Name: Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie quantitative Nahrungsaufnahme-Assays bei Drosophila melanogaster zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise des Appetits. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen mit thermogenetischer und optogenetischer Manipulation.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch National Basic Research Program of China (2012CB825504), der National Natural Science Foundation of China (91232720 und 9163210042), chinesische Akademie der Wissenschaften (CAS) (GJHZ201302 und QYZDY-SSW-SMC015), Bill und Melinda Gates Stiftung (OPP1119434) und 100-Talente-Programm von CAS, Y. Zhu.

1. Vorbereitung der füllraum
Hinweis: Der Füllraum für Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assay besteht aus zwei Teilen: der Außen Container (als Deckel) und innen Container (als Nahrungsquelle).
<ol><li>Ändern den außen Container von einem Glasfläschchen für die Kultivierung von Drosophila mit (einem Innendurchmesser von 31,8 mm) und einer Höhe von 80 mm (Abb. 1A, 1 C). Abdeckung der Unterseite des Behälters mit einer Schicht von 1 % Agarose (5 mL) auf die Fütterung Setup ordnungsgemäß zu halten befeuchtet und dienen als weiche Substrat für die fliegen gehen auf (Abbildung 1 b). Der Container bietet damit eine kontrollierte aber naturalistische Einstellung mit minimalem Stress oder Störung, die fliegen.<ol>
<li>Bereiten Sie den äußeren Container. 0,5 g Agarose in 50 mL doppelt destilliertes Wasser, Wärme unter häufigen rühren, suspendieren und Kochen auf einem Magnetrührer mit einer Heizplatte vollständig auflösen.</li>
		<li>Wenn das 1 % Agarose kühlt auf ca. 60 ° C, 5 mL 1 % Agarose ein leeres außerhalb Containers (Abbildung 1 b), und lasse Sie den Container bleiben offen, bis auf Raumtemperatur bringen eine Agarose-Pad abgekühlt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Farbstoff-markierten Essen zubereiten. Zusammensetzung der Farbstoff-markierten Lebensmittel variiert je nach verschiedenen experimentellen Zwecken. Hier ist ein Beispiel der Vorbereitung der Farbstoff-markierten Lebensmittel enthalten nur Saccharose.<ol>
<li>0,5 g Agarose in 50 mL doppelt destilliertem Wasser, Wärme unter häufigen Rühren hinzufügen und Kochen auf einen Magnetrührer mit einer Heizplatte vollständig auflösen.</li>
		<li>Wenn die oben genannten 1 % Agarose auf etwa 60 ° C abkühlt, fügen Sie 1,71 g Saccharose die Agarose, 100 mM Saccharose zu erhalten hinzu.</li>
		<li>Die Agarose-Lösung 0,5 % (w/V) Farbstoff-markierten Lebensmittel erhalten fügen Sie 0,25 g blauer Farbstoff (Erioglaucine binatrium hinzu).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie das innere Container. Setzen Sie die leere im Inneren von Behältern auf einer flachen Unterlage, dann 750 µL der blaue Farbstoff-markierten Lebensmittel an einzelne Lebensmittel-Container, lassen Sie es mindestens 5 min lang zu festigen. Hinweis: Der innere Container ist eine kleine Plastikschale mit einem Innendurchmesser von 13,6 mm und einer Höhe von 7,5 mm (Abb. 1A, 1 C). Es ist gefüllt mit Farbstoff-markierten Essen und ist dann in der Mitte des Agarose-Pads des äußeren Containers positioniert.</li>
	<li>Übertragen Sie einer gefüllten Container in eine vorbereitete außen Container und positionieren Sie es in der Mitte des Agarose-Pad. Lassen Sie die Fütterungen Kammern bei Raumtemperatur für 40 min geöffnet bleiben, bis die Wand des äußeren Containers frei von Kondensation ist. Hinweis: Die Trockenmauer ist notwendig, um zu verhindern, dass die fliegen durch Kontaktaufnahme mit Wassertropfen an der Wand stecken.</li>
	<li>Bereiten Sie Fütterung Kammern mit Farbstoff-freie Lebensmittel (gleiche Zusammensetzung aber ohne Farbstoff) für Hintergrundabzug.</li>
</ol>2. Vorbereitung der fliegen
Hinweis: Erwachsenes Weibchen fliegt 5 bis 10 Tag nach bewegungsapparate dienen normalerweise zur Fütterung Assays. Es empfiehlt sich, fliegt der verschiedenen Genotypen, einschließlich genetischen Kontrollen vorzubereiten und parallel zu testen. 20 fliegen (von einem Füllraum) erzeugen einen Datenpunkt.
<ol><li>Betrachten Sie die Bevölkerungsdichte für die Aufzucht von Erwachsener Flies. In der Regel steuern Sie die Bevölkerungsdichte durch Variation der Anzahl der Eltern fliegen nach den Strapazen und die Dimensionen von Kultur-Flaschen. Als Beispiel 15 Männer und 30 Frauen des Kantons-S eine kulturflasche mit (31,8 mm Durchmesser) und einer Höhe von 80 mm und lasse Sie die Weibchen legen von Eiern für einen Tag, dann entfernen Sie die Erwachsenen fliegen.</li>
