Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

Das übergeordnete Ziel dieses modifizierten Verfahrens ist es, die chimäre Produktion zu steigern, ohne dass zusätzliche Kosten oder lange Einarbeitungszeiten anfallen. Diese Methode kann Laboren helfen, die Produktion von Chimären effizienter zu gestalten, insbesondere in Fällen, in denen die ES-Zellen nicht optimal sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine zusätzliche Ausrüstung und keine spezielle Ausbildung erfordert.

Vorgeführt wird das Verfahren heute von Thomas Hagler. Er ist Biologe und Doktorand und arbeitet im Kernlabor. Um die Embryonen zu entnehmen, tupfen Sie die Gebärmutter auf ein Laborgewebe, um das überschüssige Blut zu entfernen, und legen Sie das Organ in eine neue 60-Millimeter-Schale unter einem Präpariermikroskop mit geringer Vergrößerung.

Führen Sie mit einer Präparierzange, um die Gebärmutter vorsichtig und sanft in der Nähe des Eileiters zu halten, eine 25-Gauge-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze mit 10 Millilitern Blastensammelmedium befestigt ist, in die Mitte der Gebärmutter direkt hinter den Spitzen der Pinzette in einer möglichst parallelen Ebene ein. Üben Sie Druck auf die Pinzette aus, um die Nadel in der Gebärmutter zu fixieren, und spülen Sie vorsichtig etwa einen Milliliter Medium durch das Gebärmutterhorn. Wenn alle Blastozysten ausgestoßen wurden, bauen Sie die Mundpipettenapparatur zusammen und übertragen Sie die einzelnen Embryonen mit der Mundpipette in einzelne Tropfen des Blastensammelmediums in eine zweite 60-Millimeter-Schale.

Waschen Sie dann jeden Embryo in einem zweiten Tropfen Blast-Sammelmedium und geben Sie die Embryonen bis zu ihrer Injektion in eine Vier-Well-Schale. Verwenden Sie zunächst einen Mikroinjektor, um ein Vakuum auf die Injektionsnadel auszuüben. Stellen Sie eine Schale mit ES-Zellen unter das Injektionsmikroskop, an dem die Injektionsnadel und die Pipette des Embryohalters befestigt sind.

Für den Erfolg der Injektion ist es unerlässlich, sich die Zeit zu nehmen, das Mikroskop richtig einzurichten. Dazu gehören die richtige Menge an Medien in der Nadel und die korrekte Ausrichtung der z-Achse. Verwenden Sie einen Mikroinjektor, um ein Vakuum auf die Injektionsnadel auszuüben.

Lassen Sie so wenig Platz wie möglich zwischen den Zellen und ziehen Sie kleine bis mittelgroße embryonale Zellen mit glatter Oberfläche ohne offensichtliche Defekte aus der Schale der Embryonen ein. Nachdem Sie mindestens 15 Zellen entnommen haben, positionieren Sie einen Embryo in der Nähe der Öffnung des Halters. Wenden Sie ein Vakuum an, um den Embryo an der Halterung zu befestigen, und bewegen Sie die Haltepipette nach oben oder unten, um die z-Achse einzustellen, bis der Embryo nur noch den Objektträger berührt.

Fokussieren Sie fein auf die Zone der Pellucida und stellen Sie die z-Achse der Injektionsnadel ein, bis die embryonalen Zellen in der Nähe der Nadelspitze scharf sind. Verwenden Sie bei Bedarf die Injektionsnadel, um die Blastozyste vorsichtig zu rollen, bis sich die innere Zellmasse in der für die Injektion geeigneten Position befindet. Führen Sie die Injektionsnadel mit einem festen, aber kontrollierten Druck durch die Zone der Pellucida in die innere Zellmasse ein und üben Sie einen leichten Druck auf den Mikroinjektor der Injektionsnadel aus, um den Kollaps des Blastocoele zu verhindern.

Sobald die Nadel in die Blastocoele eingedrungen ist, üben Sie Druck auf den Mikroinjektor aus, um alle embryonalen Stammzellen in den Embryo zu übertragen, und halten Sie kurz inne, wenn die Abschrägung der Nadel beginnt, den Embryo zu verlassen, damit sich der Druck im Embryo wieder normalisieren kann, während die Zellen weiterhin erhalten bleiben. Wenn alle Blastozysten injiziert wurden, verwenden Sie ein nicht-chirurgisches Embryotransfergerät, um die Embryonen gemäß den Anweisungen des Herstellers an Schweizer Webster-Mäuse im Embryonalstadium 2.5 zu liefern, und halten Sie die Mäuse nach jedem Transfer durch die Entbindung und die anschließende Entwöhnung einzeln unter. In diesem repräsentativen Experiment waren die Trächtigkeitsraten zwischen der injizierten transinneren Zellmasse und den traditionell injizierten Kontrollgruppen unverändert, und eine gleiche Anzahl von Jungtieren überlebte bis zur Entwöhnung aus jeder Gruppe.

Bemerkenswert ist, dass, während die Anzahl der Mäuse bei der Entwöhnung unverändert blieb, eine signifikant höhere Anzahl von Jungtieren aus der Gruppe mit transinnerer Zellmasse im Vergleich zur injizierten Kontrollgruppe einen Chimärismus in der Fellfarbe aufwies. Das Beste an dieser Technik ist, dass sie nur eine einfache Änderung der Ausrichtung des Embryos erfordert, um eine größere Produktion in Chimären zu ermöglichen. Die richtige Einrichtung des Mikroskops ist unerlässlich.

Wenn das Mikroskop und die Manipulatoren nicht richtig eingerichtet und gut gewartet werden, funktioniert der Injektionsprozess nicht. Wenn Sie neu in der Embryoneninjektion sind, ist Wiederholung der einzige Weg, um zu lernen. Für Anfänger ist die Handhabung des Embryos in der Regel der schwierigste Teil des Verfahrens.

In der Lage zu sein, Embryonen effizient von einer Schale zur anderen zu transportieren, ohne welche zu verlieren, ist der wichtigste Teil des Experiments. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine einfache Änderung Ihrer Standard-Injektionstechnik Ihnen helfen kann, die Chimärenproduktion effizienter zu gestalten.