$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Enzyme sind biochemische Katalysatoren, die für das Leben unerlässlich sind. Enzymassays werden verwendet, um die kinetischen Eigenschaften enzymatischer Reaktionen zu untersuchen und die katalytische Wirkung von Enzymen aufzuklären. Dieses Video behandelt die Enzymkinetik und Assays, geht auf ein allgemeines Verfahren ein und zeigt einige Anwendungen.
Enzyme sind Proteine oder seltener RNAs, die auf einen bestimmten Reaktanten einwirken, der als Substrat bezeichnet wird. Ein Enzym reduziert die Aktivierungsenergie, die benötigt wird, um eine biochemische Reaktion in Gang zu setzen, wodurch die Reaktion schneller abläuft.
Enzymatische Reaktionen lassen sich in drei elementare Komponenten zerlegen. Die erste ist die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes, der durch die Bindung des Substrats an das aktive Zentrum des Enzyms gebildet wird. Der Komplex kann sich in seine ursprünglichen Bestandteile zersetzen. Das ist die zweite elementare Reaktion. Alternativ kann der Komplex das Produkt bilden und das Enzym zurückgewinnen, die dritte Elementarreaktion.
Die Kinetik einer Elementarreaktion ist durch die Elementargeschwindigkeitsgesetzgleichung gegeben. Gleichungen des Geschwindigkeitsgesetzes geben die Geschwindigkeit in Bezug auf die Konzentration der Reaktanten und eine Geschwindigkeitskonstante an. Jede der Elementarreaktionen hat eine individuelle Geschwindigkeitsgesetzgleichung mit einer eigenen Geschwindigkeitskonstante. Diese Gleichungen können auf ein kinetisches Modell reduziert werden, das als Michaelis-Menten-Gleichung bekannt ist. Daraus ergibt sich die Reaktionsgeschwindigkeit in Bezug auf die Substratkonzentration; die experimentell bestimmt werden können. Einige allgemeine Trends für Enzymreaktionen können mit Hilfe der Michaelis-Menten-Gleichung identifiziert werden. Bei hoher Substratkonzentration wird ein Sättigungspunkt erreicht, der als Vmax bezeichnet wird. Hier ist die Geschwindigkeit durch die Gesamtenzymkonzentration und die Anzahl der Substratmoleküle begrenzt, die ein Enzym pro gegebener Zeit in ein Produkt umwandelt, auch bekannt als kcat. In der Michaelis-Menten-Kinetik ist kcat eine der beiden Konstanten, die die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen. Die andere Konstante, KM, wird als Affinitätskonstante bezeichnet. KM ist auch äquivalent zu der Konzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit einem halben Vmax entspricht. Ein Enzym mit einer höheren Affinität hat eine niedrigere KM und erreicht Vmax schneller, während ein Enzym mit niedrigerer Affinität eine höhere KM hat und länger braucht, um Vmax zu erreichen. Die Kenntnis von kcat und KM ermöglicht den Vergleich von Enzymen. Um dies zu erreichen, verwenden wir ein Verhältnis, das als Enzymeffizienz bezeichnet wird. Höhere kcat und niedrigere KM führen zu höheren Wirkungsgraden, während niedrigere kcat und höhere KM zu niedrigeren Wirkungsgraden führen.
Die Faktoren, die zur Aufklärung der Enzymkinetik herangezogen werden, müssen experimentell bestimmt werden. Diese Assays werden in der Regel durch Mischen eines Enzyms und einer Substratlösung in einer kontrollierten Umgebung durchgeführt. Die Beobachtungen erfolgen durch Messung der Konzentrationsänderungen des Substrats, des Produkts oder der Nebenprodukte in Bezug auf die Zeit.
Die Änderung der Konzentration über die Zeit wird zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit verwendet. Um die Kinetik zu bestimmen, müssen Geschwindigkeitsdaten bei mehreren Konzentrationen erhalten werden. Wenn ein Diagramm der inversen Anfangsrate im Vergleich zur inversen Anfangskonzentration, bekannt als das Lineweaver-Burk-Diagramm, linear ist, folgt die Reaktion der Michaelis-Menten-Kinetik. Die Steigung und der Schnittpunkt der Linie ermöglichen die Bestimmung der kinetischen Parameter KM und Vmax, die dann zur Berechnung von kcat und der Enzymeffizienz verwendet werden können.
