Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, kombinatorische Chromatinzustandsmuster in Tumorgeweben und Krebszelllinien unvoreingenommen zu identifizieren. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Krebsepigenetik zu beantworten, z. B. wie ein unfruchtbarer Histonmodifikationszustand zur Tumorgenese beitragen könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl mehrere Histonmodifikationen als auch mehrere Proben gleichzeitig und effizient verarbeitet werden können.

Dissoziieren Sie zunächst 50 Milligramm Melanomgewebe manuell und zwei Milliliter Hank's Balanced Salt Solution oder HBSS mit einer sterilen Rasierklinge. Zerkleinern Sie das Gewebe etwa fünf Minuten lang in einer sterilen Gewebekulturschale in drei oder vier Millimeter große Stücke. Übertragen Sie die Gewebelösung in ein Dissoziatorröhrchen und fügen Sie weitere Achtel Milliliter HBSS hinzu.

Dissoziieren Sie das Gewebe mit einem Dissoziator weiter, bis es homogenisiert ist. Als nächstes vernetzen Sie das Gewebe und fügen 200 Mikroliter 16%iges Formaldehyd pro drei Milliliter HBSS hinzu. Schütteln Sie die Mischung mit einem Mixer bei 10 U/min genau 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Probe aus dem Inkubator entnommen haben, fügen Sie 200 Mikroliter tumorales Glycin pro drei Milliliter Probe hinzu und schütteln Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Probe wird mit einer Tischzentrifuge fünf Minuten lang bei 934 g bei vier Grad Celsius gedreht. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter eiskaltes PBS hinzu.

Dann zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 934 mal g und entfernen Sie dann den Überstand. Geben Sie 300 Mikroliter ChIP-Erntepuffer mit Proteaseinhibitoren pro 50 Milligramm Gewebe hinzu und lysieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis. Während die Zellen lysieren, schalten Sie den Wasserbad-Disruptor und das zugehörige Kühlsystem ein und lassen Sie die Temperatur vier Grad Celsius erreichen.

Legen Sie das Ultraschallröhrchen in den Wasserbad-Disruptor und beschallen Sie das Melanomgewebe für 60 Zyklen bei 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus, um Chromatinfragmente von 200 bis 600 Basenpaaren zu erhalten. Für acht Milligramm Melanomgewebe inkubieren Sie drei Mikrogramm jedes Histon-Antikörpers mit 20 Mikrolitern Protein-g-Magnetkügelchen und 100 Mikrolitern Bindungsblockpuffer für zwei Stunden bei vier Grad Celsius mit Drehung unter Verwendung eines Röhrchenrevolvers. Nach der Beschallung verdünnen Sie die Probe fünfmal mit ChIP-Verdünnungspuffer, um die SDS-Konzentration auf 0,1 % zu senken. Nachdem die Inkubation des Antikörpers und des magnetischen Protein-g-Beads abgeschlossen ist, entfernen Sie den ChIP-Verdünnungspuffer und suspendieren Sie die Kügelchen erneut in 240 Mikrolitern des frischen Puffers.

Geben Sie dann 20 Mikroliter Aliquots der Kügelchen in 12 separate Röhrchen, von denen jedes für eine separate Gewebeprobe verwendet wird. Aliquotieren Sie das beschallte Material gleichmäßig zu den Protein-g-Kügelchen mit spezifischem Antikörper und drehen Sie die Röhrchen mit einem Röhrchenrevolver über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Antikörperproteinlösung am Morgen nach dem Reverse Crosslinking auf eine 96-Well-Platte und legen Sie sie auf einen Magnetständer.

Nachdem Sie die Kügelchen mindestens 30 Sekunden lang haften gelassen haben, entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit 150 Mikrolitern eiskaltem RIPA-Waschpuffer mit einer Mehrkanalpipette. Bewegen Sie den Magneten 30 Sekunden lang kontinuierlich pro Waschgang und entfernen Sie dann den Überstand.

Fügen Sie nach den Waschschritten einen Elutionspuffer-Mastermix hinzu, der 44 Mikroliter Direktelutionspuffer, einen Mikroliter Rnase und fünf Mikroliter Protenase k pro Chip enthält, und geben Sie die Probe für die Rückvernetzung ein. Inkubieren Sie die Proben mit einem PCR-Thermocycler vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, vier Stunden bei 50 Grad Celsius und acht bis 16 Stunden bei 65 Grad Celsius. Am nächsten Morgen legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und übertragen den Überstand auf eine neue 96-Well-PCR-Platte, die die Amino-gefällte DNA enthält.

Geben Sie 2,3 x paramagnetische Kügelchen in die Lösung und pipettieren Sie vorsichtig 25 Mal mit einer Mehrkanalpipette auf und ab. Anschließend vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie dann die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie weitere vier Minuten bei Raumtemperatur.

