Name: Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie die großflächige Scan-Sonden-Nanolithografie mit automatischer Ausrichtung zur Herstellung nanostrukturierter Substrate. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen für zukünftige Biomaterialdesigns.

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Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich die UK Engineering and Physical Sciences Research Council (Refs zu gewähren. EP/K011685/1, EP/K024485/1) und ein Diplom Zugehörigkeit zur JH; die Leverhulme Trust (RPG-2014-292); der Wellcome Trust institutionellen strategischen Unterstützungsfonds (105610/Z/14/Z); der British Council (216196834); und der University of Manchester für die Universität von Manchester Research Institute (UMRI Pumpe Ansaugen Fonds) und eine Presidential Promotionsstipendium, SW. technische Unterstützung durch Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) ist auch dankbar anerkannt.

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Die Ausrichtung Algorithmus von entwickelt wurden, und Software sind Eigentum von der University of Manchester. Es ist zum Download unter http://www.click2go.umip.com/ zur Verfügung.

Dieses Protokoll dient den Benutzern eine praktische Methodik für schnell nanolithographischer Musterung mit hohe Gleichmäßigkeit und steuerbare Strukturgröße über große Gebiete (cm2). Substrate, wobei diese großflächigen Nanopatterns können dann für eine Vielzahl von Anwendungen weiter ausgearbeitet werden. Eine wichtige Anwendung dieser Technologie ist bei der Erzeugung von Nanofabricated Oberflächen zur Zelloberfläche Wechselwirkungsstudien. Dieser Bericht zeigt einige Beispiele für Zellkultur auf diese Materialien zeigen, Kontrolle der Stammzellenreserve Morphologie von Nanofabricated Substraten.
Die wichtigste Voraussetzung dieses Protokolls ist die Automatisierung des Verfahrens Ausrichtung (Schritt 4), die sehr einheitlich und Hochdurchsatz-Herstellung von Funktionen auf Flächen bis zu nanoskaligen Auflösung ermöglicht ermöglicht den schnellen Umsatz von Zellexperimente Kultur. Die Polymer-Stift-Lithographie mit dieser Ausrichtung-Algorithmus durchgeführt ist in der Lage, nanoskaligen Funktionen innerhalb von ca. 30 min zu generieren. Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der automatischen Ausrichtung, und damit die Einheitlichkeit der angeordneten Elementen, entsteht jedoch kritisch abhängig von der Qualität der Sonde Arrays, die sind (Schritt 1 und 2). Mängel in der Vorbereitung, die stumpfen, defekte oder fehlende Sonden zur Folge haben; wie eingeschlossene Luft kann ungenaue Ausrichtung und schlechter Qualität Lithographie Bläschen (Schritt 1.5) oder unsachgemäße Trennung der Sonden vom Master (Schritt 1,8) führen.
Dies berichtet, dass die Methode eine Einschränkung gemeinsam mit anderen Ausrichtmethoden teilt, die auf Force-Feedback angewiesen. Die genaue Bestimmung der wenn die Sonden in Kontakt mit der Oberfläche sind wird durch die Notwendigkeit entfallen Hintergrund Erschütterungen durch die Umgebung und die Bewegung der Probe-Bühne eingeschränkt. In der Regel die Sensoren haben eine kraftempfindlichkeit des µN Regimes (2 µN in diesem Fall), aber die Ausrichtung-Algorithmus soll nur eine Kraft von mindestens 490 µN als definitive Kontakt zwischen den Sonden und der Oberfläche zu registrieren, um "false Positives" Frühjahrsputz zu vermeiden Ting von Hintergrundgeräuschen. 13 so, diese Methode tendenziell große Funktionen (1-2 µm) produzieren da die Sonden müssen verlängert einen großen Abstand auf der Z-Achse (mit einer daraus resultierenden höheren Kraft) um Kontakt zu registrieren. Um zu kompensieren, können kleinere Features erzeugt werden, durch die Reduzierung der Z-Achse zurückgelegte Strecke während der Lithographie Schritt (z.B.Eintritt in die "Schwarzen" Einstellung im Schritt 5.2.3.2. als 3 µm statt 5 µm).
