4.10: Photometrische Proteinbestimmung

Die Bestimmung der Konzentration eines Proteins in Proben ist ein grundlegender Schritt in vielen biochemischen Assays. Die photometrische Bestimmung kann mit kleinen Probengrößen durchgeführt werden. Je mehr eine Probe lichtabsorbierende Substanzen enthält, desto weniger Licht wird sie durchlassen. Dies ermöglicht eine quantitative Messung der absorbierenden Substanzen. Diese Konzepte sind für die Wissenschaft so grundlegend, dass die Artikel, in denen zwei der Techniken vorgestellt wurden, zu den drei meistzitierten Arbeiten aller Zeiten gehören. Dieses Video zeigt die Konzepte hinter einigen der gebräuchlichsten photometrischen Proteinbestimmungstechniken, wie sie durchgeführt werden und wie die gesammelten Daten analysiert werden.

Die photometrische Proteinbestimmung basiert auf dem Zusammenhang zwischen Konzentration und Lichtabsorption. Dies ist als Beer-Lambert-Gesetz bekannt, das besagt, dass die Konzentration einer lichtabsorbierenden Spezies proportional zu ihrer Absorption ist.

Dieses Prinzip liegt allen photometrischen Methoden zur Proteinbestimmung zugrunde.

Für die direkte Absorptionsanalyse werden die Absorptionswerte von unveränderten Proteinproben gemessen. Tryptophan- und Tyrosinreste weisen aufgrund ihrer aromatischen Seitenketten bei einer Wellenlänge von 280 nm die höchsten Absorptionswerte auf.

Diese Aminosäuren - die zwei der am seltensten in Proteinen vorkommenden Aminosäuren sind - sind jedoch in jedem Protein in unterschiedlichen Mengen vorhanden, so dass jede Bestimmung einzigartig ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden komplexere Assays entwickelt, die nicht von diesen Aminosäuren abhängig sind.

Ein Beispiel ist der Bradford-Assay, bei dem der Probe farbiger Farbstoff zugesetzt wird. Der Farbstoff, bekannt als Coomassie Blue, reagiert proportional - je mehr Protein vorhanden ist, desto mehr Bindungsereignisse mit dem Farbstoff.

Dann wird die Proteinkonzentration bestimmt, indem die Absorption des gebundenen Farbstoffs Coomassie Blue gemessen wird, der Licht bei 594 nm absorbiert. Der Bradford-Assay ist jedoch über einen kurzen Konzentrationsbereich linear, so dass vor der Analyse häufig Verdünnungen erforderlich sind.

Die Lowry-Methode kombiniert das Biuret-Reagenz, eine alkalische Lösung von Kupferionen, die mit Peptidbindungen reagieren, und das Folin-Cioc?lteu-Reagenz, das aromatische Proteinreste oxidiert. Die resultierende Farbänderung der Probe ist proportional zur Proteinkonzentration.

Die Extinktion des reduzierten Folin-Reagenzes kann bei 750 nm bestimmt werden. Wie bei der direkten Absorption hat jedes Protein eine einzigartige Reaktion und muss für das gewünschte Protein kalibriert werden. Nachdem wir nun die Grundprinzipien hinter einigen der gängigsten Assays überprüft haben, schauen wir uns an, wie die direkte Absorption und der Bradford-Assay durchgeführt werden.

Um eine direkte Absorptionsanalyse zu starten, wird das Spektralphotometer mit einem Rohling kalibriert, um die Nullabsorption zu bestimmen. Für die Erstellung der Kalibrierkurve werden Standardlösungen vorbereitet. Dann wird ein Aliquot des ersten Standards zu einer Küvette hinzugefügt und in das Spektralphotometer gegeben.

Anschließend wird der Absorptionswert bei 280 nm aufgezeichnet. Dieser Vorgang wird für jeden Standard wiederholt, wobei für jeden Lauf eine saubere Küvette verwendet wird. Sobald dies abgeschlossen ist, wird eine Kalibrierungskurve erstellt, indem die Absorption in Abhängigkeit von der Konzentration aufgetragen wird. Die Steigung dieser Linie ist der molare Dämpfungskoeffizient, der die Absorption mit der Konzentration in Beziehung setzt.

Als nächstes wird die unbekannte Probe in eine Küvette gegeben und der Absorptionswert aufgezeichnet. Da die Datenanalyse für die verschiedenen photometrischen Bestimmungsmethoden ähnlich ist, werden wir dies nach einem Blick auf den Bradford-Assay behandeln.

