Name: Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie einen semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängiger RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen TERT-Proteins in HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion von RdRP-Aktivität während der Mitose.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Projekt zur Entwicklung der Innovationsforschung auf Cancer Therapeutics (P-direkt) (15cm0106102h0002, k.m.) und das Projekt für Krebsforschung und therapeutische Evolution (P-erstellen) (16 cm 01061150001, k.m.) aus Japan Agency unterstützt für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED; die Takeda Science Foundation (Y.M); Gewährung von Prinzessin Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M); und JSPS KAKENHI Grant-Nummer JP16K07133 (Y.M).

(1) Reagenz Setup
<ol><li>
Reagenzien für die Zelle Synchronisierung
	<ol>
<li>Um 2,5 mM Thymidin-haltigem Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) zu generieren, lösen sich 30,28 mg pro 1 mL Gewebekultur Grade Wasser zuzubereiten 125 mM Thymidin Thymidin. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 μm Spritze Filtereinheit. Fügen Sie 1 mL frisch zubereitete 125 mM Thymidin pro 50 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt.</li>
		<li>Um DMEM mit 0,1 μg/mL Nocodazole zu generieren, lösen sich Nocodazole in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 5 μg/μL Nocodazole vorzubereiten. Fügen Sie 1 µL 5 µg / µL Nocodazole pro 50 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS ergänzt.</li>
		<li>Zum Generieren von DMEM mit 0,002 % (Vol/Vol) von DMSO fügen Sie 1 µL von DMSO pro 50 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS ergänzt hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenzien für IP-Trichothecene-assay
	<ol>
<li>Bereiten Sie Lyse Puffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 0,5 % (Vol/Vol) Nonidet p-40 (NP-40). Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Bereiten Sie 5 x Acetat-Puffer: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Säure (HEPES)-KOH (pH 7,8), Kalium Acetat 500 mM und 20 mM MgCl2. Lagern Sie das Reagenz bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Bereiten Waschpuffer Puffer 1: 1 X Acetat, 10 % (Vol/Vol) Glycerin, 0,1 % (Vol/Vol) Triton X-100 und 0,06 X Proteaseinhibitor cocktail, Ethylenediamenetetraacetic Säure (EDTA)-frei. Waschpuffer 1 am Tag der Verwendung oder am Tag vor dem Gebrauch vorzubereiten. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Bereiten Sie AGC Lösung: 1 x Acetat-Puffer, 10 % (Vol/Vol) Glycerin und 0,02 % (wt/Vol)-3-[(3-Cholamidopropyl)-Dimethylammonio] -1-Propanesulfonat (CHAPS). Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Zum Generieren von AGC-Lösung mit 2 mM CaCl2fügen Sie 100 µL 1 M CaCl2 pro 50 mL AGC-Lösung hinzu. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>AGC-Lösung mit 3 mM Ethylenglykol BIZ (b-Aminoethylether) zu generieren-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA), 375 µL von 0,4 M EGTA (pH 7,5) pro 50 mL AGC-Lösung hinzufügen. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Puffer 2: 1 X Acetat Waschpuffer und 0,02 % (wt/Vol) CHAPS vorbereiten. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>HMD Lösung vorbereiten: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 und 2 mM Dithiothreitol (DTT). Speichern Sie das Reagenz bei-20 ° C. Hinweis: HMD-Lösung sollte mindestens drei Monate erneuert werden.</li>
		<li>2 x Proteinase K-Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA und 1 % (wt/Vol) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Speichern Sie das Reagenz bei-20 ° C.</li>
		<li>2 x Ladepuffer vorbereiten: 95 % (Vol/Vol) Formamid, 20 mM EDTA und 1 % (wt/Vol) Orange G. speichern das Reagenz bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von HeLa-Zellen
Hinweis: Bereiten Sie HeLa-Zellen synchronisierte in mitotischen Phase (manipuliert) oder asynchron dividiert (unmanipuliertes). Kultur der Zellen in Anwesenheit von 5 % CO2 bei 37 ° C.