	<li>Thermogenetischen Aktivierung fliegen vorbereiten.<ol>
<li>Verwenden Sie die Gal4/UAS-System38 dTRPA133 in verschiedenen Neuronen durch Kreuzung zum Ausdruck zu bringen, die FH-dTrpA1 mit verschiedenen GAL4 Fahrer Linien (Abb. 2 b) fliegt.</li>
		<li>Halten Sie die Erwachsenen fliegen auf standard-Food bei 22 ° C, 60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus.</li>
		<li>Zwei Tage vor der Fütterung assay, Sortieren und fliegt auf eine CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop in eine frische Lebensmittel Durchstechflasche zu sammeln und eine Dichte von 20 fliegen pro Fläschchen halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optogenetische Aktivierung fliegen vorbereiten.<ol>
<li>Verwenden Sie die Gal4/UAS-System38 CsChrimson36 in verschiedenen Nervenzellen durch Kreuzung UAS-CsChrimson fliegen mit verschiedenen GAL4 Fahrer Linien zum Ausdruck zu bringen.</li>
		<li>Neu sammeln Sie geschlüpften (innerhalb von 24 h) fliegen zu und übertragen Sie sie in ein Fläschchen mit standard-Food mit 400 µM All-Trans-Retinal.</li>
		<li>Zur Vermeidung von vorzeitigen Aktivierung der Aufzucht Fläschchen mit Alu-Folie wickeln und dann steckte sie in eine dunkle Kiste fliegen vor unerwünschten Lichtstimulation zu schützen. Halten Sie die fliegen bei 25 ° C, 60 % Luftfeuchtigkeit in der Dunkelheit für 4-6 Tage.</li>
		<li>Zwei Tage vor der Fütterung Assay fliegt Art weiblich auf CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop. Sammeln Sie 20 fliegen in einem Lebensmittel Durchstechflasche und halten sie in der Dunkelheit vor der Fütterung Test.</li>
		<li>Führen Sie alle Operationen unter schwachem Licht so schnell wie möglich, die Auswirkungen durch Umgebungslicht zu vermeiden. Verwenden Sie eine LED-Lampe weit weg aus dem Arbeitsbereich platziert, die Intensität auf den Arbeitsbereich 5 µW/cm2. Hinweis: Verwendung verhungert Kanton-S fliegt als Positivkontrolle für die Fütterung Assay. Diese fliegen von Lebensmitteln zu berauben und pflegen auf 1 % Agarose für 24 h vor der Fütterung Test. Die Ebenen der Nahrungsaufnahme dieser fliegen helfen die täglichen Schwankungen zu bewerten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) thermogenetischen Aktivierung
<ol><li>Führen Sie alle Fütterungsversuche zur gleichen Zeit des Tages, um Zeitgeber Zeit 4-631,32, um Abweichungen aufgrund zirkadianen Rhythmen zu minimieren.</li>
	<li>Inkubator (oder einen kleinen Raum mit einer Temperatur-kontrollierten Heizung) als die Heizung Umwelt vorbereiten.</li>
	<li>Vor Verhaltensexperimente equilibrate der vorbereiteten Fütterungen Kammern an die experimentelle Temperatur (30 ° C) für 2 h um sicherzustellen, dass die Temperatur relativ Uniform in den Füllraum ist.</li>
	<li>Um die Fütterung zu starten, übertragen Sie sorgfältig 20 fliegen aus ihrer Heimat Fläschchen in einem vorgeheizten Füllraum durch sanftes antippen. Fahren Sie fort, Fütterung bei 30 ° C für 60 min ( Abbildung 3A) . Hinweis: Häufige Aufregungen, sollte wie z. B. Öffnen und Schließen der Tür Inkubator beeinträchtigen das Fressverhalten somit minimiert werden.</li>
	<li>30 min nicht mehr in der Fütterung bei 60 min durch das Einfrieren der Fütterungen Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C). Hinweis: Einfrieren hilft, um Fütterungen in allen Kammern gleichzeitig zu stoppen. Fliegen bei-80 ° C Einfrieren dient zwei Zwecken, für die fliegen euthanizing und Einlagerung bis Homogenisierung bis zu einer Woche.</li>
	<li>Übertragen Sie für die Kontrollgruppe Temperatur 20 fliegen in einer Fütterung Kammer mit Farbstoff gefärbte Lebensmittel mit der Fütterung beginnen bei 22 ° C für 60 min. Temperatur.</li>
	<li>30 min nicht mehr in der Fütterung der Kontrollgruppe Temperatur durch das Einfrieren der Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).</li>
</ol>4. Optogenetische Aktivierung
<ol><li>Führen Sie alle Fütterungsversuche zur gleichen Zeit des Tages, um Zeitgeber Zeit 4-631,32, um Abweichungen aufgrund zirkadianen Rhythmen zu minimieren.</li>
	<li>Sorgfältig 20 fliegen aus einem Fläschchen in einem Füllraum durch sanftes antippen, und setzen Sie dann die Kammer seitlich auf die Beleuchtung Setup (Abbildung 4A, 4 b).<ol>