Dennoch, auch mit dieser Einschränkung der Automatisierung-Algorithmus ist in der Lage, einen wichtigen Aspekt bei der Anwendung der parallelisierte Sonde Lithographie Scanmethoden, Adresse wie Ausrichtung bisher am meisten anspruchsvollen und ungenau Zeitschritt in der Umsetzung dieser Techniken. Diese Automatisierung jetzt verlagert sich die Bandbreitenbegrenzung Schritt den Fertigungsprozess von der Achse auf die Lithographische Schreiben selbst. Während dieses Protokolls über die Anwendung dieses Verfahrens Ausrichtung auf PPL zeigt, könnte eine Reihe von SPL-Techniken wie Lipid-DPN26 und Matrix-gestützte Lithografie27 sowie mögliche Zukunft katalytische Rahmen zugewiesen werden Tastsysteme. 28

Fortschritte in der Nanotechnologie ist abhängig von der Entwicklung der Techniken in der Lage, effizient und zuverlässig Herstellung nanoskaliger Merkmale auf Oberflächen. 1 , 2 erzeugen solche verfügt über große Flächen (mehrere cm2) zuverlässig und bei relativ geringen Kosten ist ein nicht triviales Unterfangen. Die meisten vorhandenen Techniken, abgeleitet von der Halbleiter-Industrie vertrauen auf ablative Photolithographie, "harte" Materialien zu fabrizieren. In jüngerer Zeit, haben Lithographische Techniken abgeleitet Rastersondenmikroskopie (SPM) als eine bequeme und vielseitige Ansatz für das rapid Prototyping von nanoskaligen Designs entstanden. 3 SPM-basierte Techniken sind in der Lage, bequem und schnell "beliebige benutzerdefinierte Muster schreiben". Die bekannteste davon ist Dip-Pen Nanolithografie (DPN), vorangegangen durch Mirkin Et Al.,4 wo eine Scan-Sonde als "Stift" verwendet wird, um eine molekulare "Tinte" zur Herstellung von Funktionen in einer Weise analog zu schreiben Oberfläche übertragen. Unter Umgebungsbedingungen, wie eine Sonde über eine Oberfläche gescannt wird die "Tinte" Moleküle werden übertragen auf der Oberfläche über eine Wasser-Meniskus, die zwischen der Sonde und der Oberfläche (Abbildung 1) bildet. DPN erlaubt somit die nanolithographischer Abscheidung einer breiten Palette von Materialien, einschließlich "weiche" Materialien wie Polymere und Biomoleküle. 5 Verwandte Techniken mit Sonden entwickelt mit Kanälen für flüssige Lieferung verschiedentlich genannt "Nanopipettes" und "Nano-Füllfederhalter", berichtet wurde. 6 , 7 , 8
Das Haupthindernis für die breitere Anwendung der SPM stammenden Lithographie ist Durchsatz, da sie eine übermäßig lange Zeit auf Muster-Zentimeter-Skala-Bereiche mit einer einzigen Sonde erfordert. Frühe Bemühungen zur Behebung dieses Problems konzentrierte sich auf die Parallelisierung der Cantilever-basierte DPN mit "One-dimensional" und "zweidimensionale" (2D) Sonde-Arrays für die Lithographie Zentimeter große Gebiete gemeldet wird. 5 , 9 jedoch diese Freischwinger-Arrays werden durch relativ komplexen mehrstufigen Fertigungsverfahren hergestellt und sind relativ empfindlich. Die Erfindung des Polymer Stift Lithographie (PPL) Thema dieses ersetzt die standard SPM Kragträgern mit einem 2D-Array weichen Siloxan Elastomer Sonden auf einen Glasobjektträger gebunden. 10 einfache Sonde Setup verringert erheblich die Kosten und Komplexität der Musterung Großflächen, Öffnung der Nanolithografie für ein breiteres Spektrum von Anwendungen. Dieser Freischwinger-freie Architektur wurde auch auf harte Spitze weiche Feder Lithografie,11 erweitert bietet eine Mischung aus weichem Elastomer Unterstützung mit harten Silizium-Tipps geben verbesserte Auflösung im Vergleich zu Mustern mit weichen hergestellt Elastomer-Tipps.
Ein entscheidender Faktor bei der Ausführung dieser 2D Array-Technologien ist, dass das Array Sonde exakt parallel zur Oberfläche Substrat sein, damit beim Lithographie genutzt wird, die Sonden mit der Oberfläche in Kontakt kommen gleichzeitig. Sogar eine kleine Schiefstellung kann einen großen Unterschied in der Größe von einer Seite des Arrays zum anderen, da einige Sonden früher während des Abstiegs des Arrays, mit der Oberfläche in Kontakt kommen werden, während andere später oder überhaupt nicht in Berührung kommen werden. 12 exakte Ausrichtung ist besonders wichtig mit PPL aufgrund der Verformbarkeit von weichem Elastomer-Sonden, wo werden die Sonden, die Kontakt mit der Oberfläche bereits komprimiert, auf der Oberfläche einen größeren Fußabdruck hinterlassen.