<ol><li>
Synchronisation von HeLa-Zellen in Mitose
	<ol>
<li>Platte 1 x 106 von HeLa-Zellen mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS in der Kulturschale 10 cm ergänzt.</li>
		<li>Ersetzen Sie zwei Tage nach der Beschichtung, das Medium mit 10 mL DMEM mit 2,5 mM Thymidin und 10 % (Vol/Vol) FBS. Kultur der Zellen für 24 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (-) und die Zellen mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS für 6 h Kultur.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium mit 10 mL DMEM mit 0,1 µg/mL Nocodazole und 10 % (Vol/Vol) FBS und Kultur der Zellen für 14 h.</li>
		<li>Der Kulturschale leicht schütteln, und den überstand der freistehende mitotischen Zellen abrufen. Zählen Sie die Anzahl von Zellen für die IP-Trichothecene-Assay.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 490 X g für 5 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand. Hinweis: Die Zelle-Pellet kann bei-80 ° c aufbewahrt werden</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der unmanipuliertes HeLa-Zellen
	<ol>
<li>Platte 1 x 106 von HeLa-Zellen mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS in der Kulturschale 10 cm ergänzt.</li>
		<li>Ersetzen Sie zwei Tage nach der Beschichtung, das Medium mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS. Kulturzellen Sie für 30 h.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium mit 10 mL DMEM mit 0,002 % (Vol/Vol) DMSO und 10 % (Vol/Vol) FBS und Kultur der Zellen für 14 h.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinization mit 0,7 mL Trypsin (2,5 g/L), 1 mM EDTA enthalten. Zählen Sie die Anzahl von Zellen für die IP-Trichothecene-Assay.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 490 X g für 5 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand. Hinweis: Die Zelle-Pellet kann bei-80 ° c aufbewahrt werden</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-Trichothecene Assay
<ol><li>Protein A-Agarose Bead Vorbereitung
	<ol>
<li>Übertragen Sie 1 mL (Bett Volume 500 µL) Affinität Harz zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Bei 800 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, und den überstand verwerfen.</li>
		<li>Die Perlen 800 µL Lysis Puffer A hinzu, und mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male. Bei 800 X g für 3 min bei 4 ° C zentrifugiert, und den überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).</li>
		<li>Die Perlen 800 µL Lysis Puffer A hinzu, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male. Drehen Sie das Röhrchen über Nacht (oder mindestens 4 Stunden) bei 4 ° C auf einem Dreh Shaker.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 800 X g für 3 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Die Perlen 500 µL Lysis Puffer A hinzu, und mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male. Speichern Sie die Perlen bei 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Zelle lysate
	<ol>
<li>(Optional) Wenn die Zellen in Schritt 2 eingefroren sind, platzieren Sie und tauen Sie die gefrorenen Zellen auf Eis, bis die Zellen verlieren werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL PBS (-). Zentrifugieren Sie die Probe auf 1.450 X g für 5 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Lösen Sie die Zellen mit eiskalten Lysis Puffer (1 mL Lyse Puffer A pro 1 x 107 Zellen) durch sanfte pipettieren.</li>
		<li>Beschallen Sie die Probe in einem 1,5 mL Röhrchen mit folgenden Bedingungen; Verstärkung der sonikator auf 25 % festgesetzt und beschallen für 10 s.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe auf 20.400 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Den überstand zu sammeln. Übertragen Sie 1 mL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Achtung: Führen Sie alle Verfahren unter RNase-freie Bedingungen.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunopräzipitation
	<ol>
<li>Vorab klar lysate aus Schritt 3.2.6 durch Zugabe von 40 µL (Perle Volumen 20 µL) vorgewaschen Protein A-Agarose Perlen pro 1 mL der lysate. Mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male und drehen Sie die Probe für 30 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Zentrifugieren der Probe bei 13.000 X g für 1 min bei 4 ° C, und den überstand zu erholen.</li>
