Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das Tumorwachstum und die Metastasierung bei lebenden Nagetieren durch Bildgebung zu verfolgen. Ein Radionuklidfluoreszenz-Fusionsreporter ermöglicht den nicht-invasiven In-vivo-Nachweis mittels Positronen-Emissions-Tomographie mit dem Fluorophor, der die Ex-vivo-Bestätigung der Ergebnisse unterstützt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wenn Zellen in lebenden Tieren über einen längeren Zeitraum verfolgt werden müssen.

Es kann zum Verständnis der Fernmetastasierung und des Einflusses von Behandlungen auf die Tumorprogression beitragen. Bei der beschriebenen Technik handelt es sich um die Verfolgung von Krebszellen durch hochempfindliche und nicht-invasive in vivo Bildgebung mit einem PET-Tracer, der durch automatisierte Synthese hergestellt wird. Sie bietet eine deutliche Reduzierung des Tiereinsatzes im Vergleich zur herkömmlichen Methodik.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können sich von ihrer Komplexität überwältigt fühlen. Insbesondere die automatisierte Synthese des PET-Radiotracers vereinfacht diesen Prozess erheblich. Wir glauben, dass die visuelle Demonstration dieser Methode diese Ansichten über die kritischen Bildgebungsschritte zeigt, die mit der Bildgebung verbunden sind.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die präklinische Erprobung neuer Therapeutika, die auch entlang der Krebszellen verfolgt werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Krebsbiologie und die Entwicklung von Therapien geben. Immer dann, wenn in vivo die Lokalisierung, Umsiedlung, Expansion und Langzeitüberwachung einer bestimmten Population von Interesse ist.

Verwenden Sie zunächst Reportergen-Plasmide, erzeugen Sie Lentivirus-Partikel, transduzieren Sie Zellen und charakterisieren Sie sie. Analysieren Sie dann die Funktion des Reportergens durch Radiotraceraufnahme in den NISFP-exprimierenden Zelllinien. Die gereinigten Zellen und das Wachstumsmedium in sechs Well-Platten aussäen, um sicherzustellen, dass alle Proben in dreifacher Ausfertigung vorbereitet werden.

Am nächsten Morgen waschen Sie die Zellen mit freiem Serumwachstumsmedium und inkubieren die Platten mit 50 Kilo Becquerel F18-Tetrafluorborat bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Sammeln Sie dann den Überstand und geben Sie 100 Mikroliter in ein vorbeschriftetes Auffangröhrchen. Entsorgen Sie den restlichen Überstand und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter eiskaltem PVS, das Kalzium und Magnesium in physiologischer Konzentration enthält.

Sammeln Sie die Waschlösung und geben Sie 100 Mikroliter der Waschlösung in ein vorbeschriftetes Auffangröhrchen. Wiederholen Sie dann den Waschvorgang noch einmal. Fügen Sie 500 Mikroliter PVS hinzu, das sowohl Trypsin als auch EDTA enthält, um die Zellen anzuheben.

Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen ablösen, und überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Ablösung. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein beschriftetes Sammelröhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellproben bei 250 g für vier Minuten bei vier Grad Celsius.

Verwenden Sie einen automatisierten Gamma-Zähler, um die Proben aus jedem der vier Probentypen zu zählen und die prozentuale Aufnahme anhand von Gleichung eins zu ermitteln. Um mit der F18-Tetrafluorboratsynthese zu beginnen, richten Sie die automatisierte Radiosyntheseplattform in einer geeigneten chemischen Haube ein und stellen Sie sicher, dass die richtige XML-Datei auf den Steuercomputer geladen wird. Während der Synthesizer läuft, wird F18-Tetrafuoroborat hergestellt und anschließend auf einer anionischen Austauschpatrone gereinigt.

Die Anionenaustauscherpatrone wird mit Wasser gespült und anschließend mit Stickstoffgas getrocknet. Das Endprodukt wird aus der Anionenaustauscherkartusche mit einem Milliliter 0,9 % Natriumchlorid angedeutet und über die Auslassleitung in ein Glasauffangfläschchen überführt. Um mit der Bildgebung zu beginnen, betäuben und bereiten Sie die Mäuse gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.

Verwenden Sie dann sterile 0,9%ige Kochsalzlösung, um die F18-Tetrafluorboratlösung auf 5 Megabecquerel pro 50 Mikroliter zu verdünnen. Verwenden Sie eine Spritze mit einer Injektionsnadel, um 100 Mikroliter der F18-Tetrafluorboratlösung zu ziehen. Messen Sie die Radioaktivität in der Spritze und notieren Sie den Wert und den Zeitpunkt der Messung.

Verabreichen Sie 50 Mikroliter der F18-Tetrafluorboratlösung intravenös in den vorgewärmten Schwanz. Messen Sie dann die verbleibende Radioaktivität in der Spritze und notieren Sie den Wert und den Zeitpunkt der Messung. Die Injektion des Radiotracers in die Schwanzvene ist von entscheidender Bedeutung.

Wir führen es unter Tieranästhesie durch, um das Risiko einer Fehlinjektion und des Verschüttens von Radiotracern zu minimieren. Das Tier bleibt bis zum Beginn der PET-Bildaufnahme unter Narkose. Genau 45 Minuten nach der Radiotracer-Injektion.

