Name: Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Tumorwachstum und Metastasen in Nagetieren mit Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Genen und PET-Bildgebung nicht-invasiv verfolgen. Diese Methode reduziert den Tierverbrauch erheblich.

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Die Forschung wurde unterstützt durch die Kings College London und UCL umfassende Cancer Imaging Center, finanziert von Cancer Research UK und EPSRC in Verbindung mit dem MRC und DoH (England); das National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre am Guy es and St. Thomas' NHS Foundation Trust und Kings College London; Das Centre of Excellence in Medical Engineering gefördert vom Wellcome Trust und EPSRC unter Grant Nummer WT 088641/Z/09/Z; ein Krebs UK multidisziplinäres Projekt Forschungspreis GOF PJB und des Königs Health Partners Zuschuss an GOF. Die NanoPET/CT und NanoSPECT/CT-Scanner waren gekauft und gepflegt durch eine Ausrüstung Zuschuss aus dem Wellcome Trust. Die geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und nicht unbedingt der NHS, die NIHR oder die DoH.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Der erste Schritt zum Rendern Krebs Zellen nachweisbar in Vivo durch diese Methode erfordert Technik sie auszudrücken, die NIS-FP-Fusion-Reporter. Die Wahl des fluoreszierenden Proteins in der Fusion-Reporter ist wichtig, da oligomerizing fluoreszierende Proteine zu künstlichen Reporter clustering, damit negative Auswirkungen auf seine Funktion führen kann. Wir hatten Erfolg mit bewährten Monomeren fluoreszierende Proteine wie mEGFP (mit der monomerizing Mutation A206K36,37), mTagRFP oder mCherry. NIS kann entweder der Mensch oder Maus Ursprungs (hNIS oder MsNIS) je nach Zweck des Experiments und der Krebs-Modell. Transduktion Wirkungsgrade variieren in der Regel zwischen verschiedenen Krebszelllinien. Allerdings sind generierte Krebszelllinien anschließend durch FACS in diesem Protokoll, wodurch die Notwendigkeit für die Optimierung der Transduktion Bedingungen gereinigt. Transduktion mit hoher Multiplizität der Infektion ist nicht immer ratsam, da mehrere Konstrukt-Integration in das Genom nicht nur in höheren Konstrukt Ausdruck, sondern auch in mehr unerwünschte/ungeregelt Genom Modifikation führen dürfte. Daher ist es wichtig, polyklonale ausgestrahlt Zellen wachsen, um die Stabilität des Ausdrucks (überwacht durch Durchflusszytometrie) und vermeiden die hellsten Klone nur durch FACS sortieren zu lassen. Es macht auch funktionelle Validierung-Reporter Funktionen entscheidend, bevor diese Zellen für in Vivo Experimente verwendet werden soll. Eine neu entwickelte Alternative zu viralen Gens Lieferung ist gen Bearbeitung Technologie38, die genauere Kontrolle über virale Integration Websites bietet. Expressionsanalyse von Durchflusszytometrie und Immunoblotting ist wichtig. Durchflusszytometrie ermöglicht die Erfassung von populationsbasierten Einzelzelle Daten, zum Beispiel zu prüfen, ob eine Drift in Reporter Ausdruck Niveaus im Laufe der Zeit. Es stützt sich auf die FP glyko-nur, wenn Zellen mit einem Antikörper gegen Oberflächen- oder total NIS auch gebeizt werden. Durchflusszytometrie informiert nicht über Fusion Reporter Integrität. Im Gegensatz dazu berichtet Immunoblotting über die Integrität der Fusion-Reporter. Das Molekulargewicht von NIS und die FP muss hinzugefügt werden, um die erwarteten Molekulargewicht von der gewählten NIS-RP konfokale Fluoreszenz Mikroskopie demonstriert Fusion Reporter NS1 mit der Plasmamembran Marker Weizenkeime Agglutinin in allen neu bestimmen Zell-Linien gemacht. Dies war der erwarteten zellulären Stelle für den Großteil des Proteins und einen grünes Licht Meilenstein für spätere funktionelle Validierung angegeben. Wenn minimal/Nein NIS-FP auf der Plasmamembran (z.B. nur in internen zellulären Kompartimenten) gefunden wurde dies würde bedeuten, dass eine Zelle biologische Problem mit dem Fusion-Reporter in diese Zelllinie oder eine mögliche Mutation von der Fusion-Reporter, die Auswirkungen auf seine intrazelluläre Menschenhandel. Es ist bemerkenswert, dass wir keine solchen in jedem der Krebszellen, die wir bisher getestet beobachtet haben, die enthalten: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (menschlichen Melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (menschlichen Brustkrebs); NCI-H1975 (menschliche Lungenkrebs); SK-Hep1 (menschliche Leberkrebs); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murine entzündlichen Brustkrebs); B16F0, B16F3, B16F10 (murine Melanom); MTLn3 (Ratte Brust Adenokarzinom).