		<li>Hinzufügen von 40 µL (Bett Band 20 µL) vorgewaschen Protein A-Agarose Korne und 10 µg Anti-Human-TERT-Antikörper (Klon: 10E9-2)8 in die vorher gelöscht lysate. Mischen Sie gut durch Umkehrung des Schlauchs mehrmals und drehen Sie die Probe bei 4 ° C über Nacht.</li>
		<li>Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit Waschpuffer 1: die Perlen 1 mL Waschpuffer 1 hinzu, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre, und drehen Sie die Probe für 5 min bei 4 ° c Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen einmal mit AGC-Lösung mit 2 mM CaCl2: 1 mL der AGC-Lösung mit 2 mM CaCl2 bis die Perlen hinzufügen, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre und drehen die Probe für 5 min bei 4 ° C. Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Die Perlen mit Micrococcal Nuklease (MNase) zu behandeln: bereiten Sie das MNase Reaktionsgemisch in Tabelle 1beschrieben. Die Perlen in 60 µL des Reaktionsgemisches MNase durch sanfte pipettieren aufzuwirbeln. Schütteln Sie die Probe vorsichtig (20 bis 25 u/min) auf einer Drehscheibe von einem Boston-Shaker set in einem Peltier-Art Inkubator für 15 min bei 25 ° C. Hinweis: Es ist sehr wichtig, eine wellige Shaker und strikt zu befolgen das Tempolimit in diesem Schritt. Andere Art von Schüttele-Apparat, wie rotierende Mischer werden nicht empfohlen.</li>
		<li>Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen zweimal mit AGC-Lösung mit 3 mM EGTA: 1 mL der AGC-Lösung mit 3 mM EGTA, die Perlen hinzufügen, mischen Sie gut durch das Rohr invertieren und drehen die Probe für 5 min bei 4 ° C. Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen einmal mit Waschpuffer 2: Fügen Sie 1 mL Waschpuffer 2, Perlen, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre, und drehen Sie die Probe für 5 min bei 4 ° c Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen. Halten Sie die Perlen auf dem Eis während des Einrichtens Trichothecene Reaktion. Achtung: Führen Sie alle Verfahren unter RNase-freie Bedingungen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trichothecene Reaktion
	<ol>
<li>Bereiten Sie ein Trichothecene Reaktionsgemisch in einen neuen Schlauch, wie in Tabelle 2beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie 6 µL [α -32P] UTP (3.000 Ci/Mmol), die Mischung und die Mischung gut durch pipettieren. Hinweis: ATP [α -32P], [α -32P] CTP oder [α -32P] GTP eignet sich für die Reaktion statt [α -32P] UTP.</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL RNA-Vorlage (1 µg/µL) in die Mischung und die Mischung gut durch pipettieren. Hinweis: Um die Trichothecene-Assay etablieren, die folgende RNA-Vorlage wird empfohlen: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Die Perlen mit 20 µL des Reaktionsgemisches Trichothecene aus Schritt 3.4.3 durch pipettieren aufzuwirbeln.</li>
		<li>Schütteln Sie die Probe vorsichtig (20 bis 25 u/min) auf einer Drehscheibe von einem Boston-Shaker set in einem Inkubator peltier-Typ für 2 h bei 32 ° C.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch 5.4 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 45,4 µL 2 X Proteinase K Puffer hinzufügen. Durch pipettieren mischen Sie und schütteln Sie (20 bis 25 u/min) der Probenmaterials auf einer Drehscheibe inmitten einer Peltier-Art Brutkasten für 30 min bei 37 ° C.</li>
		<li>Die Probe 109,2 µL RNase-freies Wasser hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL des sauren Phenol-Chloroform zur Probe. Mischen Sie gut durch Wirbel und Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.100 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragung der wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL 3 M Natriumacetat (pH = 5,2), 4 µL Niederschlag Träger und 250 µL Ethanol in der wässrigen Phase. Schütteln Sie den Schlauch gut zum Mischen, dann die Probe bei 21.100 X g für 20 min bei 4 ° c zentrifugiert Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets mit 300 µL von kaltem 70 % (Vol/Vol) Ethanol bei-20 ° c gelagert Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.100 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und trocknen Sie das Pellet. Achtung: Führen Sie alle Verfahren unter RNase-freie Bedingungen. Hinweis: Das Pellet aus Schritt 3.4.11 kann bei-20 ° C für mindestens 2 Tage gespeichert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase-Behandlung
