4.14: Förster Resonance Energietransfer (FRET)

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein Phänomen, das zur Untersuchung biochemischer Wechselwirkungen im Nahbereich verwendet wird. Bei FRET kann ein Photolumineszenzmolekül eines Donors Energie nicht strahlend auf ein Akzeptormolekül übertragen, wenn sich ihre jeweiligen Emissions- und Absorptionsspektren überlappen. Die Menge der übertragenen Energie – und damit die Gesamtemission der Probe – hängt von der Nähe eines Akzeptor-Donor-Paares aus photolumineszierenden Molekülen ab. Die FRET-Analyse wird mit anderen biochemischen Techniken kombiniert, um detaillierte Informationen über biomolekulare Strukturen und Wechselwirkungen von diesem "spektroskopischen Lineal" zu erhalten.

Dieses Video behandelt die Prinzipien und Konzepte der FRET-Analyse. Das Verfahren konzentriert sich auf die Vorbereitung von Proben für FRET und Möglichkeiten zur Präsentation und Interpretation von Daten. Zu den Anwendungen gehören schließlich die Überwachung von Konformations- und zellulären Prozessen durch die Markierung von Teilen einer Zelle oder eines Proteins, die Überwachung von Enzymreaktionen, die Proteinstrukturen verändern, und die Verwendung von FRET zur Überwachung der Aggregation von Monomeren, die von Zellen exprimiert werden.

Der erste Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein nicht-strahlender Energietransfer zwischen lichtemittierenden Molekülen und wird häufig zur Untersuchung biochemischer Wechselwirkungen im Nahbereich verwendet. FRET tritt nur auf, wenn fluoreszierende Moleküle innerhalb von 10 nm voneinander entfernt sind. Die FRET-Analyse kann mit anderen Techniken kombiniert werden, um detaillierte Strukturinformationen zu erhalten. In diesem Video werden die zugrundeliegenden Prinzipien von FRET vorgestellt, ein Protokoll und eine Datenpräsentation zusammengefasst und einige biochemische Anwendungen diskutiert.

Ein photolumineszierendes Molekül wie ein Fluorophor wird angeregt, indem es elektromagnetische Strahlung bei einer Wellenlänge in seinem Absorptionsspektrum absorbiert. Wenn es sich entspannt, emittiert es Licht mit einer Wellenlänge innerhalb seines Emissionsspektrums. Weitere Informationen zur Fluoreszenz finden Sie im Video zur Fluoreszenzmikroskopie von JoVE. Unterschiedliche Fluorophore absorbieren und emittieren Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen, die sich häufig überlappen. Überschneidet sich das Emissionsspektrum eines Fluorophors signifikant mit dem Absorptionsspektrum eines anderen Fluorophors, so wird der ?Donor? setzt ein virtuelles Photon frei, das vom "Akzeptor" absorbiert wird. Wenn sich ein angeregter Donor innerhalb von 10 nm von einem Akzeptor befindet, wird Energie durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen vom Donor zum Akzeptor übertragen. Die Freisetzung von Energie durch Emission von Licht aus dem Donor nimmt entsprechend ab. Währenddessen emittiert der angeregte Akzeptor Licht bei seiner Emissionswellenlänge. Die FRET-Reaktion wird in Bezug auf den Wirkungsgrad bewertet, d. h. den Prozentsatz der Energie, die vom Donor durch FRET und nicht durch Fluoreszenz oder andere Strahlungsprozesse freigesetzt wird. Die Effizienz hängt stark vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor ab, wodurch FRET als "molekulares" oder "spektroskopisches" Lineal fungieren kann.

In der Biochemie wird FRET häufig qualitativ verwendet, um Konformationsänderungen in Molekülen zu beobachten, indem Fluorophore überwacht werden, während sie sich in und aus dem FRET-Bereich voneinander bewegen. In ähnlicher Weise können zelluläre Funktionen mit Molekülen untersucht werden, die ein FRET-Paar enthalten. Wenn das markierte Molekül durch Enzymaktivität gespalten wird, stoppt FRET und die beobachtete Fluoreszenzwellenlänge ändert sich.

Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter FRET verstanden haben, sehen wir uns einen Überblick über ein Protokoll und einige Möglichkeiten zur Darstellung und Interpretation der Daten an.

Vor dem Experiment werden die Biomoleküle von Interesse, typischerweise DNA oder Proteine, mit Hilfe molekularbiologischer Techniken mit fluoreszierenden Markierungen versehen. Gängige Methoden, um das veränderte genetische Material in die Zellen einzubringen, sind Transfektion und Elektroporation.

Anschließend werden die Zellen für die FRET-Visualisierung an einem Fluoreszenzmikroskop vorbereitet. Zum Beispiel können die Moleküle auf einem Objektträger für Einzelmolekül-FRET immobilisiert werden, oder Proben werden für das Hochdurchsatz-Screening in Wells geladen.

Dann werden die Anregungslaser, das Mikroskop und die zugehörige Ausrüstung vorbereitet. (A) FRET-Experimente beinhalten oft leistungsstarke Laser; (B) daher sollten geeignete PSA und Sicherheitsverfahren verwendet werden. Anschließend wird die Probe in das Gerät eingelegt und mit dem Anregungslaser beleuchtet.

Für Experimente zur Überwachung des Zellverhaltens werden Farbbilder verwendet, die Unterschiede oder Änderungen der Emissionsintensität zeigen. Die Emissionsintensitäten von Donoren und Akzeptoren werden zusammen aufgetragen, um die FRET-Reaktion über die Zeit zu verfolgen.

Die FRET-Daten können auch an verschiedene Funktionen angepasst werden, um komplexere Analysen zu ermöglichen. Je nach Experiment können die Daten auf verschiedene Arten dargestellt werden, um die Ergebnisse bestmöglich darzustellen, was FRET zu einem flexiblen experimentellen Werkzeug macht.

Nachdem Sie nun mit den Grundlagen der Durchführung und Analyse eines FRET-Experiments vertraut sind, schauen wir uns einige Anwendungen von FRET in der biochemischen Forschung an.

FRET kann verwendet werden, um Konformationsänderungen oder zelluläre Prozesse zu untersuchen, indem Teile des Proteins oder der Zelle, die sich voraussichtlich innerhalb von 10 nm voneinander bewegen, mit einem FRET-Paar markiert werden. Zum Beispiel werden Proteinsensoren hergestellt, indem Rezeptoren mit einem Paar Fluorophoren markiert werden. Die FRET-Reaktion wird live durch konfokale Mikroskopie überwacht. Variationen der Emissionswellenlänge und -intensität deuten auf Konformationsänderungen hin.

FRET kann auch verwendet werden, indem Moleküle mit einem aktiven FRET-Paar präpariert und Veränderungen in der Reaktion beobachtet werden. Wenn das Substrat gespalten wird, wird FRET gestört, was zu einer Erhöhung der Donoremission und einer Abnahme der Akzeptoremission führt. Die Emissionen werden analysiert, um die Beiträge von Spender, Akzeptor und FRET zu bestimmen. Sobald die direkten Emissionsfaktoren für die cyan und gelb fluoreszierenden Proteine berechnet sind, können die Konzentration und die kinetischen Parameter des Substrats bestimmt werden.

Zellen, die für die Expression von Monomeren ausgelegt sind, die eines FRET-Paares enthalten, fungieren als "Sensoren" für Wechselwirkungen zwischen diesen Monomeren. Wenn die Aggregation dieser Monomere induziert wird, wird eine FRET-Reaktion beobachtet. Dies kann genutzt werden, um die Proteinaggregation zu untersuchen, die durch das "Seeding" von fehlgefalteten Proteinen ausgelöst wird. Hier wurden Zellen mit Aggregaten des interessierenden Proteins transduziert, inkubiert und mit Durchflusszytometrie analysiert.

Sie haben gerade das Video von JoVE über den ersten Resonanz-Energietransfer (FRET) gesehen. Dieses Video enthielt die zugrundeliegenden Prinzipien der FRET, die Vorbereitung und Analyse eines FRET-Experiments und einige biochemische Anwendungen.

Danke fürs Zuschauen!