Nach dem Verwerfen des Überstands werden 150 Mikroliter 70%iges Ethanol zu den Proben gegeben und 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, ohne die Kügelchen zu stören. Nachdem Sie die Kügelchen trocknen gelassen haben, nehmen Sie die Proben aus dem Magneten und fügen Sie 30 Mikroliter 10 Millimolar Traceal hinzu. Mischen Sie, indem Sie 25 Mal pipettieren.

Nachdem Sie die Proben bei Raumtemperatur inkubiert haben, legen Sie sie wieder auf den Magneten und inkubieren Sie weitere vier Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie 20 Mikroliter jeder Probe auf eine neue 96-Well-Platte für die Bibliotheksvorbereitung. Entnehmen Sie nach der PCR-Amplifikation die Proben und bringen Sie das Gesamtvolumen mit kernfreiem Wasser auf 100 Mikroliter.

Führen Sie eine doppelseitige paramagnetische Größenauswahl durch, indem Sie zuerst 55 Mikroliter Kügelchen zu jeder Probe hinzufügen und 25 Mal mit einer Pipette mischen. Dann vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie sie weitere vier Minuten bei Raumtemperatur, um große Fragmente auf den Kügelchen zu erhalten, die für die Sequenzierung ungeeignet sind.

Übertragen Sie den Überstand nach der Inkubation auf eine neue 96-Well-PCR-Platte. Fügen Sie weitere 25 Mikroliter paramagnetische Kügelchen hinzu und mischen Sie, indem Sie 25 Mal pipettieren und bei Raumtemperatur vier Minuten lang ohne den Magneten inkubieren. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entsorgen Sie dann den Überstand. Während Sie die Proben auf dem Magneten belassen, fügen Sie 150 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu und inkubieren Sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur, ohne die Kügelchen zu stören. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie den Waschvorgang.

Nachdem Sie die Kügelchen trocknen gelassen haben, nehmen Sie die Proben aus dem Magneten und fügen Sie 25 Mikroliter 10 Millimolar Traceal pH 8,0 hinzu. Mischen Sie, indem Sie 25 Mal pipettieren und bei Raumtemperatur inkubieren, ohne den Magneten vier Minuten lang zu entfernen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur legen Sie die Proben wieder auf den Magneten und inkubieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur.

Quantifizieren Sie nun die Bibliotheken mit einem hochempfindlichen DNA-Elektropherogramm-Instrument vor dem Multiplexing, um sicherzustellen, dass die Größen für die Sequenzierung geeignet sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Immunpräzipitation von gefrorenen Tumorgeweben und Zelllinien, die an Dutzenden von Proben und parallel mit einer Hochdurchsatzmethode durchgeführt werden kann. Die Chromatinfragmente sollten zwischen 200 und 1000 Basenpaaren liegen, um eine optimale Immunpräzipitation zu gewährleisten.

Aufgereinigte ChIP-DNA sollte quantifiziert werden, bevor mit der Bibliotheksvorbereitung fortgefahren wird. Fertige Bibliotheken, die für Multiplexing und Next Generation Sequencing geeignet sind, sollten zwischen 200 und 600 Basenpaaren liegen und frei von Primer-Dimeren sein. Nach der Sequenzierung gibt es viele Qualitätskontrollmetriken, die erfüllt sein sollten, bevor Sie mit weiteren Schritten der Pipeline fortfahren, z. B. macs peak calling und chromHmm analysis.

ChIP-Proben sollten über die Eingangs-DNA angereichert werden, und jede Histonmodifikation sollte ein eindeutiges Profil aufweisen, das eine bestimmte Komponente der epigenetischen Landschaft darstellt. Der Chrom-HMM-Algorithmus verwendet ein multivariates Hidden-Markov-Modell, um die prominentesten wiederkehrenden kombinatorischen und räumlichen Chromatinmuster basierend auf den untersuchten Histonmodifikationen zu identifizieren. Unter Verwendung dieser sechs Modifikationen identifiziert Chrom HMM funktionell unterschiedliche Chromatinzustände, die sowohl repressive als auch aktive Domänen repräsentieren, wie z. B. Polycomb-Repression, heterochromatische Repression, aktive Transkription und aktive Enhancer.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die optimalen Beschallungsbedingungen und die Spezifikation für Antikörper zu bestimmen, bevor mit der Bibliotheksvorbereitung und Datenanalyse fortgefahren wird. Zum Erlernen dieses Verfahrens können andere Methoden, wie z. B. RRS-Sequenzierung und Chromosomenbestätigungserfassung, durchgeführt werden, um die Koalition von Chromatinzustandsteilen mit Genexpression und höherer Chromatinstruktur zu bestimmen.

Nach dem Experiment hat die Technik Forschern auf dem Gebiet der Krebsepigenetik den Weg geebnet, um Chromatinzustandsmuster in Tumorproben von Patienten zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tumorgewebe verarbeitet und dissoziiert, Chromatin-Immunpräzipitation durchführt, Bibliotheken für die Nextgen-Sequenzierung vorbereitet, Post-Sequencing-Daten verarbeitet und Einblicke in die ersten Schritte der Downstream-Analyse erhält. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. ein geeigneter Abzug.