	<ol>
<li>Das Pellet aus Schritt 3.4.11 in 20 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine RNase Reaktionsgemisch in einen neuen Schlauch, wie in Tabelle 3beschrieben.</li>
		<li>Das Beispiel 180 µL RNase Reaktionsmischung hinzu, und inkubieren das Rohr für 2 h bei 37 ° c</li>
		<li>2.3 µL 10 % (Vol/Vol) SDS zur Probe hinzufügen und 15 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Die Probe 2 µL Proteinase K (20 mg/mL) hinzu und 15 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Die Stichprobe 205 µL Säure Phenol-Chloroform hinzufügen. Mischung gut durch Wirbel, anschließend Zentrifugieren die Probe bei 21.100 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragung der wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL 3 M Natriumacetat (pH 5,2), 4 µL Niederschlag Träger und 250 µL Ethanol in der wässrigen Phase. Schütteln Sie den Schlauch gut zum Mischen, dann die Probe bei 21.100 X g für 20 min bei 4 ° c zentrifugiert Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets mit 300 µL von kaltem 70 % (Vol/Vol) Ethanol bei-20 ° c gelagert Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.100 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und trocknen Sie das Pellet. Hinweis: Das Pellet aus Schritt 3.5.9 kann bei-20 ° C für mindestens 2 Tage gespeichert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Gelelektrophorese und Autoradiographie
	<ol>
<li>Die Probe mit 20 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL 2 x Ladepuffer.</li>
		<li>Kochen der Probe für 10 min bei 95 ° C. Zerdrücken Sie die Probe auf dem Eis.</li>
		<li>Führen Sie das Gel. Für den Fall, dass die Vorlage Größe 34 Nts ist (siehe auch Punkt 3.4.3), ist 7 M Harnstoff - 10 % Polyacrylamid-Gel für die Denaturierung Gelelektrophorese verwendet.</li>
		<li>Trocknen Sie das Gel mit einem Gel Trockner.</li>
		<li>Aussetzen des Films getrocknet-Gel innerhalb einer Röntgen-Kassette mit einem verschärfende Bildschirm bei-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die IP-Trichothecene-Assay ist eine empfindliche Methode, Trichothecene Aktivität des menschlichen TERT zu erkennen. TERT Protein drückt sich hoch in mitotischen HeLa-Zellen, in denen TERT die Trichothecene komplexe8,9,10bildet. Dies deutet darauf hin, dass mitotische HeLa-Zellen ein optimales Material, Trichothecene Aktivität zu erkennen sind. In dem oben beschriebenen Protokoll sind mitotische und nicht synchronisierten HeLa-Zellen bzw. als ein positives und ein negatives Beispiel enthalten. Wie in Abbildung 1Adargestellt, Trichothecene-Assay-Produkte aus der empfohlenen RNA-Vorlage in mitotischen HeLa-Zellen zeigen Breite radioaktiven Signale zwischen 20 und 30 nt. Neben HeLa-Zellen, wir haben Tests mit verschiedenen Arten von Zelllinien durchgeführt und festgestellt, dass die signalmuster in andere Zelle Arten9geändert werden kann: einige zeigen eines starken Signals nur rund 30 nt, einige zeigen eines ähnlichen Musters mit HeLa-Zellen. Wir haben auch den Assay mit RNA-Vorlagen als die 34 nt Vorlage8, kurz durchgeführt und lange (~ 300 nt) RNAs mit verschiedenen Sequenzen und erfolgreich Trichothecene Produkte aus diesen Vorlagen erhalten, obwohl einige Präferenz sein kann. Für den ersten Test empfehlen wir jedoch mit HeLa-Zellen in der mitotischen Phase und die 34 nt RNA-Vorlage. RdRPs können sowohl in eine Grundierung-abhängige eine Grundierung-unabhängige Weise11doppelsträngige RNA generieren. Wir haben berichtet, dass TERT diese Eigenschaft als menschliche Trichothecene7,9 bewahrt; TERT synthetisiert DsRNA aus einer RNA-Vorlage mit 3' Foldback-Struktur durch eine Rücken-Priming-Mechanismus-7. Für die 34 nt RNA-Vorlage synthetisiert TERT komplementäre Stränge ohne Verwendung von Primern9. Speziell Trichothecene Produkte synthetisiert in einer Grundierung-unabhängige Weise, d. h. de Novo synthetisiert RNA Produkte, [α -32P] erkennen NTP ausgetauscht werden mit [γ -32P] NTP Trichothecene Reaktion9.
