Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nahrungsaufnahme adulter Drosophila quantitativ zu messen, was ein Mittel zur Bewertung der Auswirkungen genetischer Manipulationen wie thermogenetischer und optogenetischer Aktivierungen von Neuronen bietet. Diese Maßnahmen können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ernährung zu beantworten, wie z. B. die Neuromechanik von Hunger, Sättigung und Appetit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gleichzeitig die Nahrungsaufnahme mehrerer Fliegengruppen quantifiziert, was es besonders nützlich macht, abnormal fressende Fliegen in genetischen Screenings zu identifizieren.

Sammeln Sie zunächst Vorräte, um den Außenbehälter vorzubereiten. Suspendieren Sie 0,5 Gramm Agarose und 50 Milliliter doppelt destilliertes Wasser. Unter häufigem Rühren erhitzen und auf einem Magnetrührer mit Heizplatte vollständig auflösen.

Wenn die 1%Agarose auf etwa 60 Grad Celsius abgekühlt ist, geben Sie fünf Milliliter in einen leeren Außenbehälter und halten Sie den Behälter offen, bis die Agarose auf Raumtemperatur abgekühlt ist, um ein Agarose-Pad zu erhalten. Als nächstes fügen Sie 0,5 Gramm Agarose zu 50 Millilitern doppelt destilliertem Wasser hinzu. Unter häufigem Rühren erhitzen und auf einem Magnetrührer mit Heizplatte vollständig auflösen.

Wenn die 1%Agarose auf etwa 60 Grad Celsius abgekühlt ist, fügen Sie der Agarose 1,71 Gramm Saccharose hinzu, um 100 Millimol Saccharose zu erhalten. Fügen Sie der Agaroselösung 0,25 Gramm blauen Farbstoff hinzu, um 0,5 % Gewicht pro Volumen gefärbtes gekennzeichnetes Lebensmittel zu erhalten. Bereiten Sie dann den Innenbehälter vor.

Stellen Sie die leeren Innenbehälter auf eine ebene horizontale Fläche. Geben Sie dann 750 Mikroliter mit blauem Farbstoff gekennzeichnete Lebensmittel in einzelne Lebensmittelbehälter. Mindestens fünf Minuten fest werden lassen.

Füllen Sie einen gefüllten Innenbehälter in einen vorbereiteten Außenbehälter und positionieren Sie ihn in der Mitte des Agarose-Pads. Bereiten Sie die Futterkammern mit farbstofffreiem Futter für die Hintergrundsubtraktion vor. Lassen Sie die Futterkammern 40 Minuten lang bei Raumtemperatur geöffnet, bis die Wand des Außenbehälters frei von Kondenswasser ist.

Vor Verhaltensexperimenten sollten die vorbereiteten Fütterungskammern zwei Stunden lang bei der Versuchstemperatur von 30 Grad Celsius äquilibriert werden, um sicherzustellen, dass die Temperatur in den Fütterungskammern relativ gleichmäßig ist. Um den Fütterungsprozess zu starten, werden 20 Fliegen vorsichtig durch leichtes Klopfen aus ihrem Heimfläschchen in eine vorgeheizte Futterkammer umgefüllt. Setzen Sie den Fütterungsvorgang bei 30 Grad Celsius für 60 Minuten fort.

Beenden Sie die Fütterung, indem Sie die Fütterungskammern 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Übertragen Sie vorsichtig 20 Fliegen aus einem Fläschchen in eine Fütterungskammer, indem Sie vorsichtig klopfen. Platzieren Sie dann die Kammer seitlich auf dem Beleuchtungssetup.

Verwenden Sie für die optogenetische Manipulation eine Anordnung orangefarbener LEDs als Quelle der Lichtstimulation und befestigen Sie eine horizontale Plexiglasplatte über den LEDs, um die Fütterungskammern während der Beleuchtung zu stützen. Bewahren Sie das Setup in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius und 60 % Luftfeuchtigkeit auf. Stimulieren Sie die genetische Kontrolle Fliegen parallel zu den Taotie-GAL4 UAS CsChrimson Fliegen, jedoch in unterschiedlichen Fütterungskammern.

Setzen Sie den Fütterungsvorgang 60 Minuten lang bei Hintergrundbeleuchtung durch das orangefarbene Licht fort. Anschließend frieren Sie die Futterkammern bei minus 80 Grad Celsius für 30 Minuten ein. Nachdem Sie die Fütterung beendet haben, gießen Sie alle 20 Fliegen aus der Fütterungskammer auf ein Stück Wiegepapier.

Übertragen Sie sie dann mit einer weichen Bürste in eine 1,5-Milliliter-Tube. Geben Sie 500 Mikroliter PBST in das Röhrchen und homogenisieren Sie die Fliegen mit einer Mahlmühle bei 60 Hertz für fünf Sekunden. Bestätigen Sie dann eine ausreichende Homogenisierung durch Beobachtung, wenn keine Fragmente von Körperteilen nachweisbar sind.

Drehen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 1300 U/min, um den Schmutz zu entfernen. Nach der Zentrifugation werden 100 Mikroliter Überstand in eine Vertiefung mit einer 96-Well-Platte überführt. Um Fehleinschätzungen von Absorptionsmitteln durch Schmutz zu vermeiden, nehmen Sie das verwendete Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und lassen Sie den Überstand vorsichtig fallen, ohne die Palette zu stören.

Nachdem alle Proben geladen sind, legen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät, um die Absorptionsmittel der Proben bei 630 Nanometern zu messen. Die Fressreaktion wurde quantifiziert, indem Fliegen visuell untersucht und mit nachweisbarem Farbstoff im Darm bewertet wurden. Nach Aktivierung der Taotie-Neuronen zeigten etwa 58% der Taotie dTRPA1-Fliegen ein starkes Fressverhalten.

Und 23 % von ihnen zeigten ein leichtes Fressverhalten. Akut aktivierte Taotie-GAL4-Neuronen durch TRPA1 erhöhten die Nahrungsaufnahme dramatisch, was darauf hindeutet, dass die Taotie-GAL4-markierten Neuronen an der Regulation der Nahrungsaufnahme adulter Drosophila beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Menge der Nahrungsaufnahme nach Manipulation der Aktivität von Neuronen quantifizieren können, um die neurologischen Mechanismen der Fütterungskontrolle bei adulten Drosophila melanogaster zu untersuchen.