NIS-Funktion muss mit Aufnahme-Assays mit radioaktiven NIS Substraten gemessen werden. Aufgrund der SPECT Radiotracer 99 mTcO4– als Generator produziert und daher weit verbreitet in Krankenhäusern ohne die Notwendigkeit für jede Radiotracer-Synthese sowie eine bequemere längere Halbwertszeit (6,01 h für 99 m TC im Vergleich zu 110 min 18F), wir dieses NIS Substrat für routinemäßige funktionelle Validierung der neuen NIS-FP mit dem Ausdruck ihrer Zelllinien verwendet. Die erwartete Reduzierung/Abschaffung der Radiotracer Aufnahme, so bekunden, Spezifität der Radiotracer Aufnahme führte vor Sperrung von NIS exprimierenden Zellen mit NIS Co Substrat Natrium Perchlorat. Dieser NIS-Spezifität-Test ist eine kritische Überprüfungsschritt. Wenn eine NIS-Spezifität-Experiment nicht vergleichbar mit den jeweiligen elterlichen Zellen reduzierten Radiotracer Aufnahme führen würde, einen technischen Fehler während des Experiments oder die Radiotracer-Aufnahme wurde nicht durch NIS. Es ist auch möglich, dass Natrium Perchlorat vor Sperrung Radiotracer Aufnahme in eine elterliche Zelllinie reduziert; Dies würde Zelllinien mit endogenen funktionaler NIS Ausdruck zu identifizieren (z.B. stimuliert Schilddrüse Zellen6).
Ein entscheidender Vorteil dieses bildgebenden Protokolls ist, dass Informationen in 3D und im Laufe der Zeit gesammelt werden. Dies ermöglicht den Vergleich der Bilder vom selben Tier über Zeit, wodurch gepaarte Daten und somit durch Inter Tier Variabilität verursachte Probleme zu überwinden. Dies kontrastiert mit nicht-abbildende Verwandte Metastasierung Bewertungsmethoden, die basieren auf verschiedene Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten zu opfern. In Abbildung 3 b ist es offensichtlich wie metastatische Ausbreitung und Auswuchs im Laufe der Zeit in ein einzelnes Tier fortgeschritten. Die Signale von PET/CT-Bildgebung erkannt werden grundsätzlich durch NIS Ausdruck verursacht. Dazu zählen alle Signale von EXOGEN NIS exprimierenden Krebszellen sowie alle Organe endogen NIS zum Ausdruck zu bringen. Typische endogene NIS-Signale werden in der Schilddrüse und Speicheldrüsen, Magen und auf einem niedrigen Niveau in einigen Teilen der Milch- und Contactlinse Drüsen gefunden. Neben endogenen NIS Ausdruck wird der NIS Radiotracer [18F] BF4– auch über die Nieren, dadurch erklären Radiotracer Aufnahme in Urin gefüllte Blase ausgeschieden. Niere-Aufnahme ist nicht mehr nachweisbar der