Nachdem nun die Prinzipien der Enzymkinetik besprochen wurden, schauen wir uns an, wie ein typischer Enzymassay durchgeführt wird.
In diesem Verfahren wird ein kolorimetrischer Assay demonstriert. ? Der erste Schritt besteht darin, eine Standardkurve zu erstellen, die die Absorption mit der Substratkonzentration korreliert. Lösungen bekannter Konzentration werden zusammen mit einer Kontrollprobe hergestellt. Eine Entwicklerlösung, die mit dem Substrat reagiert, wird zugegeben, um eine farbige Verbindung herzustellen. Die Absorption wird gemessen und gegen die Konzentration aufgetragen, um die Standardkurve zu erstellen.
Um den Assay durchzuführen, wird eine bekannte Konzentration des Substrats zusammen mit der entsprechenden Menge an Enzym hergestellt. Das Enzym und das Substrat werden gemischt und für ein festgelegtes Zeitintervall inkubiert. pH-Wert und Temperatur werden mit Pufferlösungen und Heizblöcken geregelt. Ein Abschreckungsmittel wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Entwicklerlösung wird dann zu den Reaktionen hinzugefügt und gemischt. Die Lösungen werden dann in Küvetten gegeben und die Absorption gemessen. Die Menge des verbrauchten Substrats wird durch den Vergleich der gemessenen Extinktion mit der Standardkurve bestimmt. Anhand der gesammelten Daten werden die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten bestimmt, indem die Konzentration über die Zeit aufgetragen wird. Schließlich wird mit den Ratendaten und der Konzentration das Michaelis-Menten-Diagramm erstellt. Dies ermöglicht die Bestimmung kinetischer Eigenschaften für das Enzym wie z.B. die Umsatzzahl und die Enzymeffizienz.
Nachdem wir nun ein Assay-Verfahren überprüft haben, schauen wir uns andere Möglichkeiten und Anwendungen an, wie Assays durchgeführt werden.
Bei diesem Verfahren wird die FRET-Analyse verwendet, um die Kinetik einer Protease zu untersuchen, die eine Peptidbindung eines Proteins hydrolysiert. Diese Emissionen können gemessen werden, was eine kontinuierliche und quantitative Analyse des Substratverbrauchs und der Produktion ermöglicht, was bei der Bestimmung der Reaktionskinetik hilft.
Enzymassays können in der Umweltwissenschaft verwendet werden, um das Ausmaß der extrazellulären Enzymaktivität in der Umwelt zu bestimmen. Wässer, Böden und Sedimente können aus der Umwelt gewonnen und im Labor aufbereitet werden. Die extrazelluläre enzymatische Aktivität dieser Materialien kann dann mit Hilfe von Enzymassays charakterisiert werden. Dies ist ein nützliches Werkzeug, um zu verstehen, wie die Umwelt organisches Material verarbeitet.
Der DNA-Reparaturmechanismus einer Zelle kann durch die Untersuchung der Kinetik von Enzymen im Zellkern bewertet werden. Die Geschwindigkeit, mit der ein Enzym DNA-Läsionen oder -Schäden entfernt, kann mit fluoreszierenden molekularen Leuchtfeuern gemessen werden, die nur fluoreszieren, wenn sie an einzigartige DNA-Sequenzen gebunden sind. Der Grad der DNA-Reparatur kann in Echtzeit gemessen werden, indem die fluoreszenzmarkierten Spaltprodukte detektiert werden.
Sie haben gerade das Video von JoVE über Enzymkinetik und Assays gesehen. Dieses Video erklärte die Enzymkinetik, behandelte Assay-Konzepte, ging auf ein allgemeines Verfahren ein und beschrieb einige Anwendungen.
Danke fürs Zuschauen!
