Name: Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierungsmethode für die Analyse von Chromatin-Zuständen in Tumorgeweben. Diese Technik ermöglicht die effiziente Verarbeitung multiplier Histomodifikationen und Proben.

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Wir danken Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF Kern am MDACC für Sequenzierung Unterstützung. Die in diesem Artikel beschriebene Arbeiten wurde unterstützt durch Zuschüsse von der NIH-Zuschuss (CA016672), SMF Kern und NCI vergibt (1K99CA160578 und R00CA160578) an K. R.

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Autoren erklären keine Konflikte.

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige und umfassende Hochdurchsatz-ChIP-Seq-Modul für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten in menschlichen Tumorgewebe und Zell-Linien. In jedem ChIP-Seq-Protokoll ist einer der wichtigsten Schritte Antikörperbesonderheit. Hier veranschaulicht diese Methode Immunopräzipitation Bedingungen für die beschriebenen sechs Histon Änderungen, von die alle sind ChIP-Klasse und wurden zuvor in unserer und anderer Labors42,44<s...

Die Mehrheit der Säugetier-Genome (98-99 %) bestehen aus Nichtkodierende Sequenz, und diese Nocoding-Regionen enthalten regulatorische Elemente bekannt, bei der Kontrolle der Genexpression und Chromatin Organisation1,2teilzunehmen. In einer normalen Zelle ist die angegebene Assembly genomic DNA in verdichteten Chromatinstruktur entscheidend für die räumliche Organisation, Regulierung und präzises Timing von verschiedenen DNA-assoziierten Prozesse3,4,5. In eine Krebszelle führen jedoch Chromatin Modifikationen von aberranten epigenetischen Mechanismen zu unsachgemäßen Organisation von Chromatinstruktur, einschließlich des Zugangs zu regulatorischen Elemente, chromosomale Schleife Systeme und Gen Ausdruck Muster6, 7,8,9,10.
Trotz der jüngsten Fortschritte haben wir Verständnis für epigenetische Veränderungen beschränkt, die Tumorprogression oder therapeutische Reaktion zugeordnet sind. Das epigenom besteht aus einer Reihe von Änderungen, einschließlich Histon Marks und DNA-Methylierung, die bilden zusammen einen dynamischen Zustand (bezeichnet als Chromatin-Staat), der bei der Gen-Expression-Netzwerken und anderen Prozessen entscheidend für die Aufrechterhaltung der auftrifft zelluläre Identität. Vor kurzem wurden Änderungen in Enhancer in mehreren Malignome gezeigt, durch das Studium der H3K27Ac profile11. Obwohl solche Studien in die Korrelation von isolierten epigenetischen Markierungen Einblick, wurden mehr als 100 epigenetische Modifikationen identifizierten12,13 ohne klares Verständnis ihrer biologischen Rollen und Interdependenz. Darüber hinaus gibt es eine noch größere Anzahl von möglichen kombinatorische Muster dieser Histon und DNA-Veränderungen, und es ist diese kombinatorische Muster - keine individuelle Anpassungen -, die epigenetische Staaten14diktieren. Daher gibt es enormen Bedarf zur Identifikation von Veränderungen in diesen Staaten Chromatin während Tumorprogression oder Reaktionen auf die Therapie. Umfassende Kenntnisse der epigenom Änderungen bei Krebsarten hat teilweise aufgrund von technischen (z. B. Erzeugung von großen Datenmengen aus kleinen Menge an klinischen Material/einzelne Zellen) hinken und analytische (z.B. Algorithmen zu definieren Kombinatorische Staaten) Herausforderungen. Daher gibt es kritische Notwendigkeit für robuste Hochdurchsatz-Methoden für die Profilerstellung große Anzahl von Histon Modifikation Markierungen von klinischem Material und einfach zu implementierende rechnerische Ansätze, kombinatorische Muster vorherzusagen, die erleichtert Bestimmung der epigenetischen Staaten mit verschiedenen Stufen der Tumorgenese und therapeutischen Widerstand verbunden. Darüber hinaus verfügbaren Daten aus den letzten epigenom profiling Studien15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in normalen Geweben und Zelllinien mit Chromatin Profile von Tumoren für weitere Einblicke in epigenom Beitrag zur Tumorbiologie integriert werden können.
Chromatin-profiling ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Ermittlung der global verbindliche Muster von verschiedenen Chromatin Änderungen15,24geworden. In den letzten Jahren ist die ChIP-Seq der "Goldstandard" für die Untersuchung von DNA-Protein Interaktionen auf einer globalen Skala25,26,27geworden. Für jeden ChIP-Seq-Experiment sind wichtige Schritte für seinen Erfolg, einschließlich Gewebe Verarbeitung und Dissoziation, bestimmen optimale Beschallung Bedingungen bestimmen optimale antikörperkonzentration für Niederschlag, Bibliothek Vorbereitung notwendig, nach Abschluss der Sequenzierung Datenverarbeitung und nachgelagerte Analyse. Jeder dieser Schritte enthalten wichtige Qualitätskontrolle Prüfpunkte und zusammengenommen sind ausschlaggebend für richtig identifizieren potenzielle Ziele für die funktionelle Validierung. Durch Innovation in den folgenden Schritten haben mehrere vorherige Studien Methoden zum Ausführen von ChIP oder ChIP-Seq aus kleine Menge an Gewebe28,29,30,31,32 entwickelt. . Darüber hinaus haben einige Studien gezeigt, Protokolle für Hochdurchsatz-ChIP Experimente gefolgt von PCR-basierte Quantifizierung33,34. Schließlich sind einige öffentlich zugängliche Analyse Plattformen für ChIP-Seq-Daten jetzt wie Easeq35 und Galaxy36zur Verfügung. Allerdings hat eine integrierte Plattform für die Durchführung von ChIP-Seq in eine Hochdurchsatz-Mode in Kombination mit einer rechnerischen Pipeline einzelne Markierung sowie Chromatin-Zustand-Analysen durchführen gefehlt.
Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen und umfassenden ChIP-Seq-Workflow für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten im Tumorgewebe und Zell-Linien, mit leicht Richtlinien umfasst alle die notwendigen Schritte für ein gelungenes Experiment. Durch die Annahme einer Hochdurchsatz-Methode zuvor von Blecher-Gonen Et Al. beschrieben 37, dieses Protokoll auf Dutzenden von Proben parallel durchgeführt werden kann und auf Krebszelllinien und menschlichen Tumoren wie Melanom, Dickdarm, Prostata und Glioblastoma Multiforme erfolgreich angewendet wurde. Wir zeigen die Methodik für die sechs Kern-Histon-Modifikationen, die Schlüsselkomponenten der epigenetischen regulatorischen Landschaft im menschlichen Melanom-Zelllinien und tumorproben darstellen. Diese Änderungen umfassen H3K27ac (Enhancer), H3K4me1 (aktive und Balanciert, Enhancer), H3K4me3 (Promotoren), H3K79me2 (transkribiert Regionen), H3K27me3 (Polycomb Repression) und H3K9me3 (heterochromatischen Repression). Diese Markierungen können entweder allein oder in Kombination verwendet werden, um funktionell unterschiedlichen Chromatin Staaten repräsentieren sowohl repressive als auch aktive Domains zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>H3K4me1-Antikörper in ChIP-Qualität</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac-Antikörper in ChIP-Qualität</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3-Antikörper in ChIP-Qualität</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K79me2-Antikörper in ChIP-Qualität</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3-Antikörper in ChIP-Qualität</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 in ChIP-Qualität Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Leben Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - IgG-frei</td><td>Sigma - Leben Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Gibo</td><td></td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tube</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>Dissoziationstube</td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>miniProteaseinhibitor</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>Proteasehemmer Tabletten</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS-Röhrchen 0,65 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>Beschallungsröhrchen</td></tr><tr><td>DynaMag - 96</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96-Well-Magnetständer TE-Puffer</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>paramagnetische Beads</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>hochempfindliche DNA-Reagenzien</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA-Bibliothek Prep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>DNA Library Prep</td></tr><tr><td>Kit Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Hochempfindliche D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>hochempfindliche DNA-Reagenzien</td></tr><tr><td>Hochempfindliche D1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>hochempfindliche DNA-Reagenzien</td></tr><tr><td>Multiplex-Oligos (Index-Primer - Set 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex-Oligos</td></tr><tr><td>Multiplex-Oligos (Index-Primer - Set 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex-Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td> G2991AA <td>hochempfindliches DNA-Elektropherogramm-Gerät</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico Beschallungsgerät&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>Wasserbad-Disruputor</td></tr><tr><td>Mischer</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Thermocycler</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>Platte mit 96-Well-Sockel</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Zentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td><td>Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Optische Schlauchstreifen (8x Streifen)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Optische Rohrstreifenkappen (8x Streifen)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Ladespitzen, 10 Stück</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>IKA MS3 Vortex</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>Vortex</td></tr></tbody></table>

eine integrierte plattform für genomweite kartierung von chromatin staaten mit hohem durchsatz chip-sequenzierung im tumorgewebe