bildgebenden Zeitpunkt in diesem Protokoll (45 min Post Radiotracer Injektion6) empfohlen. Wenn Signale von Urin gefüllte Blase zu Signal-Hintergrund-Problemen führen sollte, kann die Blase mechanisch unter Narkose vor Bildgebung entleert werden. Wichtig ist, können die körpereigene Signale zwischen tierischen Stämme variieren. Es ist auch bemerkenswert, dass endogene NIS Ausdruck in den Brustdrüsen unter stillende Bedingungen10höher sein kann. Im vorgestellten Fall und in den Fällen von diesen metastasierendem Zelllinien erfolgreich vor (vgl. Liste oben) gekennzeichnet fanden wir nicht endogene NIS Ausdruck zu Metastasen Erkennung erheblich stören. Es ist bemerkenswert, dass [18F] BF4– steht mehr für Aufnahme in Krebsgewebe gegenüber Jodid, da Jod in die Schilddrüsenhormone6verstoffwechselt wird. Dieses Phänomen kann auch größere Mengen an Radioiodide im Blut im Vergleich zu [18F] BF4- 6beitragen. Für verschiedene Anwendungen (Krebszelle Verfolgung in anderen Krebsarten oder nicht-Krebs Zelle tracking-Anwendungen) Dies kann abweichen, und es wird daher empfohlen, zu prüfen, ob endogene NIS Ausdruck zu Signal-Hintergrund-Themen durch führen dürfte Vorversuchen. Ein wichtiger Aspekt in der präklinischen Bildgebung ist die molare Aktivität die Radiotracer. Die hier beschriebene Methode verwendet ~1.5 GBq 18F– als Ausgangspunkt Material14 und hat gezeigt, dass die molare Aktivitäten deutlich über die bisher gemeldeten Substitution Methode12produzieren. [18F] BF-4– produziert bei Molaren Aktivitäten ≤1 GBq/µmol12 führen zu reduzierten Aufnahme in NIS exprimierenden Gewebe. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn die eingespritzte Menge an Radioaktivität pro Kilogramm hoch ist, d.h. wenn kleine Tiere wie Mäuse sind39abgebildet; Es ist weniger wichtig, in die menschliche Einstellung40. Aktivitäten mit hohem molare sind daher unerlässlich für die qualitativ hochwertige präklinische PET-Bildgebung. Molare Aktivitäten erzielten die Boron Trifluoride Zusatz Methode14, die in automatisierter Form in diesem Protokoll aufgeführt ist, überwinden dieses Problem. Darüber hinaus ist es bemerkenswert, dass die vorgestellte Protokoll für [18F] BF4– Synthese nicht konform mit der guten Herstellungspraxis (GMP) ist und daher ungeeignet für den Einsatz in klinischen Studien am Menschen in dieser Form. Ein GMP-Protokoll (über die Substitutionsmethode 18F, BF4–Radiomarkierung) gibt es an anderer Stelle40.