<li>Für optogenetische Manipulation, verwenden Sie ein Array von orange LEDs (607 nm) als Quelle der Lichtstimulation und Fix eine horizontale Plexiglasplatte über die LEDs, die Fütterung unterstützen Kammern während der Beleuchtung. Halten Sie das Setup in einem Inkubator bei 25 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit (Abbildung 4A, 4 b).</li>
		<li>Stimulieren die genetische Kontrolle fliegen parallel zu den Taotie > CsChrimson fliegt, aber füttern in verschiedenen Kammern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fortfahren Sie der Fütterung für 60 min mit der hinteren Beleuchtung durch das Orange Licht.<ol>
<li>Bestimmen Sie die optimale Beleuchtung Intensitäten für optogenetik experimentell36. Für die Taotie > CsChrimson fliegen, eine Intensität von 2,2 mW/mm2 induziert Lähmung (Einstellung der Fortbewegung) und Verlust der posturalen Kontrolle daher, eine mittlere Intensität 0,1 mW/mm2 verwenden, um die Taotie stimulieren > CsChrimson fliegt während der Fütterung Test.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 min nicht mehr in der Fütterung durch Einfrieren Fütterung Kammern bei-80 ° C (oder-20 ° C).</li>
</ol>5. visuelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln
Hinweis: Die visuelle scoring Ansatz bietet eine semi-quantitative Abschätzung der Nahrung Verbrauch. Es ist, zwar nicht so objektiv wie die optische Methode ermöglicht diese Methode durchläuft eine große Anzahl von fliegen-Stämme in einer zeitgemäßen Weise, eignet sich für die erste Runde eine genetische Bildschirm, um die Liste der Kandidaten für weitere Tests schnell eingrenzen.
<ol><li>Nach der Fütterung Prozess zu betäuben und Gäste die fliegen auf einen CO2 fliegen Pad unter dem Stereo-Mikroskop. Jede Fliege anhand der Lautstärke und Intensität der Farbstoff gefärbte Lebensmittel in ihren Bauch (Abbildung 2A) verleihen Sie Einzelnote. Hinweis: Kriterien für visuelle Einschätzung: Score-System verfügt über 4 Ebenen der Nahrungsaufnahme entsprechend unterschiedliche Volumina und Intensitäten der farbigen Nahrung im Bauch.<ol>
<li>Partitur fliegt ohne nachweisbare Farbstoff gefärbte Lebensmittel eine Punktzahl von 0; Gib denen mit schwacher (kaum erkennbar) blauen Farbstoff oder mit Farbstoff-farbigen essen weniger als ein Drittel des Volumens des Bauches besetzen einen Wert von 1.</li>
		<li>Partitur fliegt mit intensiven Farbstoff gefärbte Lebensmittel besetzen Hälfte des Bauches eine Punktzahl von 2.</li>
		<li>Gäste die mit intensiv gefärbten Inhalte besetzen mehr als die Hälfte des Bauches eine Kerbe von 3 (Abbildung 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie den Anteil von Fliegen mit verschiedenen Punktzahlen in jeder versuchsbedingung (Abb. 2 b).</li>
</ol>6. farbmetrischen Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln
<ol><li>Gießen Sie nach Beendigung der Fütterung alle 20 fliegen von einem Füllraum auf ein Stück mit einem Gewicht von Papier, dann übertragen sie in 1,5 mL Tube mit einer weichen Bürste. Hinweis: Nehmen Sie alle Kammern aus-80 ° C Lagerung nicht zur gleichen Zeit fliegen festhalten an der Kammerwand wegen Kondenswasser auf der Kältekammer zu vermeiden.</li>
	<li>Das Rohr 500 µL PBST hinzu und homogenisieren die fliegen mit eine Mühle bei 60 Hz für 5 s.<ol>
<li>Bestätigen Sie ausreichende Homogenisierung durch Beobachtung, gibt es keine nachweisbaren Fragmente von Körperteilen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drehen Sie die Rohre mit Homogenates für 30 min bei 13.000 u/min um die Trümmer zu löschen.</li>
	<li>Übertragen Sie nach Zentrifugation 100 µL des Überstandes auf einen Brunnen einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Nachdem alle Samples geladen werden, setzen die Platte in einen Teller Reader zur Messung der Extinktion der Proben bei 630 nm.</li>
	<li>Entfernen die Hintergrund-Absorption, subtrahieren die Extinktion der Überstände von fliegen gefüttert Lebensmittel ohne Farbstoff aus der Extinktion des Überstands von der blauen Nahrung gefüttert fliegen. Hinweis: Dieser Schritt ist optional, abhängig von den Kompositionen des Essens verwendet. Wenn eine Fliege Essen (ohne den Farbstoff) erzeugt Extinktion bei 630 nm, ist es notwendig, führen Sie diesen Schritt, um den Hintergrund zu eliminieren.</li>
</ol>

