Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine erfolgreiche Leberperfusion an der Maus durchzuführen, um die Aufreinigung spezifischer Leberzellpopulationen von Interesse zu erleichtern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Hepatologie zu beantworten, wie die Funktionen bestimmter Leberzellpopulationen in in vitro oder in vivo Assays unterstützt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Menge an Hepatozyten in sinusförmigen Endothelzellen, die aus jeder Leber gewonnen werden können.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es wichtig ist, die Farbe und Form einer optimal verdauten Leber zu sehen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Um den Pfortaderkatheter zu platzieren, bewegen Sie zunächst mit der Rückseite einer Pinzette den Darm auf die rechte Seite der Bauchhöhle der Maus, wodurch die Pfortader freigelegt wird, und schieben Sie mit einer gebogenen Pinzette ein 20 Zentimeter langes Stück Polyester-Nähgarn unter die Pfortader zwischen der Leber und der Vena duodenal superior Pankreas. Ziehe den Faden mit der Pinzette vorsichtig auf die andere Seite des Tieres, so dass er unter der Pfortader zentriert ist.

Und binden Sie einen losen Überkopfknoten um die Pfortader. Platzieren Sie die gebogene Pinzette unter der Vene und ziehen Sie vorsichtig das gesamte Gewebematerial in Richtung Schwanz, um die Vene zu begradigen. Platzieren Sie dann die Fase einer Katheternadel nach oben und parallel zum unteren Teil der Pfortader in der Nähe der Pinzette und stechen Sie vorsichtig mit der Nadel in die Vene.

Wenn sich die Fase im Lumen der Vene befindet, ziehen Sie die federbelastete Nadel zurück und schieben Sie den Palmer-Katheter weiter durch die Vene, bis sich die Fase in der Nähe des verzweigten Bereichs der Venus befindet. Nachdem Sie den Knoten um den Katheter befestigt haben, stellen Sie die Peristaltikpumpe sofort auf vier Millimeter pro Minute ein und verbinden Sie das männliche Ende des Schlauchs mit dem weiblichen Ende des Katheters, woraufhin Sie den Leberast sehen sollten. Schneiden Sie die Aorta abdominalis für die Drainage ab.

Verwenden Sie Kreppband, um den Schlauch auf dem Unterpolster zu fixieren. Schneiden Sie mit der Schere die Bauchhaut senkrecht ein, damit das Blut und die Durchblutungsflüssigkeit abfließen können. Drücken Sie dann das abfließende Blutgefäß einige Male mit der geraden Pinzette zusammen, um die Leber aufzublasen, stellen Sie sicher, dass das gesamte Blut abgeflossen ist, und perfundieren Sie die Leber mit PBS, bis das Lebergewebe blanchiert.

Um die Hepatozyten zu gewinnen, wechseln Sie zunächst den Ausflussschlauch von dem Ein-Liter-Kolben PBS gegen einen 125-Milliliter-Kolben, der Puffer zwei enthält, ergänzt mit Kollagenase-4. Wenn die Kollagenase die Leber erreicht, drücken Sie kurz, aber fest auf das abfließende Blutgefäß, um Druck aufzubauen und dem Verdauungspuffer zu ermöglichen, alle Leberlappen zu füllen. Lassen Sie das Gefäß los, bevor der Puffer das Bindegewebe um die Leber herum durchbricht.

Und lassen Sie den Puffer durch die Leber perfundieren, bis das gesamte Volumen durch das Gewebe geflossen ist. Stellen Sie als Nächstes eine Kristallisationsschale mit 10 Millilitern Puffer neben die Maus und verwenden Sie eine gerade Pinzette und eine Schere, um die Leber in die Schale zu übertragen. Übertragen Sie die Schale in eine sterile Gewebekulturhaube und greifen Sie mit steriler Technik die Leber, um die Kapsel zu schälen.