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histon-Modifikationen stellen eine wichtige Komponente des das epigenom und eine wichtige regulatorische Rolle bei der Bestimmung der transkriptionellen Status der zugehörigen Loci. Darüber hinaus hat das Vorhandensein von spezifischen Änderungen verwendet worden, die Position und nicht-kodierenden Funktionselemente wie Enhancer für Identität bestimmen. In den letzten Jahren geworden Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-Seq) ein mächtiges Werkzeug bei der Bestimmung der genomweiten Profile der einzelnen Histon-Modifikationen. Jedoch ist es immer deutlicher geworden, dass die kombinatorische Muster von Chromatin Modifikationen, als Chromatin Staaten bezeichnet die Identität und die Natur von der damit verbundenen genomischen Locus bestimmen. Daher, bestehend aus robusten Hochdurchsatz-(HT) Methoden für die Profilerstellung einer Reihe von Histon Modifikation Marken sowie computergestützte Analysen Rohrleitungen in der Lage, Arbeitsabläufe Umgang mit Myriaden von ChIP-Seq profiling Datasets, sind notwendig für umfassende Ermittlung der epigenomischen Staaten in große Anzahl von Proben. Die HT-ChIP-Seq-Workflow, die hier vorgestellten besteht aus zwei Modulen: 1) ein experimentelles Protokoll für die Profilerstellung mehrere Histon-Modifikationen von geringen Mengen an tumorproben und Zell-Linien in einem 96-Well-Format; und 2) eine numerische Daten-Analyse-Pipeline, die vorhandenen Tools zur Berechnung der einzelnen Mark Belegung und kombinatorische Chromatin Zustand Muster kombiniert. Zusammen ermöglichen diese beiden Module einfache Verarbeitung von Hunderten von ChIP-Seq-Proben in eine schnelle und effiziente Weise. Die hier vorgestellten Workflow wird verwendet, um 6 Histon Mark Profile in Melanom Tumoren und Zelllinien Chromatin Zustand Muster abgeleitet. Insgesamt präsentieren wir Ihnen einen umfassende ChIP-Seq-Workflow, der die Dutzende von menschlichen tumorproben und Krebszelllinien festzustellen, epigenomischen Aberrationen in verschiedenen Tumoren angewendet werden kann.

Dieses Protokoll ermöglicht die Immunopräzipitation aus gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien, die auf Dutzenden von Proben parallel mit einer Hochdurchsatz-Methode (Abbildung 1A)ausgeführt werden können. Chromatin Fragmente sollte im Bereich zwischen ~ 200-1000 bps für optimale Immunopräzipitation. Wir haben festgestellt, dass der Zeitaufwand für die Schur die selbe zu erreichen für verschiedene Gewebe und Zelltypen unterscheidet sich. Der ...