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Dieser Bericht konzentriert sich auf den technischen Prozess der Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assays der Verzehr von Lebensmitteln im Rahmen von thermogenetischen und optogenetische Aktivierung von Neuronen zu manipulieren controlling Fütterung. Dieses einfache und zuverlässige Protokoll wird dazu beitragen, die Funktion der Kandidat Neuronen in der Fütterung kontrollieren, Essen bevorzugt fliegen zu messen und zu identifizieren, neue Spieler in der Fütterung Steuerstromkreisen über Fütterung-basierten genetischen B...

Die Menge der aufgenommenen Nahrung die Quantifizierung ist wichtig für die Bewertung mehrere Aspekte der Steuerung durch das Gehirn reagiert auf die internen Bedürfnisse (z. B. Hunger Staaten) und externe Faktoren (z. B. Lebensmittelqualität und Schmackhaftigkeit)1, Fütterung 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. in den letzten Jahren die Bemühungen der Entzifferung der neurale Substrate der Fütterung Kontrolle in Drosophila führen zu die Entwicklung von mehreren Assays direkt die Menge der aufgenommenen Nahrung zu quantifizieren oder dienen als Indikator für die Fütterung von Motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Die Kapillare Einzug (CAFE) Assay12,13 wurde entwickelt, um die Menge des Konsums von flüssigen Lebensmitteln in ein Glas Microcapillary zu messen. Die CAFE-Assay ist sehr empfindlich und reproduzierbare17 und vereinfacht die Messung der Verzehr von Lebensmitteln, vor allem zur Quantifizierung der langfristige Fütterung18. Dieser Test erfordert jedoch die fliegen an der Spitze der Microcapillary Klettern und füttern verkehrt, die eignet sich nicht für alle Stämme. Zusätzlich, da die fliegen, mit CAFE-Assay getestet werden auf flüssige Nahrung aufgezogen werden müssen, bleibt die Wirkung dieser Aufzuchtsbedingungen auf Stoffwechsel-Status oder die möglichen Unterernährung ermittelt werden.
Der Rüssel Erweiterung Antwort (PER) Assay11,14 zählt die Häufigkeit der Rüssel Erweiterung Antworten auf sanfte Berührungen von Lebensmittel Tropfen. PRO Test erwies sich als eine hervorragende Möglichkeit, bewerten Fütterung Motivation der einzelnen Fliege und Esel den Einfluss der Schmackhaftigkeit und Inhalt der Nahrung18,19. Es ist jedoch keine direkte Quantifizierung der Einnahme-Menge.
Vor kurzem wurde ein halbautomatisches Verfahren, die manuelle Zuführung Assay (MAFE)15, entwickelt. In MAFE wird eine Fliege immobilisierte manuell mit einem Microcapillary mit Essen zugeführt. Angesichts der Tatsache, dass Rüssel Erweiterung Antworten und Verzehr von Lebensmitteln gleichzeitig überwacht werden können, eignet sich MAFE für die Beurteilung der Nährwerte und die Auswirkungen der pharmakologischen Manipulation. Jedoch könnte eine Fliege Immobilisierung seine Verhaltensstörungen Leistung, einschließlich Fütterung beeinträchtigen.
Darüber hinaus fliegen Rüssel und Aktivität-Detektor (FlyPAD)10 wurde entwickelt, um automatisch Fressverhalten zu quantifizieren. Mit Machine Vision Methoden zeichnet FlyPAD physikalische Wechselwirkungen zwischen einer Fliege und Lebensmittel, die Häufigkeit und Dauer der Rüssel Erweiterungen als Indikator der Fütterung Motivation zu quantifizieren. FlyPAD bietet ein Hochdurchsatz-Ansatz für die Fütterungen Verhalten einer frei beweglichen Fliege zu überwachen, wenn auch die Empfindlichkeit und die Robustheit dieses Systems noch mehr weiter bestätigt werden12Studien.
