Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik komplexer Proteinsysteme quantitativ zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf korrelierten Wechselwirkungen wie der Kooperativität liegt. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der quantitativen Biologie zu beantworten, in denen Proteinkomplexe und ihre dynamischen Wechselwirkungen von zentraler Bedeutung sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, dynamisches mehrfarbiges Einzelmolekül-FRET auf biologisch relevante Systeme anzuwenden.

Schneiden Sie vor dem Zusammenbau der Durchflusskammer einen Strömungskanal in eine 40 Mikrometer dicke transparente Klebefolie, sprühen Sie Schnellkleber auf die nicht klebende Seite der Folie und lassen Sie den Klebstoff trocknen. Um mit der Montage der Durchflusskammer zu beginnen, erhalten Sie einen drei Millimeter dicken PEG-Biotin-PEG-funktionalisierten Quarzglasträger mit Einlass- und Auslasslöchern. Tragen Sie die mit Sprühkleber beschichtete Seite der Deckenfolie auf die funktionalisierte Seite der Rutsche auf und richten Sie den Kanal an den Ein- und Auslaufhaken aus.

Erhitzen Sie den Objektträger auf einer heißen Platte eine Minute lang auf 80 Grad Celsius. Drücken Sie den Film 30 Sekunden lang mit einem zusätzlichen Objektträger auf den Objektträger, um den Druck gleichmäßig zu verteilen. Lassen Sie die Baugruppe dann eine Minute lang abkühlen.

Ziehen Sie die Schutzfolie ab, die den Kleber bedeckt. Legen Sie ein Deckglas auf den freiliegenden Klebstoff, um die Fließkammer zu bilden. Heizen Sie die Kammer eine Minute lang auf 80 Grad Celsius.

Drücken Sie den Deckglas 30 Sekunden lang auf den Kleber, um die Kammer abzudichten und die zusammengebaute Kammer abkühlen zu lassen. Tragen Sie einen Tropfen Glycerin auf die Prismenfläche auf, bevor Sie die Durchflusskammer über das Prisma legen. Montieren Sie die Durchflusskammer in einer Halterung für ein mehrfarbiges TIRF-Mikroskop vom Typ Prisma.

Schließen Sie den Einlass- und Auslassschlauch an, wenn Sie fertig sind. Um mit der Konfiguration des Instruments für die Dreifarbenmessung zu beginnen, öffnen Sie die Elektronenmultiplikations-CCD-Kamerasoftware und stellen Sie den EMCCD-Sensor auf die niedrigstmögliche Temperatur ein. Stellen Sie die vertikale Shift-Geschwindigkeit der Kamera auf 3,3 Mikrosekunden ein, wählen Sie die normale vertikale Taktspannung, stellen Sie die horizontale Ausleserate auf 17 Millihertz bei 16 Bit, die Vorverstärkungsverstärkung auf drei und den Elektronenvervielfachungsverstärkungspegel auf 1000 ein.

Wählen Sie die externe Erfassungsauslösung. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 70 Millisekunden ein. Und die Aufnahmedauer von Filmen beträgt 750 Aufnahmezyklen.

Erstellen Sie einen neuen Ordner für die Messdateien. Aktivieren Sie das automatische Speichern in der EMCCD-Software, und legen Sie das Dateiformat für Filmbilder auf TIFF fest. Legen Sie den Dateipfad für das automatische Speichern auf den neu erstellten Ordner fest.

Öffnen Sie dann die Software, die den akusto-optischen abstimmbaren Filter steuert, die Lasersteuerungssoftware und die Triggersoftware, die die Laser, die AOTF, die optischen Verschlüsse und die Kameras synchronisiert. Stellen Sie mit dem AOTF die Laserleistung auf etwa drei Milliwatt ein, bevor Sie in das Prisma eintreten. Laden Sie das Triggermuster, das alle Geräte für die alternierende Laseranregung synchronisiert, und montieren Sie dann den Probenhalter im Gerät.