MNase Behandlung von Immunkomplexen TERT auf Perlen ist ein entscheidender Schritt, um gewünschte Ergebnisse zu erzielen. Erfolgt die MNase Behandlung zu lange oder mit intensivem schütteln, würde die Trichothecene Produkte bemerkenswert reduziert werden. Um solchen Ärger zu vermeiden, empfehlen wir dringend, sich streng an das Protokoll sorgfältig. HMD-Lösung ist ein weiterer entscheidender Faktor für den Erfolg. Wenn Sie feststellen, dass die Signale sehr schwach sind, ersetzen Sie die HMD-Lösung zu einem neu vorbereitet.
Im gesamten Protokoll sollte man großen Sorgfalt zur Vermeidung von Kontaminationen RNase nehmen. Ribonuklease Behandlung sollte mit speziellen Geräten durchgeführt werden. Nach Manipulation der Ribonuklease, man sollte die Spitzen auswerfen und Rohre mit RNase sofort beseitigen RNase mit spezialisierten Lösung (z.B. RNase ruhig), und ändern Sie Haine.
TERT interagiert mit nicht nur TERC , sondern auch viele Arten von endogenen RNAs, und wir haben7Teil davon berichtet. Änderung in der IP-Trichothecene-Assay, wie z. B. die IP-Trichothecene Assay ohne MNase Behandlung, wird eine vollständige Liste der endogene RNA-Vorlagen für TERT-assoziierten Trichothecene Aktivität und bioinformatische Guide auf ihre Sequenz-Funktionen bieten. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich an Gewebe lysate angewendet. Da TERT in einer Vielzahl von normalen und Tumor Geweben ausgedrückt wird, kann dieser Test sinnvoll, nicht-kanonische enzymatischen Funktion der TERT in Menschen zu untersuchen sein.

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) ist bekannt als die katalytische Untereinheit der Telomerase und es verlängert Telomer Telomerase RNA Komponente (TERC), die spezifische RNA-Vorlage1. Obwohl TERT telomeric DNA als Bestandteil der Telomerase polymerisiert, zufolge der Struktur- und phylogenetischen Analysen TERT ist eng mit der viralen RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRPs) sowie viralen reversen Transkriptase und teilt Domains mit Diese Polymerasen2,3,4. Trichothecene ist das Enzym, das komplementäre RNA-Strang zu einer Vorlage RNA erzeugt. Das Enzym ist nicht nur Viren, sondern auch in Modellorganismen wie Pflanze, Hefe und Wurm, codiert und doppelsträngige RNA-Synthese durch Trichothecene trägt zur transkriptionellen und posttranskriptionelle gen-silencing in diese Organismen5,6 . Obwohl menschliche Trichothecene lange gefehlt hatte, fanden wir Trichothecene Aktivität in menschlichen TERT in 20097.