Kennzeichnung Strategien werden häufig verwendet, um Nahrungsaufnahme fliegen zu schätzen. Es ist üblich, beschriften Sie Lebensmittel mit chemischen Tracer und nach der Fütterung, Messen Sie die Menge des aufgenommenen Tracer, die Menge der Nahrungsaufnahme zu berechnen. Radioaktiver Tracer16,17,20,21,22,23,24,25 ermöglichen die Erkennung durch die Kutikula ohne Homogenisierung der fliegen. Diese Methode bietet bemerkenswert geringe Variabilität und hohe Empfindlichkeit18und ist für Langzeit-Studie der Nahrungsaufnahme möglich. Allerdings sollte die Verfügbarkeit von nutzbaren Radioisotopen und verschiedene Sätze von Absorption und Ausscheidung berücksichtigt werden bei der Arbeit mit dieser Assay.
Kennzeichnung und Rückverfolgung Nahrungsaufnahme mit ungiftige Lebensmittelfarben ist eine sicherere und einfachere alternative2,3,26,27,28. Fliegen werden nach der Fütterung mit Lebensmitteln, die nicht resorbierbaren und lösliche Farbstoffe homogenisiert und die Menge des aufgenommenen Farbstoffs ist später quantifiziert mit einem Spektrophotometer3,24,28,29 . Die Kennzeichnung Strategie ist einfach durchzuführen und bietet eine hohe Effizienz, aber mit einer Einschränkung. Das Volumen der Nahrungsaufnahme geschätzt aus den aufgenommenen Farbstoff ist kleiner als das tatsächliche Volumen weil Ausscheidung bereits 15 Minuten beginnt nach dem Fliegen fressen17. Darüber hinaus bewertet der Assay Nahrungsaufnahme in der Regel binnen 60 Minuten, die nur geeignet für die Untersuchung von kurzfristigen Fütterung Verhalten24,28. Darüber hinaus mehrere interne und externe Faktoren, wie z. B. Genotyp17, Geschlecht17, Stand17, Aufzucht, Dichte30, zirkadianen Rhythmus31,32und Lebensmittel Qualität3 gedeckt , 8 , 16, Einfluss Nahrungsaufnahme. Daher müssen die Fütterung Dauer nach bestimmten experimentellen Bedingungen angepasst werden. Neben die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme zu erleichtern, dienen Lebensmittelfarben, Essen Auswahl2,19,27zu bewerten und den Meniskus in einer Microcapillary im CAFE Assay12zu visualisieren.
Hier stellen wir eine Protokoll kombiniert Manipulation von neuronaler Aktivität mit Farbstoff-labeling-Ansatz. Diese Strategie ist in unserer neurogenetic Studie zur Fütterung Kontrolle in Erwachsenen Fruchtfliegen24nützlich erwiesen. Die visuelle scoring-Methode ermöglicht eine schnelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln; Daher ist es sinnvoll für das Screening durch eine große Anzahl von Stämmen in einer zeitgemäßen Weise. Die Kandidaten vom Bildschirm werden dann im Detail mit einer kolorimetrischen Verfahren bieten Objektive und präzise Quantifizierung in zusätzliche Studie analysiert.
Neben der Fütterung Assays erläutern wir im folgenden die thermogenetischen27,33,34,35 optogenetische36 Methoden und Ziel Neuronen in Drosophilagewaltsam zu aktivieren. Neuronen von thermogenetischen aktivieren Bedienung ist einfach und bequem mit Drosophila Transienten Rezeptor potenzielle Ankyrin-Repeat-(AR)-1 (dTRPA1), die eine Temperatur und Spannung-gated kation Kanal, die neuronale Erregbarkeit erhöht wenn die Umgebungstemperatur Temperatur steigt über 23 ° C33,37; jedoch könnte die Tiere bei hohen Temperaturen beim Testen nachteilige Auswirkungen auf Verhalten erstellt. Ein weiteres effektiver Ansatz zur Aktivierung von Neuronen in Drosophila nutzt optogenetik mit CsChrimson36, das ist eine rot-verschoben Variante des Channelrhodopsin, das erhöht die Erregbarkeit der Neuronen bei Lichteinfall. Optogenetik bietet höhere zeitliche Auflösung und weniger Störungen für Verhaltensweisen als Thermogenetics. Die quantitative Messung der Nahrungsaufnahme mit der Manipulation von neuronaler Aktivität zu verbinden, stellt einen effektiven Ansatz zur Erforschung der neuronalen Mechanismen der Fütterung.
Wir beschreiben ausführlich die Vorbereitung der Füllraum und die fliegen getestet werden. Mit Taotie-Gal4 fliegen als ein Modell24, beschreiben wir aktivierende Neuronen durch Thermogenetics und optogenetik. Zwei Tests der Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln mit Farbstoff-markierten Lebensmittel werden ebenfalls im Protokoll beschrieben.

