Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der RNA-Biologie zu beantworten, wie z.B. welche biologische Bedeutung RdRP oder TERT in menschlichen Zellen hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sich dieser Assay als erste empfindliche Methode zum Nachweis der in Zellen exprimierten humanen RdRP-Aktivität etabliert hat. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Aufbereitung der HeLa-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS. Zentrifugieren Sie dann die Probe fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei der 1.450-fachen Schwerkraft und verwerfen Sie den Überstand. Verwenden Sie einen Milliliter eiskalten Lysis Buffer A pro 10 Millionen Zellen, um die Zellen durch schonendes Pipettieren zu lysieren.

Beschallen Sie die Probe in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei einer Ultraschallverstärkerverstärkung von 25 % für 10 Sekunden. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 20, 400-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie jeweils einen Milliliter des Überstands in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Reinigen Sie das Lysat vor, indem Sie 40 Mikroliter vorgewaschene Protein-A-Agarose-Kügelchen pro einem Milliliter des Lysats hinzufügen. Gut mischen, indem Sie die Tube mehrmals umdrehen. Drehen Sie dann die Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Die Probe wird eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 13.000-facher Schwerkraft zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter vorgewaschene Protein-A-Agarose-Kügelchen und 10 Mikrogramm Anti-Human-TERT-Antikörper in das vorgeklärte Lysat hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen und die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius drehen.

Nach der Zentrifugation bei 3.300-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius wird der Überstand entfernt. Waschen Sie anschließend die Kügelchen mit Wash Buffer One. Geben Sie einen Milliliter Wash Buffer One zu den Perlen und mischen Sie es gut, indem Sie die Tube umdrehen.

Drehen Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.300-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male.

Nach der AGC-Lösungswäsche, wie im Textprotokoll beschrieben, behandeln Sie die Kügelchen mit Mikrokokken-Nuklease, indem Sie sie in 60 Mikrolitern des Mikrokokken-Nuklease-Reaktionsgemisches durch sanftes Pipettieren resuspendieren. Schütteln Sie dann die Probe vorsichtig auf einem Drehteller eines Schüttlers, der in einem Peltier-Inkubator aufgestellt ist, 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren der Probe bei 3.300-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius wird der Überstand entfernt.

Zum Schluss waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einer AGC-Lösung, die drei millimolare EGTA enthält, und waschen Sie die Kügelchen einmal mit Waschpuffer Zwei, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie das RdRP-Reaktionsgemisch in einem neuen Röhrchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie sechs Mikroliter Uridintriphosphat, das auf der Alpha-Phosphatgruppe mit P-Strich 32 markiert ist, in das Reaktionsgemisch und mischen Sie es durch Pipettieren gut.

Fügen Sie dann der Mischung einen Mikroliter Template-RNA hinzu und mischen Sie gut. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 20 Mikrolitern des resultierenden RdRP-Reaktionsgemisches. Anschließend schütteln Sie die Probe vorsichtig auf einem Drehteller eines Schüttlers, der in einem Peltier-Inkubator aufgestellt ist, zwei Stunden lang bei 32 Grad Celsius.

Nach der Inkubation geben Sie 5,4 Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K und 45,4 Mikroliter 2X Proteinase K Puffer in das Reaktionsgemische. Mischen Sie durch Pipettieren und schütteln Sie die Probe in einem Peltier-Inkubator 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach Zugabe von 109,2 Mikrolitern RNase-freiem Wasser zur Probe werden 200 Mikroliter saures Phenol-Chloroform zugegeben.

Durch Vortex gut mischen, bevor die Probe fünf Minuten lang bei 21, 100-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur zentrifugiert wird. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.

Geben Sie dann 20 Mikroliter drei molare Natriumacetate, pH 5,2, vier Mikroliter Fällungsträger und 250 Mikroliter Ethanol in die wässrige Phase. Schütteln Sie die Tube zum Mischen gut. Zentrifugieren Sie die Probe bei 21, 100-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand.

Waschen Sie das Pellet anschließend mit 300 Mikrolitern kaltem Ethanol mit 70 Vol.-% pro Volumen, das bei minus 20 Grad Celsius gelagert wird. Zentrifugieren Sie die Probe bei 21, 100-facher Schwerkraft für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft.

Suspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Bereiten Sie das RNase-Reaktionsgemisch in einem neuen Röhrchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 180 Mikroliter des RNase-Reaktionsgemisches in die Probe.

Inkubieren Sie das Röhrchen dann zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 2,3 Mikroliter SDS mit 10 Vol.-% pro Volumen in die Probe und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann zwei Mikroliter Proteinase K mit 20 Milligramm pro Milliliter in die Probe und inkubieren Sie weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie nun 205 Mikroliter saures Phenol-Chloroform in die Probe. Nach dem Mischen und Zentrifugieren wie zuvor wird die wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführt. Geben Sie drei molare Natriumacetate, Fällungsträger und Ethanol in die wässrige Phase, gefolgt von Mischen, Zentrifugieren und Waschen des Pellets, wie zuvor durchgeführt.

Hier sind drei repräsentative Ergebnisse des IP-RdRP-Assays in HeLa-Zellen dargestellt, die mit Nocodazol oder DMSO für unmanipulierte Zellen behandelt wurden. Als Template wurde eine chemisch synthetisierte 34-Nukleotid-RNA verwendet. Nach nächtlicher Exposition können RdRP-Produkte zwischen 20 und 30 Nukleotide gesehen werden, spezifisch in HeLa-Zellen innerhalb der mitotischen Phase.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die RdRP-Aktivität von menschlichem TERT erkennen können.