Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden
May 11th, 2018
Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.
Das übergeordnete Ziel der chemischen Funktionalisierung der Oberfläche von HEV-Nanopartikeln besteht darin, einen wiederholbaren und konsistenten Ansatz für die Konjugation von immunogenen, therapeutischen und diagnostischen Molekülen auf der Oberfläche von HEV-Nanopartikeln zu Diagnose- und Behandlungszwecken bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Nanomedizin zu beantworten, z. B. wie eine verbesserte Ausrichtung auf Krebs und die Verteilung von Nanotherapeutika überwacht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr reproduzierbar, effizient und im Vergleich zur generellen Gentechnik viel einfacher zu erreichen ist.
Die Verfahren werden von Michelle Nguyen und Ivan Ruiz, Forschungsassistenten aus unserem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Herstellung und Reinigung von Nanopartikeln des Hepatitis-E-Virus, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie die HEV-Nanopartikelproben auf 0,5 bis zwei Milligramm pro Milliliter mit 10 Millimolar MES, pH 6,2 für eine TEM-Bildgebung.
Ionisieren Sie die kohlenstoffbeschichteten Gitter 30 Sekunden lang mit einer Glimmentladung von 40 Milliampere, um eine hydrophile Kohlenstoffoberfläche zu erzeugen. Die hydrophile Kohlenstoffoberfläche der Gitter kann nach der Glimmentladungsbehandlung nur 30 Minuten halten. Halten Sie nach der Ionisierung das Gitter und die Pinzette fest und geben Sie zwei Mikroliter der HEV-Nanopartikelprobe in das Gitter.
Tupfen Sie das Gitter nach 15 bis 30 Sekunden mit Filterpapier ab. Dann den Rost sofort mit doppelt destilliertem Wasser waschen und nochmals mit Filterpapier abtupfen. Geben Sie sofort zwei Mikroliter zweiprozentiges Uranylacetat auf das Gitter.
Tupfen Sie das Gitter nach 15 Sekunden mit Filterpapier ab. Trocknen Sie die Probengitter, indem Sie sie über Nacht in einen Trockenschrank mit elektronischem Luftentfeuchter legen. Je nach Probe kann für die Strukturvisualisierung und -charakterisierung eine kryogene Elektronenmikroskopie oder Kryo-EM erforderlich sein.
Übertragen Sie das Gitter in ein TEM und Bild mit einer Vergrößerung von 10 bis 80 K. HEV-Nanopartikel erscheinen in der TEM als leere ikosaedrische Proteine mit einem Durchmesser von etwa 27 Nanometern, da keine virale RNA vorhanden ist. Um die einstufige Konjugation von HEV-Nanopartikeln und Maleimid-gebundenem Biotin durchzuführen, werden die HEV-Nanopartikel zunächst auf Mini-Dialyseeinheiten aufgebracht.
Dialysieren Sie die Nanopartikel gegen 0,01 molare PBS pH 7,4 bei Raumtemperatur für eine Stunde gemäß dem Protokoll des Herstellers. Nach der Dialyse werden die HEV-Nanopartikel in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und mit einem Spektralphotometer die Proteinkonzentration bei 280 Nanometern gemessen. Mischen Sie die Nanopartikel bei einem Milligramm pro Milliliter mit einer gleichen Menge von 100 mikromolaren Maleimid-Biotin und 0,01 molaren PBS pH 7,4, um ein Verhältnis von eins zu fünf molaren zu erhalten.
Nach einer Reaktion über Nacht bei vier Grad Celsius ist das ungebundene Maleimid-Biotin mit einer Schleuder-Entsalzungssäule gemäß dem Protokoll des Herstellers zu entfernen. Analysieren Sie die Stichproben über eine standardmäßige Seite zur Reduzierung des Sicherheitsdatenblatts. Unter Verwendung der Standardverfahren wird ein chemilumineszierender Western Blot mit HRP-gebundenem Streptavidin hergestellt und das Chemilumineszenzsignal mittels Röntgenfilm erfasst.
Um eine zweistufige Konjugation des brustkrebszellspezifischen Liganden LXY30 mit oberflächenexponiertem Cystein auf HEV-Nanopartikeln durchzuführen, tragen Sie die Nanopartikel zunächst auf Mini-Dialyseeinheiten auf und dialysieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur gegen 0,01 molare PBS pH 7,4. Dann überführen Sie die HEV-Nanopartikel in 1,5-Milliliter-Röhrchen und messen die Proteinkonzentration bei 280 Nanometern mit einem Spektralphotometer. Kombinieren Sie als nächstes 650 mikromolare Maleimidazid und 650 mikromolare Alkine LXY30 mit 200 mikromolaren Kupfersulfat und einer millimolaren Ascorbinsäure.
Dabei bildet sich das Maleimid-gebundene LXY 30 bei 650 Mikromolaren. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius. Mischen Sie am nächsten Tag die HEV-Nanopartikel auf ein Milligramm pro Milliliter mit etwa 10 Vol.-% Maleimid-gebundenem LXY 30, um ein Verhältnis von eins zu drei molaren zu erhalten.
Reagieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Aufgrund der relativ hohen Konzentration von Maleimid LXY 30 werden die Endkonzentrationen der Reaktanten wie z.B. Kupfersulfat nach dem Mischen etwa um das 10-fache reduziert. Um ihre Schädigung der Nanopartikel des Hepatitis-E-Virus zu vermeiden, ist eine weitere Option die Methode der kupferfreien Einbringung.
Entfernen Sie das ungebundene Maleimid click LXY 30 mit einer Spin-Entsalzungssäule gemäß dem Protokoll des Herstellers. Halten Sie die LXY 30-verknüpften HEV-Nanopartikel bei vier Grad Celsius. Um eine einstufige Konjugation der LXY 30 HEV-Nanopartikel und des Cy5.5-Fluoreszenztags durchzuführen, mischen Sie zunächst die LXY 30-verknüpften Nanopartikel auf ein Milligramm pro Milliliter mit einem gleichen Volumen des Cy5.5-Fluoreszenz-Tags, um ein molares Verhältnis von eins zu fünf zu erhalten.
Nachdem das Gemisch über Nacht bei vier Grad Celsius reagiert hat, wird das ungebundene Cy5.5 NHS mit einer Schleuder-Entsalzungssäule gemäß dem Protokoll des Herstellers entfernt. Halten Sie die LXY 30 Cy5.5-verknüpften HEV-Nanopartikel bei vier Grad Celsius. Es wurden zwei Methoden zur LXY 30-Funktionalisierung von HEV-Nanopartikeln für das Targeting von Tumorzellen versucht.
Als HEV 573C-Nanopartikel zuerst an Maleimidazid gebunden wurden, gefolgt von einer Click-Chemie-Reaktion mit LXY 30-Alkin, schienen sich die HEV 573C-Nanopartikel unter TEM-Beobachtung zu zerlegen. Eine anfängliche Click-Chemie-Reaktion zwischen LXY 30 Alkin und Maleimidazid zur Bildung des Maleimid-gebundenen LXY 30, gefolgt von einer Konjugation zur Unterstützung modifizierter HEV-Nanopartikel, beeinflusste jedoch nicht deren Struktur und die HEV 573C-Nanopartikel blieben intakt. LXY 30- und Cy5.5-verknüpfte HEV-Nanopartikel wurden auf kultivierte Brustkrebszellen aufgebracht und durch konfokale Mikroskopie beobachtet.
Die Nahinfrarot-Fluoreszenzbilder der konfokalen Mikroskopie deuten darauf hin, dass LXY 30 Cy5.5-verknüpfte HEV-Nanopartikel im Vergleich zu Cy5.5-verknüpften HEV-Nanopartikeln eine höhere Bindungsaffinität für eine erhöhte Internalisierung in MDA MB 231-Brustkrebszellen aufwiesen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Untersuchung von multimodalen Targeting- und therapeutischen Molekülen, die eine genaue Ausrichtung und Diagnose von Tumoren ermöglichen, ohne normale Zellen zu schädigen. Obwohl diese Methode Einblicke in Krebs und Tumor-Targeting durch chemische Oberflächenmodulierung geben kann, kann sie auch für die Krebsfrüherkennung, das Screening und die bildgebende Behandlung eingesetzt werden.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Diese Studie präsentiert die Entwicklung des Hepatitis-E-Virus-Kapsidproteins zu einem theranostischen Nanopartikel (HEVNP) für die gezielte Tumortherapie. Die HEVNPs werden modifiziert, um die Tumoranvisierung durch die Konjugation synthetischer Liganden zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Nanomedizin
- Theranostik
- Onkologie
Hintergrund
- HEVNPs selbstassemblieren sich zu stabilen Strukturen.
- Die Modifikation von Nanopartikeln kann die Anvisierungsfähigkeiten verbessern.
- Das Verständnis der Verteilung von Therapeutika ist entscheidend für die Krebsbehandlung.
- Dieser Ansatz ist effizienter im Vergleich zu traditionellen Gentechnikmethoden.
Ziel der Studie
- Eine konsistente Methode zur funktionalisierten HEVNPs zu entwickeln.
- Die Anvisierung von Krebszellen mithilfe synthetischer Liganden zu verbessern.
- Die Diagnose und Behandlung von Tumoren zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Produktion und Reinigung von HEV-Nanopartikeln.
- Verdünnung von HEVNP-Proben für die Bildgebung.
- Konjugation von Liganden an oberflächenexponierte Cystein-Reste.
- Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Analyse.
Hauptergebnisse
- HEVNPs können effektiv für die Tumoranvisierung modifiziert werden.
- Die Konjugationsmethode ist reproduzierbar und effizient.
- Verbesserte Anvisierung von Krebszellen wurde nachgewiesen.
- Potenzielle Anwendungen in der Diagnostik und Therapie wurden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- HEVNPs stellen eine vielversprechende Plattform für die Krebstherapie dar.
- Oberflächenmodifikation ermöglicht die gezielte Abgabe von therapeutischen Wirkstoffen.
- Diese Methode könnte das Feld der Nanomedizin voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
