Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien

Es besteht ein großer Bedarf an praktischen Werkzeugen zur Erzeugung von Merkmalen und Objekten im Nanometerbereich, insbesondere bei der Untersuchung biologischer Wechselwirkungen mit nanostrukturierten Materialien und Oberflächen. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und homogene Replikation von Proteinarrays über Zentimeterbereiche mit nanoskaliger Auflösung. Dies ermöglicht es uns, die Wechselwirkungen mit mesenchymalen Stammzellen auf diesen Oberflächen zu untersuchen.

Diese Modelloberflächen ermöglichen es uns, kontrollierte Wechselwirkungen zwischen spezifischen Materialvariablen und mesenchymalen Stammzellen zu untersuchen, und liefern grundlegende Kriterien für das Materialdesign, die zukünftige Biomaterialdesigns beeinflussen werden. Zu Beginn des Verfahrens mischen Sie die Bestandteile des PDMS-Prepolymers gründlich in einer Waage. Entgasen Sie das Gemisch in einem Vakuumexsikkator für 20 Minuten oder bis alle Gasblasen verschwunden sind.

Platzieren Sie dann den Silizium-Master für das PPL-Array in einer vier Zentimeter großen Petrischale. Gießen Sie die entgaste PDMS-Prepolymermischung über den Master, bis er vollständig bedeckt ist. Entgasen Sie das PDMS, das den Master abdeckt, für weitere fünf Minuten.

Während der Entgasung wird ein Objektträger eine Minute lang mit Sauerstoffplasma behandelt. Legen Sie den Objektträger nach dem Entgasen vorsichtig mit der behandelten Seite nach unten auf das PDMS. Drücken Sie den Objektträger vorsichtig auf den Silikonmaster, um eingeschlossene Luft zu entfernen und sicherzustellen, dass eine gleichmäßige PDMS-Schicht zwischen dem Master und dem Objektträger liegt.

Übertragen Sie das sandwichierte PDMS-Array in eine andere Petrischale, wobei sich der Silizium-Master auf der Unterseite befindet. Härten Sie das PDMS in einem Ofen bei 70 bis 80 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden aus. Nehmen Sie dann das ausgehärtete PPL-Array aus dem Ofen und lassen Sie es 15 Minuten abkühlen.

Verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges PDMS vorsichtig von der Rückseite und den Seiten des Objektträgers abzuschneiden. Blasen Sie lose PDMS-Ablagerungen mit einem Strom trockenen Stickstoffgases weg. Es ist wichtig, überschüssiges PDMS von der Rückseite und den Rändern des Arrays zu kürzen, um eine genaue Ausrichtung zu ermöglichen.

Dies hilft dem Anwender auch, die Bedingungen der Sonden unter dem AFM während der Lithographie besser zu beobachten. Klemmen Sie eine Rasierklinge in einer Tiefe von einem Millimeter in die Ecke des Arrays und hebeln Sie das Array vorsichtig in einer einzigen, kontinuierlichen Hebebewegung aus dem Silizium-Master. Schneiden und kratzen Sie dann vorsichtig 0,5 Millimeter des PDMS an den Rändern des Arrays mit einer Rasierklinge ab.

Benutzer sollten sehr vorsichtig sein, wenn sie die Arrays vom Master lösen, um eine gute Trennung zu gewährleisten und eine Beschädigung der Sonden zu vermeiden. Dies sollte in einer einzigen, reibungslosen Aktion erfolgen, ohne dass die Arrays auf den Silizium-Master zurückfallen. Behandeln Sie das PPL-Array 30 Sekunden lang mit Sauerstoffplasmid und lassen Sie dann 20 Mikroliter deionisiertes Wasser auf die Array-Oberfläche fallen.

Wenn sich das Wasser nicht gleichmäßig über das gesamte Array verteilt, wiederholen Sie die Plasmabehandlung. Trocknen Sie das plasmabehandelte Array gründlich und befestigen Sie es dann mit doppelseitigem Kohleband an der Halterung der Rasterkraftmikroskopie-Sonde. Montieren Sie den Sondenhalter auf dem kinematischen AFM-Halter.

Um das Array einzufärben, tragen Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen einer 1-millimolaren MHA-Lösung in Ethanol auf das Array auf, wobei Sie den Kontakt zwischen der Pipettenspitze und der Array-Oberfläche vermeiden. Lassen Sie die MHA-Lösung im gesamten Array verteilen. Warten Sie, bis das Ethanol verdampft ist.

Montieren Sie den Sondenhalter mit dem PPL-Array auf dem AFM und platzieren Sie dann ein Goldsubstrat in der Mitte des AFM-Probentisches. Fixieren Sie den Untergrund mit Klebeband. Um mit der Ausrichtung zu beginnen, führen Sie das Setup-Programm des Bühnencontrollers aus, um alle Achsen und Winkel auf einen vorkalibrierten Nullpunkt zurückzusetzen.