Die frühe Arbeiten auf PPL beschäftigt rein visuelle Inspektion, führen den Alignment-Prozess, mit Hilfe einer Kamera über das Array, um die Verformung der pyramidalen Sonden zu beobachten, wie sie mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wurden. 10 Ausrichtung wurde beurteilt, indem Sie beobachten, welche Seite der Sonden kam in Kontakt mit der Oberfläche zuerst, dann Einstellung des Winkels und iterativ den Vorgang wiederholen, bis die Differenz in Kontakt auf jeder Seite der Sonde war das Auge nicht zu unterscheiden. Da diese Ausrichtung Verfahren stützt sich auf subjektive visuelle Inspektion durch den Betreiber, ist Reproduzierbarkeit gering.
Anschließend wurde ein objektiverer Ansatz entwickelt, bestehend aus einen Kraftsensor unter das Substrat zur Messung der Krafteinwirkung beim Kontakt der Sonden auf der Oberfläche angebracht. 12 Ausrichtung wurde somit erreicht durch eine Anpassung der Neigungswinkel zur Maximierung der der Kraft ausgeübt, die zeigten, dass die Sonden gleichzeitig in Kontakt waren. Diese Methode zeigte, dass Ausrichtung innerhalb von 0,004 ° der Oberfläche Parallel möglich. Diese "Force Feedback Nivellierung" wurde jetzt in vollautomatischen Anlagen in zwei unabhängige Berichte umgesetzt. 13 , 14 sowohl verwenden Sie einen Dreiklang von Kraftsensoren montiert unter dem Substrat oder über das Array und Messen Sie die Menge der Kraft, die beim Kontakt zwischen der Sonde Arrays und Oberfläche. Diese Systeme bieten hohen Präzision, Berichterstattung Fehlstellungen von ≤0.001 ° über 1 cm Längenskala,14 oder ≤ 0,0003 ° über 1,4 cm.13 diese automatische Justage-Systeme bieten auch bedeutende Einsparungen bei Bedienerzeit und Gesamtzeit in Anspruch genommen die Lithographie-Prozess.
Eine wichtige Anwendung von Hochdurchsatz-Oberfläche Fertigung ermöglicht durch diese Technologie ist die Generation der Zelle Kultursubstrate. Es ist inzwischen gut etabliert, dass Zelle Phänotyp manipuliert werden, indem Sie steuern die erste Interaktion zwischen Zellen und Oberflächeneigenschaften, und dies kann im Nanobereich verbessert werden. 15 insbesondere Sonde Lithographie Scanmethoden nachweislich eine einfache Methode, um eine Vielzahl von Nanofabricated Flächen für solche Zelle Kultur Experimente produzieren werden. 16 induziert z. B. Oberflächen präsentieren Nanoscale Muster der selbstgebaute Monolagen und extrazelluläre Matrix, die Proteine, die durch PPL und DPN templated verwendet wurden, um das Potenzial von Nano-modifizierten Materialien im Material Differenzierung der Stammzellen. 17
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines modifizierten Rasterkraft-Mikroskop (AFM)-Systems, das großflächige PPL ermöglicht. Wir ausführlich die Erkennung von Kraft mit mehreren Kraftsensoren als Mittel zur Bestimmung der Sonde-Fläche-Kontakt, zusammen mit einem Algorithmus, der die iterative Alignment-Prozess automatisiert. Nachfolgende Funktionalisierung von diesen Mustern mit der extrazellulären Matrix Protein Fibronektin und die Kultur des humanen mesenchymalen Stammzellen (Stammzellenreserve) werden als eine Demonstration der PPL-fabrizierten Oberflächen angewendet für die Zellkultur bezeichnet.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM montiert auf einem motorisierten 5-Achsen (XYZ&Theta; &phi;) Translations- und Goniometertisch</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>AFM-Steuerungssoftware</td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>Gravierstift</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>PlasmaFlo</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>Economy Trockensauerstoff-Servicepumpe</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>Röhrenrotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Wasseraufbereitungssystem</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>Modularer Feuchtigkeitsgenerator</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus Pipette 100-1000 &micro; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>Silicon masters</td><td>NIL Technology</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechte Schnappschuss-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektive</td><td>Olympus</td><td>10x und 60x UPlan FLN &infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechte Hellfeldmikroskopie</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Ultrawave GmbH</td><td>U95</td><td></td></tr><tr><td>Tabellenkalkulation zur Aufzeichnung und Darstellung automatisierter Ausrichtungsergebnisse</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td>ENTFLAMMBARES</td></tr><tr><td>Mikroskop Sildes, klar, geschliffen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash; 8% Vinylmethylsiloxan)-Dimethylsiloxan-Copolymer, Trimethylsiloxy-terminiertes</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxan</td><td>Gelest</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>Platin(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxan komplexe Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>479527</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICH, GIFTIG(</td></tr><tr><td>25&ndash; 35% Methylhydrosiloxan)-Dimethylsiloxan-Copolymer, Trimethylsiloxan-terminiertes</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>Wägeschiffchen 100 mL</td><td>Wissenschaftliches Laborzubehör</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>Agar wissenschaftliche</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>16-Mercaptohexadecansäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICHES, GIFTIGES</td></tr><tr><td>ETHANOL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>ENTFLAMMBAR</td></tr><tr><td>Goldbeschichteter Objektträger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>643203</td><td>Nach dem Öffnen bleibt Gold mindestens 1 Monat lang reaktiv gegenüber Thiolen</td></tr><tr><td>Thioharnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICH, GIFTIG</td></tr><tr><td>Eisen(III)-nitrat-Nonahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICH, GIFTIG</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICH, GIFTIG(</td></tr><tr><td>11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylenglykol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICHES, GIFTIGES</td></tr><tr><td>Fibronektin aus menschlichem Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt(II)-nitrat-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203106</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICHES, GIFTIGES</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM Mesenchymales Stammzellwachstumsmedium</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Humane mesenchymale Stammzellen</td><td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1 Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>GESUNDHEITSSCHÄDLICH, GIFTIG</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>"Detergens" im Manuskript</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPI-Vektor</td><td> Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Fibronektin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>T75-Gewebe Kulturflasche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>Ausleger</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

großflächige scan sonde nanolithografie erleichtert durch automatische ausrichtung und seine anwendung auf substrat herstellung für zell-kultur-studien

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Rastersondenmikroskopie ermöglichte die Schaffung einer Vielzahl von Methoden für die konstruktive (Additiv) Top-Down-Herstellung der Nanometer-Skala Features. Historisch gesehen wurde ein großer Nachteil des Scannens Sonde Lithographie intrinsisch niedriger Durchsatz der einzelnen Tastsysteme. Dies hat durch die Verwendung von Arrays mit mehreren Sonden, erhöhte Nanolithografie Durchsatz ermöglichen in Angriff genommen worden. Um solche parallelisierte Nanolithografie zu implementieren, die präzise Ausrichtung der Sonde Arrays mit der Substratoberfläche ist entscheidend, damit alle Sonden machen Kontakt mit der Oberfläche gleichzeitig wenn lithografischen Strukturierung beginnt. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Polymer-Stift-Lithographie Nanometerskala Funktionen über Zentimeter große Bereiche, erleichtert durch den Einsatz eines Algorithmus für die schnelle, präzise und automatische Ausrichtung der Sonde Arrays zu produzieren. Nanolithografie Thiole auf gold Substraten zeigt, die Erzeugung von Funktionen mit hoher Gleichmäßigkeit. Diese Muster sind dann mit Fibronektin für den Einsatz im Rahmen der Oberfläche gerichtet Zelle Morphologie Studien funktionalisiert.

Um zu prüfen, ob die automatische Ausrichtung erfolgreich gewesen war, wurden die Graphen geplottet von Achsdaten (in der Tabelle aus Schritt 4.8) untersucht. Wo der Alignment-Prozess erfolgreich waren zeigte zwei Grundstücke, entspricht dem Winkel, den Probentisch θ und φ Achsen gekippt worden hat, eine Reihe von steigend und absteigend Datenpunkte. In jedem der Grundstücke, zwei lineare passt der Datenpunkte zeigte eine klar definierte Intersect "Peak" zeigt die maximale Z-Erweiterung und den entsprechenden Winkel mit der Ausrichtung wurde erreicht (Abb. 4A und 4 b). Dieser Vorgang wird wiederholt vier Mal (d.h., zweimal für jede Achse) und als ein Satz von vier Koordinaten dargestellt. Der Schnittpunkt der jedes Paar von Koordinaten zeigt also die insgesamt optimalen Winkel (Abbildung 4). 13 in Fällen, in denen die Ausrichtung nicht erfolgreich war, ist festzustellen, dass ihre entsprechenden θ und φ Winkel Plots keine gute Qualität linear passt geben, oder sich nicht (Abbildung 5 überschneiden). Solche fehlerhaften Achsen sind in der Regel durch die Arrays nicht richtig getrimmt oder an Sondenhalter (Schritte 1,7, 1,8 und 2,2) montiert wird. In diesen Fällen die Arrays wurden verworfen und eine neue vorbereitet und montiert (Schritte 1 und 2) und der Alignment-Prozess wiederholt (Schritt 4).