Wir zuerst bestätigt Trichothecene Tätigkeit der TERT mit rekombinanten Proteins7, dann etabliert einen sensible in Vitro Assay um Trichothecene Aktivität von endogenen TERT8erkennen. Hier zeigen wir die in-vitro- Trichothecene Assay (IP-Trichothecene Assay) für endogene TERT. Diese Methode beginnt mit Immunopräzipitation (IP) des endogenen TERT und ist gefolgt von in-vitro- Trichothecene Reaktion, in denen radioaktive Purine entstehende RNA-Stücke integriert sind.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mischlösung</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylendiamentetraessigsäure (EDTA) Lösung</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Acetat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2&bull; 6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen(10)-octylphenylether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-frei</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2&bull; 2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokken-Nuklease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, je 100 mM</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-32P]UTP (3.000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Verwendung von frischem RI für den Assay</td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Säure-Phenol:Chloroform, pH 4,5 ( mit IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuklease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamid, deionisiert</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>z.B. ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>z.B. TOMY</td><td>EX-135</td><td>Für Stufe B)</td></tr><tr><td>Mikrokühlzentrifuge</td><td>, z.B. KUBOTA</td><td>3740</td><td>Für Stufe 6.2</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Setzen Sie eine Mikrospitze (#4422) auf den Ultraschallschrank, für Stufe 6.4</td></tr><tr><td>Mikrokühlzentrifuge</td><td>, z.B. TOMY</td><td>MX-305</td><td>Für Stufe 6.5</td></tr><tr><td>Kühlbrutator</td><td>, z.B. Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Setzen Sie einen Rotationsschüttler hinein</td></tr><tr><td>Rotationsschüttler</td><td>z.B. TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlter Brutkasten&nbsp;</td><td>z.B. TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a Shaker " MINI-WELLE" innen, für Stufe 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>ALS ONE</td><td>WEV-03</td><td>Ein Shaker für die Stufen 7.7, 8.5 und 8.6</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>z.B. TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a Shaker " MINI-WELLE" innen, für Stufe 8.5 und 8.6</td></tr><tr><td>Blockinkubator</td><td>z.B. ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitativen nachweis von rna-abhängige rna-polymerase-aktivität des menschlichen telomerase reverse transkriptase protein

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) ist die katalytische Untereinheit der Telomerase und es verlängert Telomere durch RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität. Obwohl eine Reverse Transkriptase TERT genannt wird, nachweislich Struktur- und phylogenetische Analysen der TERT TERT ist Mitglied der Rechtshänder Polymerasen und bezieht sich auf die virale RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRPs) sowie viralen reversen Transkriptase. Wir identifiziert zunächst Trichothecene Aktivität des menschlichen TERT, die komplementäre RNA erzeugt stehen, um eine Vorlage, die nicht-kodierende RNA und trägt zur RNA silencing in Krebszellen. Um dieses nicht-kanonischen enzymatische Aktivität zu analysieren, wir Trichothecene Assay mit rekombinanten TERT im Jahr 2009 entwickelt, danach in Vitro Trichothecene Assay für endogene TERT gegründet. In diesem Manuskript beschreiben wir die letztere Methode. Kurz, TERT Immunkomplexe aus Zellen zu isolieren, und inkubiert mit RNA-Vorlage und rNTPs einschließlich radioaktive rNTP für Trichothecene Reaktion. Einsträngige RNA zu beseitigen, sind Reaktionsprodukte mit RNase behandelt, die ich, und die Endprodukte mit Polyacrylamid Gelelektrophorese analysiert werden. Radioaktiven Trichothecene Produkte können nach Übernachtung Exposition durch Autoradiographie nachgewiesen werden.

Mit der empfohlenen RNA-Vorlage werden radioaktive Trichothecene Produkte zwischen 20 bis 30 Nukleotiden (nt) speziell in HeLa-Zellen in mitotischen Phase nach der Übernachtung Exposition (Abbildung 1A) beobachtet. In der Regel Signalintensität der Trichothecene Produkte zeigt zwei Peaks, die rund 25 positioniert sind nt und 30 nt im Einklang mit der Größenverteilung der Produkte vom nächsten Generation Sequenzierung9bestätigt. Im Gegensatz zur mitotischen Zellen zeigen HeLa-Zellen ohne Synchronisation fast keine der 20 – 30 nt radioaktive Produkte. Ovale Signale, die unter 20 liegen nt in allen Proben sind unspezifische driftet.