PET/CT-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der Radiotracer-Aufnahme, was bezeichnend für Radiotracer NIS-vermittelte Aufnahme von NIS-FP mit dem Ausdruck ihrer Krebszellen. Noch wichtiger ist, können die damit verbundenen PET-Signale quantifiziert werden. Es ist notwendig, zuverlässigen Schwellwerte Verfahren um eine konsistente und unvoreingenommene Differenzierung der relevanten Signale von jedem potenziellen Hintergrund zu gewährleisten. Da der Hintergrund in verschiedenen Orten in Vivovariiert, ist es wichtig, lokale/regionale Schwellwerte und Segmentierung zu berücksichtigen. Eine solche Methode wurde von entwickelt und benannt nach Otsu34, und die 3D Umsetzung wird für 3D-Rendering der Primärtumor und Metastasen in diesem Protokoll eingesetzt. Im Allgemeinen entspricht das Bild für den Betrachter visuell gesehen am besten den quantifizierten % injiziert Dosis (% ID) Werten. Für Image-basierte Quantifizierung ist es auch wichtig, die gemessenen Radioaktivität Werte der verschiedenen Gewebe, deren Volumen zu normalisieren. Es gibt zwei überwiegend verwendete Möglichkeiten Angabe der normalisierten Ergebnisse, (i) % ID pro Volumen (z.B. %ID/mL) und (Ii) standard Aufnahme Wert (SUV35). Sie unterscheiden sich in diesem %ID/mL die individuelle Lautstärke nur berücksichtigt während SUV ist eine Maßnahme, die im Vergleich zu den durchschnittlichen Radioaktivität über das ganze Tier. Es ist auch wichtig zu beachten, dass NIS Bildgebung das live Tumorvolumen (LTV) zugänglich, rendert weil Tote/sterben Zellen kann nicht synthetisieren ATP nicht mehr Radiotracer10importieren. Dies erklärt die große Low-Signal Fläche innerhalb der Primärtumor ("Donut-förmigen" Tumor) zeigt Bereiche der Tumor Zelle Tod/Nekrose. LTV war ein weitaus zuverlässiger Maßstab für Tumorlast im Vergleich zu der groben Tumorvolumen Bremssattel Messungen erreichbar (das Konto Lebensfähigkeit nicht berücksichtigt und bewertet nur oberflächlichen Tumor Regionen).
Ein großer Vorteil dieser Dual-Mode-Tracking-Strategie zeigt sich bei der Ernte von Geweben nach tierischen Keulung. Von in Vivo Bilder geleitet und unterstützt von fluoreszierenden Krebszellen während tierische Dissektion, kann kleine und tief sitzenden Organe/Metastasen auch zuverlässig geerntet werden. Gefrorenes Gewebe Erhaltung/schneiden Methodik ermöglicht die direkte Fluoreszenz-Bildgebung der GLP ohne Färbung mit einem Anti-GFP-Antikörper, aber auf Kosten der Erhaltung der reduzierten strukturelle Gewebe verglichen mit Formalin fixiert Paraffin-eingebetteten Methodik (FFPE). Letzteres erfordert kritisch auch Anti-FP Färbung, denn die Proteinkinase-Methode ist unvereinbar mit intakten Erhaltung von fluoreszierenden Proteinen (wegen Fixierung/Entwässerung/Rehydratation). Während das Fluoreszenzsignal bezeichnend für Tumor Zelle präsent ist, ist es wichtig, sicherzustellen, dass diese Klassifizierung von ex-Vivo Messungen der Radioaktivität der geernteten Gewebe ("Bioverteilung") bestätigt wird. Ex-Vivo Messungen der Radioaktivität sind empfindlicher als die visuelle Erkennung von Fluoreszenz, daher können die Identifikation von Krebs Zelle-abhängige Signale, die sonst unentdeckt blieben. Im Falle einer Terminal Sitzung imaging ist entscheidend für die injizierten Radiotracer Beträge sowie die Zeiten der Radiotracer Radioaktivität Messungen, tierische Injektion, Tier Keulung genau beachten und Szintillationszähler Messungen kalibriert geernteten Gewebe. Dies ist entscheidend für die Korrektur für Radiotracer Zerfall zu gewährleisten und damit eine zuverlässige Bioverteilung Analyse ermöglichen.
PET/CT-Bildgebung ermöglicht wiederholt nicht-invasive 3D Quantifizierung der Tumorprogression einschließlich der Bewertung der Metastasierung auf Ganzkörper-Ebene. Diese Funktion ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden, die verlassen sich oft auf großen Kohorten von Tieren, die für die Beurteilung der Tumorprogression zu unterschiedlichen Zeitpunkten eingeschläfert werden. Die Vorteile dieser Bildgebung basierenden Ansatzes sind: (i) hochsensiblen nichtinvasive 3D in Vivo Quantifizierung, (Ii) einen erheblichen Rückgang der Tierzahlen durch die Möglichkeit der Wiederholung, imaging, (Iii) die Akquisition gepaarte Längsschnittdaten aus nachfolgenden imaging-Sitzungen, die Verbesserung der Statistik durch den Ausschluss Inter Tier Variabilität, die wiederum weitere Tierzahlen reduziert, (iv) automatisierte Produktion [18F] BF4– bei hohen spezifischen Aktivitäten und (V) die intrinsische Option für ex-Vivo Bestätigung in Geweben durch Fluoreszenz Methoden wie Mikroskopie oder Zytometrie.