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, kombinatorische Chromatinzustandsmuster in Tumorgeweben und Krebszelllinien unvoreingenommen zu identifizieren. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Krebsepigenetik zu beantworten, z. B. wie ein unfruchtbarer Histonmodifikationszustand zur Tumorgenese beitragen könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl mehrere Histonmodifikationen als auch mehrere Proben gleichzeitig und effizient verarbeitet werden können.Dissoziieren Sie zunächst 50 Milligramm Melanomgewebe manuell und zwei Milliliter Hank's Balanced Salt Solution oder HBSS mit einer sterilen Rasierklinge. Zerkleinern Sie das Gewebe etwa fünf Minuten lang in einer sterilen Gewebekulturschale in drei oder vier Millimeter große Stücke. Übertragen Sie die Gewebelösung in ein Dissoziatorröhrchen und fügen Sie weitere Achtel Milliliter HBSS hinzu.Dissoziieren Sie das Gewebe mit einem Dissoziator weiter, bis es homogenisiert ist. Als nächstes vernetzen Sie das Gewebe und fügen 200 Mikroliter 16%iges Formaldehyd pro drei Milliliter HBSS hinzu. Schütteln Sie die Mischung mit einem Mixer bei 10 U/min genau 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Nachdem Sie die Probe aus dem Inkubator entnommen haben, fügen Sie 200 Mikroliter tumorales Glycin pro drei Milliliter Probe hinzu und schütteln Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Probe wird mit einer Tischzentrifuge fünf Minuten lang bei 934 g bei vier Grad Celsius gedreht. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter eiskaltes PBS hinzu.Dann zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 934 mal g und entfernen Sie dann den Überstand. Geben Sie 300 Mikroliter ChIP-Erntepuffer mit Proteaseinhibitoren pro 50 Milligramm Gewebe hinzu und lysieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis. Während die Zellen lysieren, schalten Sie den Wasserbad-Disruptor und das zugehörige Kühlsystem ein und lassen Sie die Temperatur vier Grad Celsius erreichen.Legen Sie das Ultraschallröhrchen in den Wasserbad-Disruptor und beschallen Sie das Melanomgewebe für 60 Zyklen bei 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus, um Chromatinfragmente von 200 bis 600 Basenpaaren zu erhalten. Für acht Milligramm Melanomgewebe inkubieren Sie drei Mikrogramm jedes Histon-Antikörpers mit 20 Mikrolitern Protein-g-Magnetkügelchen und 100 Mikrolitern Bindungsblockpuffer für zwei Stunden bei vier Grad Celsius mit Drehung unter Verwendung eines Röhrchenrevolvers. Nach der Beschallung verdünnen Sie die Probe fünfmal mit ChIP-Verdünnungspuffer, um die SDS-Konzentration auf 0,1 % zu senken. Nachdem die Inkubation des Antikörpers und des magnetischen Protein-g-Beads abgeschlossen ist, entfernen Sie den ChIP-Verdünnungspuffer und suspendieren Sie die Kügelchen erneut in 240 Mikrolitern des frischen Puffers.Geben Sie dann 20 Mikroliter Aliquots der Kügelchen in 12 separate Röhrchen, von denen jedes für eine separate Gewebeprobe verwendet wird. Aliquotieren Sie das beschallte Material gleichmäßig zu den Protein-g-Kügelchen mit spezifischem Antikörper und drehen Sie die Röhrchen mit einem Röhrchenrevolver über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Antikörperproteinlösung am Morgen nach dem Reverse Crosslinking auf eine 96-Well-Platte und legen Sie sie auf einen Magnetständer.Nachdem Sie die Kügelchen mindestens 30 Sekunden lang haften gelassen haben, entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit 150 Mikrolitern eiskaltem RIPA-Waschpuffer mit einer Mehrkanalpipette. Bewegen Sie den Magneten 30 Sekunden lang kontinuierlich pro Waschgang und entfernen Sie dann den Überstand.Fügen Sie nach den Waschschritten einen Elutionspuffer-Mastermix hinzu, der 44 Mikroliter Direktelutionspuffer, einen Mikroliter Rnase und fünf Mikroliter Protenase k pro Chip enthält, und geben Sie die Probe für die Rückvernetzung ein. Inkubieren Sie die Proben mit einem PCR-Thermocycler vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, vier Stunden bei 50 Grad Celsius und acht bis 16 Stunden bei 65 Grad Celsius. Am nächsten Morgen legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und übertragen den Überstand auf eine neue 96-Well-PCR-Platte, die die Amino-gefällte DNA enthält.Geben Sie 2,3 x paramagnetische Kügelchen in die Lösung und pipettieren Sie vorsichtig 25 Mal mit einer Mehrkanalpipette auf und ab. Anschließend vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie dann die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie weitere vier Minuten bei Raumtemperatur.Nach dem Verwerfen des Überstands werden 150 Mikroliter 70%iges Ethanol zu den Proben gegeben und 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, ohne die Kügelchen zu stören. Nachdem Sie die Kügelchen trocknen gelassen haben, nehmen Sie die Proben