Eine Kokulturen Methode zu untersuchen, das Übersprechen zwischen den x-ray bestrahlten Caco-2 Zellen und PBMC

Das übergeordnete Ziel dieses Kokulturprotokolls ist es, die Auswirkungen ionisierender Strahlung auf die Permeabilität der Caco-2-Epithelzell-Monoschicht und die Tight-Junction-Funktion in Gegenwart oder Abwesenheit von mononukleären Zellen des peripheren Blutes zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Strahlenbiologie und Radioimmuntherapie über mögliche synergistische Effekte zwischen ionisierender Strahlenbelastung und Immunzellfunktionen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass verschiedene Stimuli und Zellpopulationen getestet und beobachtete Phänomene durch ergänzende Ad-hoc-Messungen entkoppelt werden können.

Das Bestrahlungsverfahren zielt darauf ab, die Caco-2-Zell-Monoschicht zu berücksichtigen, da das Tumorvolumen mit dem entsprechenden Strahl und einer genauen Dosimetrie bestrahlt wird, wie es bei der Strahlentherapie im Patienten der Fall ist. Eine Woche vor ihrer Bestrahlung fünf mal 10 bis fünfte Caco-2-Zellen in zwei Milliliter vollständiges Medium in eine sterile Zellkultur mit einem Mikrometer Porendurchmesser pro Well in eine sechs Well-Zellkulturplatte einsetzen. Geben Sie drei Milliliter frisches Komplettmedium in das untere Fach jeder Vertiefung und legen Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Co2 in einen befeuchteten Zellkultur-Inkubator.

Am letzten Tag der Inkubation geben Sie 25 Milliliter Ficoll in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Und legen Sie vorsichtig 25 Milliliter frisch gewonnenes Vollblut über das Ficoll. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation.

Und verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder PBMC an der Grenzfläche in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie dann das isolierte PBMC in zwei 10 Milliliter PBS-Wäschen. Und kultivieren Sie das PBMC in frischem Komplettmedium für nicht mehr als drei bis fünf Stunden im Zellkultur-Inkubator.

Stellen Sie die Röntgenenergie des Photons auf einen Peak von sechs Megavolt ein. Und platzieren Sie die Caco-2-Zellkultur auf einer 1,4 Zentimeter dicken Plexiglasscheibe innerhalb der Flugbahn der Röntgenstrahlen und 100 Zentimeter von der Strahlungsquelle entfernt. Platzieren Sie dann einen 0,57 Zentimeter dicken Bolus auf jeder Probe, um das Gleichgewicht zwischen der rückgestreuten Strahlungskomponente und den geladenen Teilchen zu gewährleisten.

Und verwenden Sie ein flaches und symmetrisches Strahlungsfeld von 20 x 20 Quadratzentimetern und eine Dosisleistung von drei Grautönen pro Minute, um die Zellen zu bestrahlen. Um die metabolische Aktivität und Lebensfähigkeit von Caco-2-Zellen zu beurteilen, säen Sie 24 Stunden vor ihrer Bestrahlung zwei mal 10 bis fünfte Caco-2-Zellen in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte in 1,25 Millilitern vollständigem Medium aus. Anschließend werden die Zellen für 21 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurückgestellt.

Am nächsten Tag geben Sie 100 Mikroliter mit fünf Milligramm MTT-Lösung pro Milliliter in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen weitere drei Stunden lang. Nachdem Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, geben Sie 500 Mikroliter Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung, um alle von den Caco-2-Zellen freigesetzten Formazankristalle aufzulösen, und bewerten Sie die Absorption mit einem Multi-Well-Platten-Reader bei einem Lambda von 570 Nanometern. Um die Lebensfähigkeit der Caco-2-Zellen zu beurteilen, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS pro Vertiefung, gefolgt von einer Ablösung der Zellen mit 100 Mikrolitern Trypsin-EDTA-Lösung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Stoppen Sie die Reaktion mit 500 Mikrolitern vollständigem Medium und überführen Sie die Zellen zur Zentrifugation in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern PBS pro Röhrchen und mischen Sie die resultierenden Zellsuspensionen mit einem gleichen Volumen Trypanblau-Viabilitätsfarbstofflösung. Zählen Sie nach drei Minuten bei Raumtemperatur die Anzahl der lebensfähigen ungefärbten und nicht lebensfähigen gefärbten Zellen im Hämozytometer.