Hier wird der Bradford-Protein-Assay mit einem BSA-Standard auf einer 96-Well-Platte durchgeführt. Zu Beginn werden BSA-Stammlösungen vorbereitet.

Die unbekannten Lösungen werden mit deionisiertem Wasser verdünnt, um sicherzustellen, dass die Konzentrationen innerhalb des Bereichs des Assays liegen. Je nach Kit muss der Coomassie-Farbstoff möglicherweise auch verdünnt werden. Dann wird die Kalibrierkurve eingerichtet, indem die BSA-Standards auf die 96-Well-Platte aufgebracht werden.

Deionisiertes Wasser wird hinzugefügt, um die erforderliche Konzentration zu erreichen und eine Standardkurve zu erzeugen. Die unbekannte Probe sollte in dreifacher Ausfertigung auf die Platte gegeben werden, um eine genaue Messung zu gewährleisten. Als nächstes wird Coomassie-Farbstoff in jede Vertiefung gegeben und mit der Pipette vermischt.

Deionisiertes Wasser wird in eine leere Vertiefung als Rohling gegeben, um die Absorption zu messen. Nach 5 Minuten Wartezeit auf die Bindung des Farbstoffs wird die Absorption in einem Platten-Reader bei 590 nm gemessen.

Nachdem wir nun einige Assays durchgeführt haben, schauen wir uns an, wie die Daten analysiert werden. Jede photometrische Proteinbestimmungsmethode basiert auf dem Beer-Lambert-Gesetz.

Aus der gemessenen Extinktion der Standards wird eine Kalibrierkurve erstellt, die dann zur Bestimmung der Konzentration unbekannter Proben verwendet wird. Diese Kurve kann manuell aufgetragen werden, obwohl neuere spektrophotometrische Werkzeuge die Kalibrierkurve erstellen, sobald alle Standards gemessen wurden. Diese Systeme berechnen auch die Proteinkonzentration, wenn unbekannte Proben analysiert werden.

Nachdem wir uns nun mit der Analyse von photometrischen Proteinbestimmungsdaten befasst haben, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie diese Verfahren eingesetzt werden.

Die Prinzipien der photometrischen Proteinbestimmung können auch zur direkten Messung der Nukleinsäurekonzentration verwendet werden. Das Nanotropfen-Spektralphotometer nimmt Proben mit sehr kleinem Volumen auf einen optisch aktiven Sockel auf. Anschließend wird die Extinktion gemessen, und das System bestimmt automatisch die Nukleinsäurekonzentration. Da Proteine und andere Quellen die Messungen beeinträchtigen können, wird die Reinheit der Probe durch die Analyse der Absorptionsverhältnisse von 260 bis 280 nm und 260 bis 230 nm bestimmt. Reine Nukleinsäuren ergeben typischerweise Verhältnisse von etwa 1,8 bzw. etwa 2,0 für DNA bzw. RNA.

Die photometrische Proteinbestimmung kann auch bei der Herstellung von biomimetischen Materialien eingesetzt werden, die von der Natur inspiriert sind, um spezifische zelluläre Reaktionen hervorzurufen. Rekombinante Adhäsine werden an Polystyrolkügelchen gebunden, um die Anheftung von Bakterien an Wirtszellen zu simulieren. Der Bradford-Assay wird verwendet, um die Kopplungseffizienz der rekombinanten Adhäsion an die Kügelchen bei der Herstellung des biomimetischen Materials zu bestimmen.

Alternative photometrische Proteinassays können bei der Detektion und Charakterisierung von antimikrobiellen Proteinen eingesetzt werden. Der Farbstoff Remazol Brilliant Blue R ist kovalent an hitzeabgetötete Bakterien gebunden. Das antimikrobielle Protein wird in der gefärbten Lösung inkubiert. Dann wird die Probe zentrifugiert und die Absorption des Überstands bei 595 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektrophotometer gemessen. Eine erhöhte Absorption durch den löslichen Farbstoff, der von den markierten Bakterien in den Überstand freigesetzt wird, ist ein quantitatives Maß für die enzymatische Aktivität.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die photometrische Proteinbestimmung angesehen. Dieses Video beschreibt die zugrundeliegenden Prinzipien der photometrischen Bestimmung, geht auf die allgemeinen Verfahren für einige gängige Assays ein und behandelt einige neue Fortschritte in der Technik. Danke fürs Zuschauen!