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Y.</td></tr><tr><td>Rao AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von J. Carlson</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Eriogalucin Dinatriumsalz</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R2500</td><td>in der Dunkelheit gelagert</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfutter</td><td></td><td>1 L Futter enthält: 77,7 g Maismehl, 32,19 g Hefe, 5 g Agar, 0,726 g CaCl2, 31,62 g Saccharose, 63,2 g Glukose, 2 g Kaliumsorbat, pH&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 1x PBS Puffer&nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS enthält: 8 g Nacl, 0,2 g Kcl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, pH 7,4</td><td></td></tr><tr><td>PBST-Puffer</td><td></td><td>1X PBS mit 1% Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mahlmühle</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer mit Heizplatte</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometer</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Multiskan GO Typ: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>&nbsp; M205FA</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Außenbehälter</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>Glasfläschchen mit einem Durchmesser von 31,8 mm und einer Höhe von 80 mm (Innenmaß)</td><td></td></tr><tr><td>Innenbehälter&nbsp;</td><td>Beijing Yi Ran Maschinenfabrik</td><td>Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 13,6 mm und einer Höhe von 7,5 mm (Innenmaß)</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf Röhren</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 96-Well-Platte</td><td>Corning Incorporated</td><td> Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LEDs</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

kombination von quantitativer nahrungsaufnahme assays und zwangsweise aktivierung von neuronen um appetit in drosophila studieren