Für den Fall, dass nur ~ 30 nt Produkt mit schwachem Signal in mitotischen HeLa-Zellen gibt, bedeutet dies, dass die Trichothecene Reaktion nicht gut gehen. Beispielsweise wenn MNase Behandlung grob und unsachgemäß durchgeführt wird, die Signalintensität in mitotischen HeLa Zellen sinkt deutlich (Abbildung 1 b). Trichothecene Reaktion durchgeführt mit alten HMD-Lösung reduziert auch die Produkte (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Abbildung 1 : Vertreter RdRP Produkte von endogenen TERT in mitotischen HeLa-Zellen. (A) drei repräsentative Ergebnisse des IP-Trichothecene Assays in HeLa-Zellen mit Nocodazole (manipuliert) oder DMSO (unmanipuliertes) behandelt. Die chemisch synthetisierten 34 nt RNA diente als Vorlage. (B) IP-Trichothecene Assay in mitotischen HeLa-Zellen mit ungeeigneten MNase Behandlung durchgeführt. (C) IP-Trichothecene Assay in mitotischen HeLa-Zellen mit frisch oder alt HMD-Lösung durchgeführt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U/µL</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease Puffer, 10-fach</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-freies Wasser</td>
			<td>51 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: MNase Reaktion Mischung Komponente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHAPS, 0,07 % (wt/Vol.)</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD-Lösung</td>
			<td>2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-Inhibitor, 40 U/µL</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-freies Wasser</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Trichothecene Reaktion Mischung Komponente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase eine Ribonuklease, 10 U/µL</td>
			<td>0,2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktion-Puffer, 10-fach</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-freies Wasser</td>
			<td>159.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Ribonuklease Reaktion Mischung Komponente.

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) synthetisiert nicht nur telomeric DNA, sondern auch doppelsträngige RNA durch RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität. Hier beschreiben wir einen neu gegründeten Assay um RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität der endogenen TERT zu erkennen.

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der RNA-Biologie zu beantworten, wie z.B. welche biologische Bedeutung RdRP oder TERT in menschlichen Zellen hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sich dieser Assay als erste empfindliche Methode zum Nachweis der in Zellen exprimierten humanen RdRP-Aktivität etabliert hat. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Aufbereitung der HeLa-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS. Zentrifugieren Sie dann die Probe fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei der 1.450-fachen Schwerkraft und verwerfen Sie den Überstand. Verwenden Sie einen Milliliter eiskalten Lysis Buffer A pro 10 Millionen Zellen, um die Zellen durch schonendes Pipettieren zu lysieren.Beschallen Sie die Probe in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei einer Ultraschallverstärkerverstärkung von 25 % für 10 Sekunden. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 20, 400-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie jeweils einen Milliliter des Überstands in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Reinigen Sie das Lysat vor, indem Sie 40 Mikroliter vorgewaschene Protein-A-Agarose-Kügelchen pro einem Milliliter des Lysats hinzufügen. Gut mischen, indem Sie die Tube mehrmals umdrehen. Drehen Sie dann die Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.Die Probe wird eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 13.000-facher Schwerkraft zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter vorgewaschene Protein-A-Agarose-Kügelchen und 10 Mikrogramm Anti-Human-TERT-Antikörper in das vorgeklärte Lysat hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen und die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius drehen.Nach der Zentrifugation bei 3.300-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius wird der Überstand entfernt. Waschen Sie anschließend die Kügelchen mit Wash Buffer One. Geben Sie einen Milliliter Wash Buffer One zu den Perlen und mischen Sie es gut, indem Sie die Tube umdrehen.Drehen Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.300-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male.Nach der