aus dem Magneten und fügen Sie 30 Mikroliter 10 Millimolar Traceal hinzu. Mischen Sie, indem Sie 25 Mal pipettieren.Nachdem Sie die Proben bei Raumtemperatur inkubiert haben, legen Sie sie wieder auf den Magneten und inkubieren Sie weitere vier Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie 20 Mikroliter jeder Probe auf eine neue 96-Well-Platte für die Bibliotheksvorbereitung. Entnehmen Sie nach der PCR-Amplifikation die Proben und bringen Sie das Gesamtvolumen mit kernfreiem Wasser auf 100 Mikroliter.Führen Sie eine doppelseitige paramagnetische Größenauswahl durch, indem Sie zuerst 55 Mikroliter Kügelchen zu jeder Probe hinzufügen und 25 Mal mit einer Pipette mischen. Dann vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie sie weitere vier Minuten bei Raumtemperatur, um große Fragmente auf den Kügelchen zu erhalten, die für die Sequenzierung ungeeignet sind.Übertragen Sie den Überstand nach der Inkubation auf eine neue 96-Well-PCR-Platte. Fügen Sie weitere 25 Mikroliter paramagnetische Kügelchen hinzu und mischen Sie, indem Sie 25 Mal pipettieren und bei Raumtemperatur vier Minuten lang ohne den Magneten inkubieren. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur.Entsorgen Sie dann den Überstand. Während Sie die Proben auf dem Magneten belassen, fügen Sie 150 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu und inkubieren Sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur, ohne die Kügelchen zu stören. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie den Waschvorgang.Nachdem Sie die Kügelchen trocknen gelassen haben, nehmen Sie die Proben aus dem Magneten und fügen Sie 25 Mikroliter 10 Millimolar Traceal pH 8,0 hinzu. Mischen Sie, indem Sie 25 Mal pipettieren und bei Raumtemperatur inkubieren, ohne den Magneten vier Minuten lang zu entfernen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur.Quantifizieren Sie nun die Bibliotheken mit einem hochempfindlichen DNA-Elektropherogramm-Instrument vor dem Multiplexing, um sicherzustellen, dass die Größen für die Sequenzierung geeignet sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Immunpräzipitation von gefrorenen Tumorgeweben und Zelllinien, die an Dutzenden von Proben und parallel mit einer Hochdurchsatzmethode durchgeführt werden kann. Die Chromatinfragmente sollten zwischen 200 und 1000 Basenpaaren liegen, um eine optimale Immunpräzipitation zu gewährleisten.Aufgereinigte ChIP-DNA sollte quantifiziert werden, bevor mit der Bibliotheksvorbereitung fortgefahren wird. Fertige Bibliotheken, die für Multiplexing und Next Generation Sequencing geeignet sind, sollten zwischen 200 und 600 Basenpaaren liegen und frei von Primer-Dimeren sein. Nach der Sequenzierung gibt es viele Qualitätskontrollmetriken, die erfüllt sein sollten, bevor Sie mit weiteren Schritten der Pipeline fortfahren, z. B. macs peak calling und chromHmm analysis.ChIP-Proben sollten über die Eingangs-DNA angereichert werden, und jede Histonmodifikation sollte ein eindeutiges Profil aufweisen, das eine bestimmte Komponente der epigenetischen Landschaft darstellt. Der Chrom-HMM-Algorithmus verwendet ein multivariates Hidden-Markov-Modell, um die prominentesten wiederkehrenden kombinatorischen und räumlichen Chromatinmuster basierend auf den untersuchten Histonmodifikationen zu identifizieren. Unter Verwendung dieser sechs Modifikationen identifiziert Chrom HMM funktionell unterschiedliche Chromatinzustände, die sowohl repressive als auch aktive Domänen repräsentieren, wie z. B. Polycomb-Repression, heterochromatische Repression, aktive Transkription und aktive Enhancer.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die optimalen Beschallungsbedingungen und die Spezifikation für Antikörper zu bestimmen, bevor mit der Bibliotheksvorbereitung und Datenanalyse fortgefahren wird. Zum Erlernen dieses Verfahrens können andere Methoden, wie z. B. RRS-Sequenzierung und Chromosomenbestätigungserfassung, durchgeführt werden, um die Koalition von Chromatinzustandsteilen mit Genexpression und höherer Chromatinstruktur zu bestimmen.Nach dem Experiment hat die Technik Forschern auf dem Gebiet der Krebsepigenetik den Weg geebnet, um Chromatinzustandsmuster in Tumorproben von Patienten zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tumorgewebe verarbeitet und dissoziiert, Chromatin-Immunpräzipitation durchführt, Bibliotheken für die Nextgen-Sequenzierung vorbereitet, Post-Sequencing-Daten verarbeitet und Einblicke in die ersten Schritte der Downstream-Analyse erhält. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. ein geeigneter Abzug.

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Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe (Video) | JoVE Journal

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

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