Nach der erfolgreichen Ausrichtung und Lithographie mit MHA von PPL wurden dann gemusterten gold Substrate abgebildet mit Querkraft Mikroskopie um zu prüfen, ob die Ablagerung stattgefunden hatte. Eine größeren Bereich Prüfung die bedruckten Flächen führte auch optische Mikroskopie der Substrate nach der Beanspruchung des Goldes nicht geschützt durch die hinterlegten Thiol (Abbildung 6 und Abbildung 7). Jedoch die geätzte Muster können nicht verwendet werden, für weitere Funktionalisierung und sollte nur zur Musterung auf repräsentative Proben einer Charge von bedruckten Oberfläche Substraten zu bestätigen. Wenn die geätzte Muster zeigen leere Bereiche entsprechend Einzelbuchten (Abbildung 8), zeigt dieses Ergebnis, dass die Produktion der Sonde Arrays nicht erfolgreich durchgeführt wurde, und dass einige Sonden fehlen oder beschädigt sind. Diese Inhomogenität der Sonden möglicherweise durch den Einsatz eines alten Meisters, wo die perfluorierte Beschichtung hat abgetragen (Schritt 1.3), wodurch einige Sonden losgerissenen wenn das Array vom Master getrennt ist. In diesen Fällen sollte ein neues Master verwendet werden. Das Ergebnis kann auch durch die Anwesenheit von Luft sein, Luftblasen zwischen dem Glas Unterstützung und dem Master (Schritt 1.5) gefangen, oder wenn das Array Sonde nicht sauber vom Master getrennt wurde nach dem Aushärten (Schritt 1,8).
Fluoreszierende Mikroskopie Bilder der Fibronektin funktionalisiert Oberflächen inkubierten hMSCs auch waren gesammelt (Abbildung 9). In der Regel alle Substrate wurden in der in-vitro- Kultur Umwelt stabil und die Zellen eingehalten und ihre Morphologie der gedruckten Muster bei kleineren isolierten 20 x 20-Palette von Funktionen angepasst.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Polymer-Stift-Lithographie zeigt Molekulare Tinte Transport über ein Wasser-Meniskus auf Sondenspitze. (A) Seitenansicht und (B) Draufsicht auf das Polymer-Stift-Array anzugeben, wenn die Sonde Array und Oberfläche Substrat vollständig ausgerichtet sind, die Sonden gleichzeitig in Kontakt mit der Oberfläche kommen wiederum parallelisierte Lithographie. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Polymer-Stift-Lithographie einrichten (A) erweiterte Seitenansicht des experimentellen einrichten wo bereit Sonde Array Sonde Halter befestigt und AFM-Scanner montiert. Das Substrat ist auf der Bühne platziert, unter dem sich befinden die drei Kraftsensoren. (B) eine Darstellung der montierten Instrumentierung, zeigt die AFM-Scan-Kopf im Verhältnis zu dem Probentisch. (C) Untersicht, Kraft-Sensor Standort anzeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Abbildung 3. Schematische Darstellung zeigt die Spektroskopie-Programm für die Ausrichtung Verfahren. Die AFM-Scanner soll die Sonden auf Probe durch einen Abstand von 10 µm innerhalb von 100 ms, gehalten an Position für 250 ms, gefolgt von einer Rücknahme von 10 µm innerhalb von 100 ms, und hielt dann für 250 ms bei der eingefahrenen Position bewegen. Die Bewegung wird dann während der Alignment-Prozess wiederholt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Abbildung 4. Diagramme zur Veranschaulichung einer erfolgreichen Ausrichtung. Graphen von Z-Position gegen die Neigung Winkel (A) θ und φ (B) für eine erfolgreiche Ausrichtung, wobei ● angibt, die tatsächlichen Werte gemessen und + zeigt