Stellen Sie als Nächstes einen Timer ein, der von 45 Minuten herunterzählt, und stellen Sie sicher, dass die Maus in sternaler Position auf dem Tisch positioniert ist. Installieren Sie die geeigneten chirurgischen Überwachungsinstrumente und stellen Sie sicher, dass die Instrumente ordnungsgemäß funktionieren, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie dann die Perameter für die CT-Bildgebung und die PET-Bildaufnahme ein.

Wenn der Countdown-Timer 15 Minuten anzeigt, beginnt die CT-Bildaufnahme, und wenn der Timer null Minuten anzeigt, beginnt die PET-Bildaufnahme. Messen Sie zunächst die Radioaktivität der gesamten euthanasierten Maus und notieren Sie den Wert und den Zeitpunkt der Messung. Dann sezieren Sie die Mäuse und ernten Sie das notwendige Gewebe.

Die Radioaktivität des verbleibenden Schlachtkörpers mit und ohne Schwanz wird gemessen. Notieren Sie diese Werte und notieren Sie die Messzeiten. Wiegen Sie anschließend alle entnommenen Gewebe einzeln und fotografieren Sie die Krebsorgane unter Tageslicht und Fluoreszenzlicht.

Betten Sie dann das Gewebe für die nachgelagerte Histologie in die OCT ein. Messen Sie die Radioaktivität aller entnommenen Gewebe, notieren Sie den Wert und notieren Sie den Zeitpunkt der Messung. Stellen Sie abschließend die Daten als Standard-Aufnahmewerte oder SUV dar, wie in Gleichung zwei beschrieben.

In diesem Experiment wurde die Genbildgebung mit Radionuklid-Floreszenzrekordern verwendet, um das Fortschreiten des Tumors in einem Nagetiertumormodell zu verfolgen. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine genaue Plasmamembranlokalisierung von NISFPs. Die Funktion und Spezifität des NISFP wurde unter Verwendung der NIS-Aufnahme durch Radiotracer quantifiziert.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen 4T1NISGFP und 4T1NISRFP exprimierenden Zelllinien mit ähnlichen NIS-Expressionsniveaus festgestellt. Wichtig ist, dass der Prächloratblock in allen Zelllinien zeigte, dass die erhaltene Radiotraceraufnahme auf die spezifische NISFP-Expression zurückzuführen ist. Ganzkörper-PET-Bildgebungen von tumortragenden Tieren lieferten Informationen über die Tumorprogression und die Metastasierung.

Das hier gezeigte Beispiel zeigt ausgedehnte lange Metastasen mit mehreren deutlichen Knötchen in der Lunge. Die prozentual injizierten Dosiswerte und das belegte Volumen der einzelnen Metastasen in der Lunge variierten. Die volumennormalisierten prozentualen Dosiswerte lagen jedoch in einem ähnlichen Bereich.

Das fluoreszierende Protein im Dual-Mode-Reportergen ermöglichte die Identifizierung von Krebsgewebe unter Blütenlicht während der Sektion von Tieren. Die anschließende ex vivo Radiotracer-Biodistribution zeigte Organe mit hoher Radiotraceraufnahme und damit NIS-exprimierendem Gewebe. Während die Schilddrüse und die Speicheldrüsen sowie der Magen in ihrer Heimat NIS exprimieren, deuten alle anderen positiven Signale auf Krebsgewebe wie Tumor und Metastasen hin.

Der Radionuklid-Fluoreszenzreporter ermöglicht auch die Identifizierung von Krebszellen in nachgeschalteten Gewebeschnitten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, den Prozess der spontanen Metastasierung sichtbar zu machen und zu testen, wie Medikamente ihn beeinflussen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, alle Schritte sorgfältig im Voraus zu planen.

Zelllinien müssen etabliert, tierische Tumormodelle eingerichtet und alle Reagenzien und Geräte für die Bildgebung müssen am gewünschten Tag verfügbar sein. Wir empfehlen zunächst kleine Pilotversuche. Einmal gemeistert, können die Radiotracer-Produktion und die In-vivo-Bildgebung von Tieren mit sechs Tieren an einem achtstündigen Arbeitstag durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sich einem Reportergen nähern, das eine In-vivo-Zellverfolgung mit dem Radionuklid-Reporter NIS in Kombination mit einem fluoreszierenden Protein ermöglicht. Sie sollten auch in der Lage sein, NISFP-Reporter-exprimierende Zelllinien zu charakterisieren, um den erforderlichen PET-Radiotracer für die In-vivo-Bildgebung herzustellen und in vivo und ex vivo durch Verteilungsexperimente durchzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Fluorozytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Zum Beispiel, wie das Immunzellprofil eines Tumors und seine Metastasierung zueinander in Beziehung stehen oder sich im Laufe der Zeit verändern. Vergessen Sie nicht, sicherzustellen, dass die von Ihnen produzierten Zelllinien frei von Mikroplasmiden sind, da Berichten zufolge letztere die Ergebnisse beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioisotopen extrem gefährlich sein kann und der Schutz von sich selbst und anderen bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorrang haben muss.