AGC-Lösungswäsche, wie im Textprotokoll beschrieben, behandeln Sie die Kügelchen mit Mikrokokken-Nuklease, indem Sie sie in 60 Mikrolitern des Mikrokokken-Nuklease-Reaktionsgemisches durch sanftes Pipettieren resuspendieren. Schütteln Sie dann die Probe vorsichtig auf einem Drehteller eines Schüttlers, der in einem Peltier-Inkubator aufgestellt ist, 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren der Probe bei 3.300-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius wird der Überstand entfernt.Zum Schluss waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einer AGC-Lösung, die drei millimolare EGTA enthält, und waschen Sie die Kügelchen einmal mit Waschpuffer Zwei, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie das RdRP-Reaktionsgemisch in einem neuen Röhrchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie sechs Mikroliter Uridintriphosphat, das auf der Alpha-Phosphatgruppe mit P-Strich 32 markiert ist, in das Reaktionsgemisch und mischen Sie es durch Pipettieren gut.Fügen Sie dann der Mischung einen Mikroliter Template-RNA hinzu und mischen Sie gut. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 20 Mikrolitern des resultierenden RdRP-Reaktionsgemisches. Anschließend schütteln Sie die Probe vorsichtig auf einem Drehteller eines Schüttlers, der in einem Peltier-Inkubator aufgestellt ist, zwei Stunden lang bei 32 Grad Celsius.Nach der Inkubation geben Sie 5,4 Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K und 45,4 Mikroliter 2X Proteinase K Puffer in das Reaktionsgemische. Mischen Sie durch Pipettieren und schütteln Sie die Probe in einem Peltier-Inkubator 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach Zugabe von 109,2 Mikrolitern RNase-freiem Wasser zur Probe werden 200 Mikroliter saures Phenol-Chloroform zugegeben.Durch Vortex gut mischen, bevor die Probe fünf Minuten lang bei 21, 100-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur zentrifugiert wird. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.Geben Sie dann 20 Mikroliter drei molare Natriumacetate, pH 5,2, vier Mikroliter Fällungsträger und 250 Mikroliter Ethanol in die wässrige Phase. Schütteln Sie die Tube zum Mischen gut. Zentrifugieren Sie die Probe bei 21, 100-facher Schwerkraft für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie das Pellet anschließend mit 300 Mikrolitern kaltem Ethanol mit 70 Vol.-% pro Volumen, das bei minus 20 Grad Celsius gelagert wird. Zentrifugieren Sie die Probe bei 21, 100-facher Schwerkraft für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft.Suspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Bereiten Sie das RNase-Reaktionsgemisch in einem neuen Röhrchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 180 Mikroliter des RNase-Reaktionsgemisches in die Probe.Inkubieren Sie das Röhrchen dann zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 2,3 Mikroliter SDS mit 10 Vol.-% pro Volumen in die Probe und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann zwei Mikroliter Proteinase K mit 20 Milligramm pro Milliliter in die Probe und inkubieren Sie weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.Geben Sie nun 205 Mikroliter saures Phenol-Chloroform in die Probe. Nach dem Mischen und Zentrifugieren wie zuvor wird die wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführt. Geben Sie drei molare Natriumacetate, Fällungsträger und Ethanol in die wässrige Phase, gefolgt von Mischen, Zentrifugieren und Waschen des Pellets, wie zuvor durchgeführt.Hier sind drei repräsentative Ergebnisse des IP-RdRP-Assays in HeLa-Zellen dargestellt, die mit Nocodazol oder DMSO für unmanipulierte Zellen behandelt wurden. Als Template wurde eine chemisch synthetisierte 34-Nukleotid-RNA verwendet. Nach nächtlicher Exposition können RdRP-Produkte zwischen 20 und 30 Nukleotide gesehen werden, spezifisch in HeLa-Zellen innerhalb der mitotischen Phase.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die RdRP-Aktivität von menschlichem TERT erkennen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

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Erfahren Sie einen semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängiger RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen TERT-Proteins in HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion von RdRP-Aktivität während der Mitose.

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein (Video) | JoVE Journal

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

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