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Verzehr von Lebensmitteln ist unter strenge Kontrolle des Gehirns, die die physiologischen Zustand, Schmackhaftigkeit und Ernährung Inhalt der Ernährungs- und Themen-Befehle zum Starten und stoppen Fütterung integriert. Entschlüsseln die Verfahren für die Beschlussfassung rechtzeitig und moderate Hauptimplikationen trägt in unserem Verständnis der physiologischen und psychologischen Erkrankungen im Zusammenhang mit der Kontrolle Fütterung Fütterung. Robustere, einfach und quantitative Methoden sind erforderlich, um die Nahrungsaufnahme der Tiere nach experimentelle Manipulation, wie die zwangsweise Erhöhung der Aktivitäten von bestimmten Ziel-Neuronen zu messen. Hier führten wir ein Farbstoff-Kennzeichnung-basierte Fütterung Assays zur Erleichterung die neurogenetic Studie der Fütterung Kontrolle bei Erwachsenen Fruchtfliegen. Wir überprüfen zur Verfügung Fütterung Assays, und dann beschreiben unsere Methoden Schritt für Schritt von Setup zur Analyse, die thermogenetischen kombinieren und optogenetische Manipulation von Neuronen Steuern Fütterung Motivation mit Farbstoff-markierten Lebensmittel Aufnahme Assay. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen unserer Methoden, im Vergleich zu anderen Fütterung Assays, wählen Sie einen entsprechenden Assay Lesern helfen.

Thermogenetischen Bildschirm.
Abnorm gesteigerter Appetit führt zu erhöhter Nahrungsaufnahme, unabhängig von physiologischen Bedürfnissen. Wir nutzten diese Regelung zu einer Hochdurchsatz-design Verhaltens Bildschirm zu genetischen Griffe von Neuronen im Zusammenhang mit hunger und satt Staaten (Abbildung 1). Der Bildschirm hat Taotie-Gal424ergeben. Bei aktiviertem ...

Quantitative Nahrungsaufnahme Assays mit gefärbten Lebensmittel bieten eine robuste und Hochdurchsatz-Mittel zur Fütterung Motivation zu bewerten. Kombination des Lebensmittel Verbrauch Tests mit thermogenetischen und optogenetische Bildschirme ist ein leistungsfähiger Ansatz zu untersuchen, die neuronale Schaltkreise, die zugrunde liegenden Appetit bei Erwachsenen Drosophila Melanogaster.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nahrungsaufnahme adulter Drosophila quantitativ zu messen, was ein Mittel zur Bewertung der Auswirkungen genetischer Manipulationen wie thermogenetischer und optogenetischer Aktivierungen von Neuronen bietet. Diese Maßnahmen können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ernährung zu beantworten, wie z. B. die Neuromechanik von Hunger, Sättigung und Appetit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gleichzeitig die Nahrungsaufnahme mehrerer Fliegengruppen quantifiziert, was es besonders nützlich macht, abnormal fressende Fliegen in genetischen Screenings zu identifizieren.Sammeln Sie zunächst Vorräte, um den Außenbehälter vorzubereiten. Suspendieren Sie 0,5 Gramm Agarose und 50 Milliliter doppelt destilliertes Wasser. Unter häufigem Rühren erhitzen und auf einem Magnetrührer mit Heizplatte vollständig auflösen.Wenn die 1%Agarose auf etwa 60 Grad Celsius abgekühlt ist, geben Sie fünf Milliliter in einen leeren Außenbehälter und halten Sie den Behälter offen, bis die Agarose auf Raumtemperatur abgekühlt ist, um ein Agarose-Pad zu erhalten. Als nächstes fügen Sie 0,5 Gramm Agarose zu 50 Millilitern doppelt dest

