirinring, der ein photoreaktiver Vernetzer ist. Im Gegensatz zur Isotopenmarkierung gibt es eine gewisse chemische Unähnlichkeit zwischen photoreaktiven chemischen Analoga und ihren natürlichen Gegenstücken. Zellen können natürliche Verbindungen gegenüber Analoga bevorzugen. Daher ist es wichtig, die photoreaktive Markierung in einem Medium durchzuführen, das frei von der zu imitierenden Verbindung ist. Sobald sie ultravioletter Strahlung ausgesetzt sind, werden die photoreaktiven Gruppen in einem markierten Protein instabil und hochreaktiv, wodurch es sich mit interagierenden Proteinen vernetzt und ein Proteinkomplex entsteht. Vernetzte Komplexe fungieren als Momentaufnahmen, die dann mit SDS-PAGE und massenspektrometrischen Methoden analysiert werden können. Dies gibt Aufschluss darüber, welche Reaktionen im Stoffwechselweg ablaufen, indem Reaktionsarten identifiziert werden und wie sie interagieren, indem Bindungsstellen bestimmt werden.

Bioorthogonale Markierungsstrategien verwenden Analoga mit kleinen funktionellen Gruppen, die wenig bis gar keine Reaktivität mit natürlichen Biomolekülen aufweisen. Zum Beispiel sind Azide kleine funktionelle Gruppen, deren Reaktivität als orthogonal zu biochemischen Reaktionen bezeichnet wird. Bei der Staudinger-Ligatur greift eine Phosphingruppe die Azidogruppe an. Dadurch entsteht ein Übergangszustand, der intramolekular mit einem nahegelegenen Ester reagiert, was zu einem amingebundenen Liganden führt. Bioorthogonale funktionelle Gruppen, die in Biomoleküle eingebaut sind, können mit Nachweis-Tags wie fluoreszierenden funktionellen Gruppen und Affinitäts-Tags wie Antigenen ligiert werden.

Nachdem nun einige Konzepte und Strategien für die metabolische Markierung diskutiert wurden, schauen wir uns den Prozess im Labor an.

Der erste Schritt in einem metabolischen Markierungsexperiment besteht darin, das interessierende Protein zu sammeln. Dazu werden Zellen auf einer Platte gezüchtet und eine Expressionsmethode verwendet, um die Synthese des gewünschten Proteins zu fördern. In diesem Beispiel werden leucinreiche Repeatkinasen (LRRK) exprimiert. Als Analogon wird Dinatriumphosphat verwendet, das radioaktiven Phosphor-32 enthält. Zum Schutz vor ionisierender Strahlung müssen geeignete Maßnahmen getroffen werden. Dazu gehören die Einrichtung eines Arbeitsbereichs, das Tragen geeigneter Schutzausrüstung und die Überprüfung auf radioaktive Kontamination. Sobald Sicherheitsmaßnahmen getroffen wurden, wird das Medium, das die Isotopenanaloga enthält, vorbereitet. Das Medium aus der Kultur wird entfernt und durch ein Medium ersetzt, das die isotopischen chemischen Analoga enthält, und dann inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen lysiert. Das Lysat wird aufgefangen und gereinigt.

Nach der Aufreinigung werden die Proteine mit SDS-PAGE aufgelöst und anschließend auf eine PVDF-Membran übertragen. Bei der Autoradiographie wird die Membran einem Röntgenfilm ausgesetzt und mit einem Phosphor-Imager gemessen. Western Blot wird verwendet, um den relativen Proteingehalt in der PVDF-Membran zu messen. In diesem Beispiel wurden die Phosphorylierungsniveaus von leucinreichen Repeat-Kinasen gemessen, die in 293T-Zellen synthetisiert wurden. Das Autoradiogramm zeigt, wie viel Phosphor in das Protein eingebaut wurde. Western Blotting klärt die Spiegel der LRRK-Proteine auf. Bildanalysesoftware wird verwendet, um quantitative Daten über den Phosphorylierungsgrad der Proteine zu erhalten.

In diesem nächsten Verfahren wird die photoreaktive Markierung demonstriert. Zunächst werden die Zellen präpariert und kultiviert. Das photoreaktive Analogon wird den Zellen in der Mid-Log-Phase zugesetzt und inkubiert. Bei diesem Verfahren wird p-Benzoylphenylalanin verwendet. Die Proben werden in Intervallen entnommen und auf Eis gelegt. Die Proben werden dann exponiert, um Momentaufnahmen der biochemischen Signalwege im Laufe der Zeit zu erhalten. Die interessierenden Proteine werden dann mit SDS-PAGE aufgereinigt und aufgelöst.

Eine photoreaktive Markierungsstrategie wurde verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem interessierenden Protein interagieren. Die Immundetektion mit Western Blotting zeigt Proteinbanden, die darauf hindeuten, dass Proteine mit höherem Molekulargewicht in den bestrahlten Proben vorhanden sind. Diese stammen aus der Vernetzung aufgrund der Protein-Protein-Wechselwirkung, die während der UV-Bestrahlung stattfindet.

Nachdem wir nun die Verfahren zur metabolischen Markierung überprüft haben, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie der Prozess verwendet wird.

Konzepte der metabolischen Markierung können auf mehrzellige Organismen ausgeweitet werden. Die Pflanzen werden in einer geschlossenen Umgebung angebaut, die reich an stabilen Isotopen ist, um markiertes Pflanzenmaterial zu produzieren. Kohlendioxid, das Kohlen-13 enthält, wird dem Gehege zugesetzt, während stickstoff-15-reicher Dünger verwendet wird. Das daraus gewonnene Pflanzenmaterial kann helfen, Fragen zum Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf aus dem Ökosystem zu beantworten.

Die Markierung ermöglicht die Trennung von neu synthetisierter RNA von älterer RNA. Durch Änderung der Anfangskonzentration des Analogons kann die Kinetik der neuen RNA-Synthese bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von 4-Thiouriidin beeinflusst, wie viel neue RNA transkribiert wird. Zusätzlich können die Einbauraten der Markierung in RNA direkt mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden.

Mit Hilfe der biorthogonalen Click-Chemie können Glykane in einem Zebrafischembryo markiert werden. Den Eiern wird eine Markierungsverbindung injiziert, die zu Alkinmarkierungen auf den Glykanen führt. Die Glykane in den Larven werden dann im gewünschten Entwicklungsstadium zu einer Farbstoffverbindung ligiert. Anschließend werden die Glykane in den Embryonen abgebildet. Glykane, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten produziert werden, können durch Markierung mit unterschiedlichen Farben in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung identifiziert werden.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die metabolische Markierung angesehen. Dieses Video beschreibt die Konzepte hinter der metabolischen Markierung und ihre Strategien, geht auf zwei allgemeine Verfahren ein und behandelt einige der Anwendungen der Techniken.

Danke fürs Zuschauen!