die besten passen mit der Methode der kleinsten Quadrate. (C) Graph von φ gegen θ ausgestattet Winkel mit den vier Punkten, wo die maximale Z-Position erreicht wurde. Der Schnittpunkt markiert ist der endgültige optimalen Neigungswinkel über beide Achsen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Abbildung 5. Diagramme zur Veranschaulichung einer erfolglosen Achse. Graphen von Z-Position gegen die Neigung Winkel (A) θ und φ (B) für eine erfolglose Ausrichtung, wobei ● angibt, die tatsächlichen Werte gemessen und + zeigt die besten passen mit der Methode der kleinsten Quadrate. (C) Graph von φ gegen θ ausgestattet Winkel mit den vier Punkten, wo die maximale Z-Position erreicht wurde. Keine klare Optima oder Schnittpunkt eingehalten werden und somit die optimale Ausrichtung-Winkel sind nicht gelöst. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Abbildung 6. Illustrative optische Mikroskopie und Rasterkraftmikroskop Mikroskopie Bilder gold Substrate, die durch die ausgerichteten PPL-Arrays mit MHA gemustert und dann geätzt wurden. (A) und (B) sind sequentiell vergrößerten optische Mikroskopie Bilder der geätzte Muster; (C) ist ein AFM-Topographie-Bild aus einem einzigen Gitter Muster. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Abbildung 7. Illustrative optische Mikroskopie Bilder gold Substrate, die durch die ausgerichteten PPL-Arrays mit MHA gemustert und dann geätzt wurden. (A) und (B) sind sequentiell vergrößerten optische Mikroskopie Bilder von geätzten Mustern und (C) ist eine Niedrigerere Vergrößerung Bild, die großflächige homogenen Muster anzeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Abbildung 8: Illustrative optische Mikroskopie Bild von einem gold Substrat, die ungleichmäßig mit MHA gemustert und dann geätzt wurde. Die vorgesehenen Muster (gezeigt im Einschub) wurden wiederholt Gitter 20 Punkt-Linien angeordnet 20 Zeilen, mit jeder zwei Linien produziert durch die Erhöhung der Z-Achse Verlängerung um 1 µm (zwischen 5 und-5 µm). Es ist ersichtlich, dass in einigen Bereichen keine Muster, aufgrund der fehlenden Sonden in diesen Orten erzeugt werden. In den Bereichen, wo nur zwei Zeilen von Punkten hergestellt werden, dieses Ergebnis zeigt, dass eine Sonde vorhanden ist aber es ist nicht die gleiche Höhe wie die voll funktionsfähigen Sonden so nur Kaution verfügt über, wenn das Array auf die volle Zerweitert wird-Achsabstand. In diesem Bild ist der Kontrast absichtlich verändert worden, um Beobachtung der teilweise bedruckten Bereiche zu ermöglichen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Abbildung 9. Epifluoreszenz mikroskopie Bilder von kultiviert in den vorgefertigten Fibronektin-Arrays von PPL hMSCs. (A) und (B) sind hohe Vergrößerung Bilder zeigen einzelne Zellen. (C) zeigt einer Beispiel-Muster des Fibronektin Arrays ohne Anhänger Zell- und (D) ist ein weites Feldbild der Zellen in einem Raster-Arrangement (eine schematische Darstellung des gedruckten Muster zeigt auch in das Inlay) kultiviert. Die Zellen sind zum Anzeigen von Fibronektin (rot), F-Aktin (grün) und Zellkerne (blau) gefärbt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll für großflächige Scan Sonde Nanolithografie durch die iterative Ausrichtung der Sonde Arrays sowie die Nutzung von lithographischen Mustern für Zelloberfläche Wechselwirkungsstudien aktiviert.

Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Es besteht ein großer Bedarf an praktischen Werkzeugen zur Erzeugung von Merkmalen und Objekten im Nanometerbereich, insbesondere bei der Untersuchung biologischer Wechselwirkungen mit nanostrukturierten Materialien und Oberflächen. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und homogene Replikation von Proteinarrays über Zentimeterbereiche mit nanoskaliger Auflösung. Dies ermöglicht es uns, die Wechselwirkungen mit mesenchymalen Stammzellen auf diesen Oberflächen zu untersuchen.Diese Modelloberflächen ermöglichen es uns, kontrollierte Wechselwirkungen zwischen spezifischen Materialvariablen und mesenchymalen Stammzellen zu untersuchen, und liefern grundlegende Kriterien für das Materialdesign, die zukünftige Biomaterialdesigns beeinflussen werden. Zu Beginn des Verfahrens mischen Sie die Bestandteile des PDMS-Prepolymers gründlich in einer Waage. Entgasen Sie das Gemisch in einem Vakuumexsikkator für 20 Minuten oder bis alle Gasblasen verschwunden sind.Platzieren Sie dann den Silizium-Master für das PPL-Array in einer vier Zentimeter großen Petrischale. Gießen Sie die entgaste PDMS-Prepolymermischung über den Master, bis er vollständig bedeckt ist. Entgasen Sie das PDMS, das den Master abdeckt, für weitere fünf Minuten.Während der Entgasung wird ein Objektträger eine Minute lang mit Sauerstoffplasma behandelt. Legen Sie den Objektträger nach dem Entgasen vorsichtig mit der behandelten Seite nach unten auf das PDMS. Drücken Sie den Objektträger vorsichtig auf den Silikonmaster, um eingeschlossene Luft zu entfernen und sicherzustellen, dass eine gleichmäßige PDMS-Schicht zwischen dem Master und dem Objektträger liegt.Übertragen Sie das sandwichierte PDMS-Array in eine andere Petrischale, wobei sich der Silizium-Master auf der Unterseite befindet. Härten Sie das PDMS in einem Ofen bei 70 bis 80 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden aus. Nehmen Sie dann das ausgehärtete PPL-Array aus dem Ofen und lassen Sie es 15 Minuten abkühlen.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges PDMS vorsichtig von der Rückseite und den Seiten des Objektträgers abzuschneiden. Blasen Sie lose PDMS-Ablagerungen mit einem Strom trockenen Stickstoffgases weg. Es ist wichtig, überschüssiges PDMS von der Rückseite und den Rändern des Arrays zu kürzen, um eine genaue Ausrichtung zu ermöglichen.Dies hilft dem Anwender auch, die Bedingungen der Sonden unter dem AFM während der Lithographie besser zu beobachten. Klemmen Sie eine Rasierklinge in einer Tiefe von einem Millimeter in die Ecke des Arrays und hebeln Sie das Array vorsichtig in einer einzigen, kontinuierlichen Hebebewegung aus dem Silizium-Master. Schneiden und kratzen Sie dann vorsichtig 0,5 Millimeter des PDMS an den Rändern des Arrays mit einer Rasierklinge ab.Benutzer sollten sehr vorsichtig sein, wenn sie die Arrays vom Master lösen, um eine gute Trennung zu gewährleisten und eine Beschädigung der Sonden zu vermeiden. Dies sollte in einer einzigen, reibungslosen Aktion erfolgen, ohne dass die Arrays auf den Silizium-Master zurückfallen. Behandeln Sie das PPL-Array 30 Sekunden lang mit Sauerstoffplasmid und lassen Sie dann 20 Mikroliter deionisiertes Wasser auf die Array-Oberfläche fallen.Wenn sich das Wasser nicht gleichmäßig über das gesamte Array verteilt, wiederholen Sie die Plasmabehandlung. Trocknen Sie das plasmabehandelte Array gründlich und befestigen Sie es dann mit doppelseitigem Kohleband an der Halterung der Rasterkraftmikroskopie-Sonde. Montieren Sie den Sondenhalter auf dem kinematischen AFM-Halter.Um das Array einzufärben, tragen Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen einer 1-millimolaren MHA-Lösung in Ethanol auf das Array auf, wobei Sie den Kontakt zwischen der Pipettenspitze und der Array-Oberfläche vermeiden. Lassen Sie die MHA-Lösung im gesamten Array verteilen. Warten Sie, bis das Ethanol verdampft ist.Montieren Sie den Sondenhalter mit dem PPL-Array auf dem AFM und platzieren Sie dann ein Goldsubstrat in der Mitte des AFM-Probentisches. Fixieren Sie den Untergrund mit Klebeband. Um mit der Ausrichtung zu beginnen, führen Sie das Setup-Programm des Bühnencontrollers aus, um alle Achsen und Winkel auf einen vorkalibrierten Nullpunkt zurückzusetzen.Verwenden Sie die Steuerkonsole der X- und Y-Achse des AFM-Probentisches, um das Substrat an die gewünschte Druckposition zu bewegen. Schalten Sie den Entriegelungshebel des Tisches um, um den Probentisch freizugeben und die