Verwenden Sie die Steuerkonsole der X- und Y-Achse des AFM-Probentisches, um das Substrat an die gewünschte Druckposition zu bewegen. Schalten Sie den Entriegelungshebel des Tisches um, um den Probentisch freizugeben und die Kraftsensoren zu aktivieren. Lassen Sie die Sensoren mindestens 15 Minuten lang äquilibrieren, und verwenden Sie dann den Z-Achsen-Controller, um den Probentisch anzuheben, bis das Array visuell so nah wie möglich am Substrat ist.

Stellen Sie sicher, dass sich das Array innerhalb eines Millimeters vom Substrat befindet. Öffnen Sie anschließend das automatische Ausrichtungsprogramm. Geben Sie den Winkelschritt, den groben Schrittabstand und den feinen Schrittabstand ein.

Legen Sie den Pfad der Tabellenkalkulationsdatei fest und hängen Sie die Tabellenkalkulationsvorlage an. Öffnen Sie dann die AFM-Steuerungssoftware und navigieren Sie zum Abschnitt Spektroskopie. Konfigurieren Sie die Oszillation der Z-Achse des Scankopfes so, dass sie über 100 Millisekunden um 10 Mikrometer verlängert, 250 Millisekunden lang gedrückt hält, 10 Mikrometer über 100 Millisekunden zurückzieht und 250 Millisekunden lang hält.

Starten Sie die Scankopf-Oszillation und führen Sie die automatische Ausrichtung aus. Sobald die Software anzeigt, dass die Ausrichtung abgeschlossen ist, beenden Sie den Ausrichtungsvorgang. Überprüfen Sie die automatisch generierte lineare Anpassung der Ausrichtungsdaten, um festzustellen, ob die Ausrichtung erfolgreich war, und um die insgesamt optimalen Winkel zu identifizieren, und heben Sie dann den Probentisch in 500-Nanometer-Schritten an, bis der Kontakt zwischen dem Array und dem Substrat mit der AFM-Draufsichtkamera beobachtet wird.

Klicken Sie in der AFM-Steuerungssoftware auf Stopp, um das Array um 10 Mikrometer einzufahren. Um den PPL-Prozess zu starten, öffnen Sie den Lithografiebereich der AFM-Steuerungssoftware. Wählen Sie die Betriebsart Z-Modulation aus und navigieren Sie zu dem Lithografiemuster, das importiert werden soll.

Geben Sie die Größe des zu generierenden Musters ein. Stellen Sie den Ursprungsversatz auf 25 Mikrometer sowohl auf der X- als auch auf der Y-Achse ein, wählen Sie dann die Position "Modulation Absolute Z", stellen Sie das Instrument auf zwei Ebenen ein und stellen Sie die Schwarz- und Weißwerte auf fünf bzw. minus fünf Mikrometer ein. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu übernehmen und das Fenster zu schließen.

Öffnen Sie den Ebeneneditor im Lithografiefenster und legen Sie die Pausenzeit fest. Senken Sie anschließend die atmosphärische Isolationskammer auf das AFM ab und öffnen Sie die Steuerungssoftware. Stellen Sie eine relative Luftfeuchtigkeit von 45 %, eine Temperatur von 25 Grad Celsius und einen Atmosphärenaustauschdurchsatz von 500 Millilitern ein.

Nehmen Sie die Einstellungen vor und warten Sie, bis die gewünschte Luftfeuchtigkeit erreicht ist. Starten Sie dann die lithographische Sequenz. Nach Abschluss der Lithographie ziehen Sie den Tisch um 500 Mikrometer zurück.

Entfernen Sie die atmosphärische Isolationskammer. Sperren Sie den Probentisch, um die Kraftsensoren zu deaktivieren. Nehmen Sie zuletzt das Substrat zur Visualisierung oder Weiterverarbeitung vom Tisch.

PPL wurde verwendet, um großflächige, homogene Muster aus feinen Array-Gittern oder detaillierten Bildern zu erzeugen. Die Muster wurden für die optische Mikroskopie sichtbar gemacht, indem das Gold geätzt wurde, das nicht durch das abgeschiedene Thiol geschützt war. Eine unregelmäßige Musterung würde auf beschädigte oder fehlende Sonden hinweisen.

MHA-Arrays, die mit PPL auf Gold gedruckt wurden, wurden mit Fibronektin funktionalisiert und mit humanen mesenchymalen Stammzellen inkubiert. Einzelne Zellen hafteten an den Fibronektin-funktionalisierten Arrays und passten ihre Morphologie bei Bedarf an die Muster an. Diese PPL-Technik kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Proteinmustern für zellbiologische Experimente abzuscheiden.

Ein geübter Benutzer kann Muster wie die gezeigten in etwa drei Stunden erzeugen. Denken Sie daran, dass eine sorgfältige Array-Vorbereitung der Schlüssel zum Erfolg ist. Die PPL-Technik ist recht generisch und kann für die Abscheidung von Verbindungen verwendet werden, die von kleinen Molekülen bis hin zu Polymeren und Biomolekülen reichen, und ebnet den Weg für eine Vielzahl von Studien in Chemie, Biologie und Materialwissenschaften.