Um den transepithelialen elektrischen Widerstand oder TEER der Caco-2-Zellen zu beurteilen, wird unmittelbar nach der Bestrahlung die Hälfte der Caco-2-Zellkulturinserts in eine neue Platte mit drei Millilitern frischem vollständigem Medium in jeder Vertiefung und die Hälfte der Insertkulturen in eine neue Platte übertragen, die mit zwei mal 10 bis dem sechsten PBMC pro drei Milliliter vollständigem Medium pro Well besiedelt ist. Legen Sie dann in den ersten sechs Stunden stündlich und dann alle drei Stunden bis 48 Stunden nach der Bestrahlung eine TEER-Essstäbchenelektrode in den Zellkultureinsatz. Für die Western-Blot-Analyse werden Caco-2-Zellen und PBMC 48 Stunden nach ihrer Bestrahlung mit 40 Mikrolitern pro einmal 10 Zellen auf die sechste Zelllysepuffer lysiert.

Beim Lysieren und Schaben der Caco-2-Zellen ist darauf zu achten, dass sich die poröse Membran nicht vom Einsatz löst, da dies zu einem Verlust von Zelllysat und einem verzerrten Ergebnis führen kann. Lagern Sie die lysierten Zellproben bei minus 20 Grad Celsius. Nach Quantifizierung der Gesamtproteinmenge in jeder Zelllyseprobe durch die Bicinchoninsäure-Methode werden jeder Gesamtproteinprobe in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen gleiche Volumina Laemmli-Probenpuffer, ergänzt mit Beta-Mercaptoethanol, zugegeben.

Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Sammeln Sie dann die denaturierten Proteine durch Zentrifugation und laden Sie das gleiche Gesamtproteinvolumen aus jeder Probe in ein vier bis 20 % vorgefertigtes Gel. Lassen Sie die Proben eine Stunde lang bei 120 Volt laufen.

Verwenden Sie dann ein halbtrockenes elektrisches Transfersystem, um die Proteine auf eine Polyvinylidenfluoridmembran zu übertragen. Legen Sie dann die Membran in einen Behälter und verstopfen Sie die unspezifischen Bindungsstellen mit 5 % fettfreier Trockenmilch in PBS, die mit 0,2 % Tween 20 für 60 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren ergänzt wurde. Am Ende der Blockinkubation waschen Sie die Membran dreimal mit 10 Millilitern 0,2 %PBS Tween 20 für fünf Minuten pro Waschgang und markieren Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren mit den entsprechenden Primärantikörpern von Interesse.

Nach der Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren wird die Membran dreimal mit 0,2 %PBS Tween 20 gewaschen, wie gerade gezeigt, und die Membran mit den entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern 60 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Nach drei PBS-Waschgängen inkubieren Sie die Membran mit einem verbesserten Chemilumineszenzlösungskit. Anschließend wird der resultierende Film mit einem geeigneten Scansystem abgebildet und die Ergebnisse mit einem geeigneten Bildanalyseprogramm quantifiziert.

Eine Bestrahlung von bis zu 10 Grays verändert die Stoffwechselaktivität der Caco-2-Zellen 24 oder 48 Stunden nach der Bestrahlung nicht, obwohl die Lebensfähigkeit der Zellen bei beiden Dosen mit der Zeit abnimmt. Die TEER-Bewertung von nicht kokultivierten Caco-2-Zellen nach Exposition gegenüber zwei Grautönen Bestrahlung zeigt konsistente TEER-Werte bis zu 48 Stunden nach der Bestrahlung. Nach 10 Grautönen Bestrahlung zeigen die Zellen jedoch eine anhaltende Abnahme der TEER, die drei Stunden nach der Bestrahlung beginnt.

Die Kokultur mit PBMCs führt zu einer Reduktion des TEER, die von drei Stunden nach der Bestrahlung bei beiden Dosen bis 30 Stunden nach der Bestrahlung offensichtlich ist, wobei die TEER-Werte zu diesem Zeitpunkt relativ konstant zu bleiben scheinen. Die Western-Blot-Analyse von Tight-Junction-Proteinen zeigt keine Unterschiede in der Claudin-1- oder Occludin-Expression als Reaktion auf Bestrahlung und/oder PBMC-Kokultur, während bei verschiedenen Gerüstproteinen große Fluktuationen beobachtet werden. Darüber hinaus wird das NF-Kappa B-Gesamtprotein bei keiner der Bestrahlungsdosen beeinflusst, während die XIAP-Proteinspiegel bei beiden Dosen um das Vierfache hochreguliert werden.

Mit diesem Verfahren können weitere biologische Stimuli wie Enterobakterien hinzugefügt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie verschiedene biologische Reize die Reaktion der guten Monoschicht auf ionisierende Strahlung modifizieren können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Einfluss von ionisierender Strahlung und Immunzellen auf die Permeabilität von Caco-2-Zellen und die Expression von Tight-Junction-Komplexen messen kann.