Legen Sie das Ende des Einlassschlauchs in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das den Versuchspuffer enthält. Verbinden Sie den Auslassschlauch mit einer Spritzenpumpe, die auf den Entnahmemodus eingestellt ist. Spülen Sie die Kammer mit 150 Mikrolitern Puffer.

Fokussieren Sie die CCD-Kamera auf die funktionalisierte Grenzfläche, richten Sie die Anregungsstrahlen aus und bleichen Sie fluoreszierende Verunreinigungen. Dann werden 300 Mikroliter einer Lösung von 0,25 Milligramm pro Milliliter deglykosyliertem Avidin und Puffer in die Kammer gegossen und eine Minute lang inkubiert. Ungebundenes deglykosyliertes Avidin mit Puffer aus der Kammer spülen.

Lassen Sie dann 300 Mikroliter Puffer mit einer BSA-Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter durch die Kammer, um Defekte der Oberflächenfunktionalisierung zu blockieren. Als nächstes wird die Durchflusskammer mit 150 Mikrolitern biotinyliertem, fluoreszenzmarkiertem Hsp90 in BSA-haltigem Puffer bei steigenden Hsp90-Konzentrationen beladen, bis eine ausreichende Oberflächendichte erreicht ist. Ungebundenes Protein aus der Kammer mit 300 Mikrolitern BSA-haltigem Puffer waschen.

150 Mikroliter einer 25-nanomolaren Lösung aus markiertem AMP-PMP und BSA, die Puffer enthält, werden in die Kammer geladen und fünf Minuten lang inkubiert. Wiederholen Sie das Laden und Inkubieren einmal. Verwenden Sie dann einen Piezo-Stepper, um die Probenkammer senkrecht zum Anregungsstrahl zu bewegen und das Sichtfeld wie gewünscht zu ändern.

Passen Sie bei Bedarf den Bildfokus an. Starten Sie die Kameraaufzeichnungen in der Kamerasoftware, indem Sie wie abgebildet auf die Schaltfläche Signal aufnehmen klicken. Initiieren Sie die Anregungserfassungszyklen in der Triggersoftware, um mit der Datenerfassung zu beginnen.

Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie die Analysesoftware und importieren Sie die aufgezeichneten Filme der beiden Kameras. Klicken Sie auf Spuren suchen, um die Fluoreszenzintensitätsspuren zu bestimmen, die potenziellen Einzelmolekülen entsprechen. Berechnen Sie für jedes Molekül die Summe aller Spuren dieses Flecks mit der gleichen Anregungsfarbe.

Bewerten Sie die Intensitätsprofile in allen Kanälen für ein annähernd flaches Plateau in der Rohintensität der Fuge und einen einzigen Bleichschritt für alle Anregungsfarben. Achten Sie auf antikorreliertes Verhalten in den entsprechenden Detektionskanälen und das Auftreten von roter Fluoreszenz in der Spur. Wenn alle Kriterien erfüllt sind, bewahren Sie die Fluoreszenzspuren für die weitere Analyse auf.

Nur das angegebene Molekül erfüllt die Kriterien in diesem Beispiel. Schließen Sie Spuren aus, die keine flachen Plateaus aufweisen, die blinkende Ereignisse anstelle von Antikorrelation aufweisen oder die mehrere Bleichschritte aufweisen. Die Spurenselektion ist ein kritischer Schritt bei allen Einzelmolekültechniken.

Es sollten nur Ablaufverfolgungen ausgewählt werden, die genau definierte Kriterien erfüllen. Hier sind diese Kriterien Anti-Korrelation, einzelne Bleichschritte und flache Plateaus. Zeigen Sie als Nächstes die gespeicherten Moleküle nacheinander an und wählen Sie mit einem Satz von Intensitätsspuren ein Zeitintervall aus, in dem alle Floor-Fours bereits gebleicht sind.