Schütteln Sie die Zellen vorsichtig aus dem Lebergewebe und gießen Sie die resultierende Zelllösung durch einen 100-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie dann die Leberreste mit mehr Puffer aus dem Filter. Wenn die Leber zellfrei zu sein scheint, seihen Sie das gezogene Filtrat durch einen 40-Mikron-Filter in ein zweites 50-Milliliter-Röhrchen ab und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Gießen Sie die nicht-parenchymale Zelle und den abgestorbenen Hepatozyten, die den Überstand enthalten, in einer Bewegung in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis, um das Pellet zu konservieren, und suspendieren Sie das Pellet in 40 Millilitern frischem Puffer für die nächste Zentrifugation. Um die sinusförmigen Endothelzellen zu isolieren, zentrifugieren Sie die Überstände, die nicht-parenchymale Zellen enthalten. Ziehen Sie die Zellsuspensionen in ein einziges neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 35 Milliliter.

Sammeln Sie die entnommenen Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie mit einer 25-Milliliter-Pipette vorsichtig die oberen 25 Milliliter der nicht-parenchymalen Zelle, die den Überstand enthält, in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Geben Sie 25 Milliliter frisches Medium in das Röhrchen und suspendieren Sie das Pellet für eine zweite Zentrifugation und Entfernung des Überstands. Dann zentrifugieren Sie den Überstand und geben Sie 15 Milliliter einer 50%igen Percoll-Lösung in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Mit einer Pipette, die auf die niedrigste Auswurfgeschwindigkeit eingestellt ist, überlagern Sie 20 Milliliter 25 % Percoll mit der 50 %igen Percoll-Lösung und resuspendieren Sie die nicht-parenchymalen Zellen in 10 Millilitern mit einem vier Grad Celsius heißen Medium. Schichten Sie die Zellen vorsichtig auf die Percoll-Lösung. Und trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation.

Als nächstes aspirieren Sie die ersten 30 Milliliter der Lösung und verwenden eine Fünf-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff, um die sinusförmigen Endothel- und Kupffer-Zellen, die sich an der Interphase der Gradientenlösung mit einer Dichte von 25 bis 50 % befinden, in einem neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln. Waschen Sie die Zellen mit 50 Millilitern Medium und suspendieren Sie das Pellet erneut, während Sie die Seiten des Röhrchenbodens mit 12 Millilitern warmem Medium abspülen. Um die sinusförmigen Endothelzellen von den Kupffer-Zellen zu trennen, wird die Zellsuspension für acht Minuten in eine Petrischale aus Polystyrol in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator überführt.

Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um den Überstand zu aspirieren, und verwenden Sie den Überstand, um die Schale mit der Pipette auf die niedrigste Geschwindigkeit zu spülen, um die verbleibenden sinusförmigen Endothelzellen zu sammeln. Dann überführen Sie die sinusförmigen Endothelzellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation für ihre Resuspension und Plattierung in mit Kollagen beschichteten Zellkulturschalen gesammelt.

Die Rasterelektronenmikroskopie einer Mausleber nach PBS-infixiver Perfusion in ähnlicher Weise wie die gerade gezeigte zeigt einen klaren Blick auf die Mikroanatomie der Leber und die Mikrovilli zwischen den Hepatozyten. Hepatozyten, die während der langsamen Spins zu Beginn des Verfahrens entnommen wurden, zeigen nach vier Wäschen in Rinderserumalbumin, das Puffer enthält, eine hohe Reinheit. Die Trennung der sinusförmigen Endothelzellen durch selektive Adhäsion auf einer kollagenbeschichteten Polystyrol-Petrischale führt zu einer Reinheit von 83 bis 90 %, die maßgeblich von der Gesamtwirksamkeit des Kollagenaseverdaus abhängt.

Quantitative Messungen mittels Lichtmikroskopie aus einem repräsentativen Trennverfahren, wie gerade gezeigt, zeigen typische Isolationsergebnisse einer nahezu 100%reinen Hepatozytenpopulation. Und eine etwas mehr als 89%reine sinusförmige Endothelzellpopulation. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Maus-Pfortader kathetisiert und wie man sowohl Hepatozyten als auch sinusoidale Endothelzellen aus der Mausleber reinigt.

Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Satellitenzellen aus der nicht-parenchymalen Fraktion nach der Hepatozytenisolierung unter Verwendung unterschiedlicher Dichtegradienten und Zentrifugationsgeschwindigkeiten zu reinigen.