Kraftsensoren zu aktivieren. Lassen Sie die Sensoren mindestens 15 Minuten lang äquilibrieren, und verwenden Sie dann den Z-Achsen-Controller, um den Probentisch anzuheben, bis das Array visuell so nah wie möglich am Substrat ist.Stellen Sie sicher, dass sich das Array innerhalb eines Millimeters vom Substrat befindet. Öffnen Sie anschließend das automatische Ausrichtungsprogramm. Geben Sie den Winkelschritt, den groben Schrittabstand und den feinen Schrittabstand ein.Legen Sie den Pfad der Tabellenkalkulationsdatei fest und hängen Sie die Tabellenkalkulationsvorlage an. Öffnen Sie dann die AFM-Steuerungssoftware und navigieren Sie zum Abschnitt Spektroskopie. Konfigurieren Sie die Oszillation der Z-Achse des Scankopfes so, dass sie über 100 Millisekunden um 10 Mikrometer verlängert, 250 Millisekunden lang gedrückt hält, 10 Mikrometer über 100 Millisekunden zurückzieht und 250 Millisekunden lang hält.Starten Sie die Scankopf-Oszillation und führen Sie die automatische Ausrichtung aus. Sobald die Software anzeigt, dass die Ausrichtung abgeschlossen ist, beenden Sie den Ausrichtungsvorgang. Überprüfen Sie die automatisch generierte lineare Anpassung der Ausrichtungsdaten, um festzustellen, ob die Ausrichtung erfolgreich war, und um die insgesamt optimalen Winkel zu identifizieren, und heben Sie dann den Probentisch in 500-Nanometer-Schritten an, bis der Kontakt zwischen dem Array und dem Substrat mit der AFM-Draufsichtkamera beobachtet wird.Klicken Sie in der AFM-Steuerungssoftware auf Stopp, um das Array um 10 Mikrometer einzufahren. Um den PPL-Prozess zu starten, öffnen Sie den Lithografiebereich der AFM-Steuerungssoftware. Wählen Sie die Betriebsart Z-Modulation aus und navigieren Sie zu dem Lithografiemuster, das importiert werden soll.Geben Sie die Größe des zu generierenden Musters ein. Stellen Sie den Ursprungsversatz auf 25 Mikrometer sowohl auf der X- als auch auf der Y-Achse ein, wählen Sie dann die Position "Modulation Absolute Z", stellen Sie das Instrument auf zwei Ebenen ein und stellen Sie die Schwarz- und Weißwerte auf fünf bzw. minus fünf Mikrometer ein. Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu übernehmen und das Fenster zu schließen.Öffnen Sie den Ebeneneditor im Lithografiefenster und legen Sie die Pausenzeit fest. Senken Sie anschließend die atmosphärische Isolationskammer auf das AFM ab und öffnen Sie die Steuerungssoftware. Stellen Sie eine relative Luftfeuchtigkeit von 45 %, eine Temperatur von 25 Grad Celsius und einen Atmosphärenaustauschdurchsatz von 500 Millilitern ein.Nehmen Sie die Einstellungen vor und warten Sie, bis die gewünschte Luftfeuchtigkeit erreicht ist. Starten Sie dann die lithographische Sequenz. Nach Abschluss der Lithographie ziehen Sie den Tisch um 500 Mikrometer zurück.Entfernen Sie die atmosphärische Isolationskammer. Sperren Sie den Probentisch, um die Kraftsensoren zu deaktivieren. Nehmen Sie zuletzt das Substrat zur Visualisierung oder Weiterverarbeitung vom Tisch.PPL wurde verwendet, um großflächige, homogene Muster aus feinen Array-Gittern oder detaillierten Bildern zu erzeugen. Die Muster wurden für die optische Mikroskopie sichtbar gemacht, indem das Gold geätzt wurde, das nicht durch das abgeschiedene Thiol geschützt war. Eine unregelmäßige Musterung würde auf beschädigte oder fehlende Sonden hinweisen.MHA-Arrays, die mit PPL auf Gold gedruckt wurden, wurden mit Fibronektin funktionalisiert und mit humanen mesenchymalen Stammzellen inkubiert. Einzelne Zellen hafteten an den Fibronektin-funktionalisierten Arrays und passten ihre Morphologie bei Bedarf an die Muster an. Diese PPL-Technik kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Proteinmustern für zellbiologische Experimente abzuscheiden.Ein geübter Benutzer kann Muster wie die gezeigten in etwa drei Stunden erzeugen. Denken Sie daran, dass eine sorgfältige Array-Vorbereitung der Schlüssel zum Erfolg ist. Die PPL-Technik ist recht generisch und kann für die Abscheidung von Verbindungen verwendet werden, die von kleinen Molekülen bis hin zu Polymeren und Biomolekülen reichen, und ebnet den Weg für eine Vielzahl von Studien in Chemie, Biologie und Materialwissenschaften.

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Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien (Video) | JoVE Journal

Großflächige Scan Sonde Nanolithografie erleichtert durch automatische Ausrichtung und seine Anwendung auf Substrat Herstellung für Zell-Kultur-Studien

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