Berechnen Sie die Hintergrundintensität des Strahls für dieses Zeitintervall und wählen Sie dann den FRET-Effizienzbereich aus, in dem beide Farbstoffe auf Hsp90 vorhanden sind, wobei Sie darauf achten müssen, Spuren mit Blinkereignissen auszuschließen. Berechnen Sie die partiellen Fluoreszenzspuren. Schließen Sie Moleküle mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis in den Leiterbahnen aus.

Generieren Sie als Nächstes Bind-2D-Projektionen der partiellen Fluoreszenzdaten und starten Sie das Tool zur Berechnung der relativen Population. Klicken Sie auf Init. Zeichnen Sie ein Polygon um den Gipfel des Interesses.

Klicken Sie auf Anzahl, um die relative Grundgesamtheit für diesen Spitzenwert zu berechnen. Generieren Sie ein 3D-Histogramm der partiellen Fluoreszenzdaten und normalisieren Sie das Histogramm. Überziehen Sie die Anfangsparameter für eine 3D-Gaußsche Anpassung, und fügen Sie die Zustandspopulationen am Ende des Parametervektors hinzu.

Passen Sie die Daten an und zeigen Sie die Ergebnisse an. Nachdem Sie die Position und Breite jedes Zustands im partiellen 3D-Fluoreszenzraum definiert haben, initialisieren Sie die Benutzeroberfläche des Hidden-Markov-Modells. Wählen Sie die entsprechende Anzahl von Zuständen, die Anzahl der Dimensionen des Eingangssignals und den Eingangstyp aus.

Optimieren Sie die HMM-Parameter, um die Maximum-Likelihood-Schätzer für die Übergangswahrscheinlichkeiten zu bestimmen. Wiederholen Sie die Auswahl der Grundgesamtheit, die Anpassung und die HMM-Optimierung für Teilmengen. Berechnen Sie abschließend das Konfidenzintervall für die Übergangswahrscheinlichkeiten und reduzieren Sie die Konformationszustände, um die Daten für die weitere Analyse zu vereinfachen.

Die Konformationszustände des Hsp90-Proteins wurden mit drei farbigen Einzelmolekülen FRET in Gegenwart des markierten Reporternukleotids AMP-PMP untersucht. Fünf Konformationszustände waren durch Fluoreszenzintensitäten unterscheidbar, wobei vier dieser Zustände funktionell unterschiedlich waren. Dreifarbige Einzelmolekül-FRET führte dazu, dass die partiellen Fluoreszenzdaten einen 3D-Raum überspannten.

2D-Projektionen wurden verwendet, um die Zustände zu trennen, da alle Zustände, die unter den Experimentbedingungen theoretisch erwartet werden, in 2D-Projektionen durch ihre partielle Floreszenz unterscheidbar sind. Die relativen Populationen dieser Zustände wurden aus den 2D-Projektionen bestimmt und als Randbedingungen für 3D-Gaußsche Anpassungen verwendet. Die anschließende 3D-HMM-Optimierung und -Modellierung des Ensembles lieferte die extrahierten Zustandsübergangswahrscheinlichkeiten.

Für jede extrahierte Geschwindigkeitskonstante wurden Konfidenzintervalle berechnet. Die Wiederholung der Experimente in Gegenwart von zusätzlichen 250 mikromolaren unmarkierten AMP-PMP klärte den Einfluss der Bindung eines Nukleotids auf die zweite Bindungsstelle im Hsp90-Dimer auf. Das Kollabieren der gebundenen und ungebundenen Konformationen ermöglichte die Berechnung der durchschnittlichen Verweilzeit für die fluoreszierende AMP-PMP-Dissoziation von Hsp90 in Gegenwart und Abwesenheit von zusätzlichem unmarkiertem AMP-PMP.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kinetische Informationen aus einem dynamischen Proteinsystem mit Hilfe von Multicolor FRET und einem TIRF-Mikroskop extrahieren können. Diese Technik ebnet Forschern in den Lebenswissenschaften den Weg, korrelierte Wechselwirkungen in Multiproteinsystemen zu bestimmen. Dies ist wichtig für ein tieferes Verständnis grundlegender Regulationsmechanismen wie der Kooperativität.