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

Drosophila-Larven sind in der Lage, um Geruch Reize mit geschmackliche Belohnung assoziieren. Hier beschreiben wir eine einfache Verhaltensänderungen Paradigma, das die Analyse von appetitive assoziative olfaktorische Lernen ermöglicht.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Dieses Video beschreibt den Geschmackspräferenz-Assay, eine Verhaltensmethode, die verwendet wird, um die Anziehungskraft oder Vermeidung von farbigen Lösungen, die anders schmecken, zu messen, indem die Bauchfärbung der Fliege nach der Einnahme der bevorzugten Substanz bewertet wird. Das vorgestellte Protokoll demonstriert das Verfahren, mit dem die Präferenz von Fliegen für Lösungen mit unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen gemessen wird.

Geschmackspräferenz-Assay: Eine Methode zur Messung des Fressverhaltens bei Drosophila

Dieses Video beschreibt den CApillary FEeder oder CAFE-Assay, eine Verhaltensmethode, die die Nahrungsaufnahme und -präferenz von ungezügelten Fruchtfliegen misst. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie der Assay mit minimaler Verdunstung aus den flüssigkeitsgefüllten Kapillaren durchgeführt wird, die zur Abgabe der Nahrung und zur Verfolgung ihrer Aufnahme verwendet werden.

Der CApillary FEeder (CAFE) Assay: Eine Methode zur Verfolgung des Lebensmittelkonsums und der Präferenz bei Drosophila

In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in Drosophila

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion lohnend und nonrewarding Erfahrungen in Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) mit freiwilligen Ethanolkonsum als Maß für Änderungen in Lohn Staaten.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Der CApillary FEeder (CAFE) Assay ist eine einfache, budgetfreundliche und äußerst zuverlässige Methode zur Untersuchung von Mechanismen, die der Nahrungsaufnahme zugrunde liegen. In Verbindung mit dem vielseitigen genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster bietet es ein leistungsfähiges Mittel, um neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen der Nahrungsaufnahme zu gewinnen.

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Wir präsentieren ein Protokoll für einen Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten für Fliegen. Dieser Fütterungstest ist schnell und einfach zu betreiben und eignet sich nicht nur für kleine Laborforschung, sondern auch für Verhaltensbildschirme mit hohem Durchsatz bei Fliegen.

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila

Der Microplate-Feeder-Assay bietet eine wirtschaftliche Methode mit hohem Durchsatz zur Quantifizierung des Verbrauchs flüssiger Lebensmittel in Drosophila. Ein 3D-gedrucktes Gerät verbindet eine 96-Well-Mikroplatte, in der Fliegen untergebracht sind, mit einer 1536-Well-Mikroplatte, von der Fliegen eine Fütterungslösung mit einem Tracerfarbstoff verbrauchen. Der Volumenrückgang der Lösung wird spektralphotometrisch gemessen.

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Ein Calcium-Imaging-Ansatz ermöglicht die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten Reaktionen im Gehirn wacher Fliegen, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird. Primäre gustatorische Reaktionen in Drosophila melanogaster werden als Beispiel verwendet, aber dieses Protokoll kann angepasst werden, um nachgeschaltete Neuronen oder andere Spezies zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Lernen Sie quantitative Nahrungsaufnahme-Assays bei Drosophila melanogaster zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise des Appetits. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen mit thermogenetischer und optogenetischer Manipulation.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren (Video) | JoVE Journal

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

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