In Vivo Cell tracking ist ein wachsendes Feld. Es wurde angetrieben durch die jüngsten Fortschritte in der imaging-Technologie, die Erhöhung der Auflösung, Nachweisgrenzen und Multiplex-Fähigkeit (über multimodale Bildgebung) geführt. In diesem Protokoll wenden wir dieses Konzept um Tumorprogression auch spontane Krebsmetastasen Zelle in 3D durch wiederholte Bildgebung zu verfolgen. Anwendungen umfassen Studien zur Entschlüsselung der Mechanismen der spontanen Krebsmetastasen Zelle. Beispielsweise könnte nachvollziehbar Tumorzellen verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Immunzellen Komponenten (als Geschenk/funktional in tierischen Stämme von verschiedenen Ebenen der Immunocompromisation) auf der metastatischen Prozess zu studieren. Ebenso konnte die Auswirkungen einzelner Gene, entweder in der tierischen Belastung oder die Krebs-Zell-Linie untersucht werden. Darüber hinaus könnte die vorgestellte Protokoll prüfen/validieren die Wirksamkeit von bestimmten Medikamenten oder Therapiekonzepte auf Tumorprogression verwendet werden. Wichtig ist, diese Reporter-gen: Radiotracer-paar für PET-Bildgebung (NIS: [18F] BF4–) könnte auch für andere Zelle tracking-Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel entstehen mehrere Zelltherapien derzeit so viel versprechende Therapieansätze. Dies beinhaltet zelluläre Therapie für Krebs Behandlung41 , sondern auch in Transplantation42 und regenerative Medizin-43,-44 -Einstellungen. Ganzkörper- in Vivo Zelle tracking gewinnt zunehmend an Bedeutung für die Entwicklung und klinische Übersetzung der zellulären Therapie, zum Beispiel für die Bewertung der Sicherheit und zur Therapieüberwachung.

Metastasen ist die Ursache für die meisten krebsbedingte Todesfälle 1. Trotz umfangreicher Forschung in metastatische Prozesse ist die zuverlässige Überwachung von Krebsmetastasen im Tiermodell Systeme schwer zu erreichen. Jüngste Fortschritte in Ganzkörper-imaging-Technologien und multimodale Bildgebung Ansätze konnten nicht-invasive in Vivo Zelle tracking-2,3,4,5. Letzteres kann als ein Werkzeug, um die Präsenz, Verteilung, Menge und Lebensfähigkeit der Zellen, nicht-invasiv zu überwachen und immer wieder in ein lebendes Tier oder ein Mensch verwendet werden.
Die hier beschriebene Methode soll längs und nicht-invasiv Krebszellen in 3D in lebende Nagetier Tumormodellen verfolgen. Mit dieser Methode werden Forscher Tumorprogression einschließlich Metastasierung in 3D genau quantifizieren können. Im Vergleich zu herkömmlichen nicht-Imaging-basierte Techniken, bietet diese Methode die Akquisition von quantitativen Daten mit weitgehend reduzierte Tierzahlen. Ein weiteres Merkmal dieser Methode ist, dass es Korrelation von in-Vivo Bildgebung mit optimierten nachgelagerten ex Vivo Analyse der nachverfolgten Zellen in geernteten Geweben durch Histologie oder Zytometrie3,6.
Die Gründe für die Entwicklung dieser Methode war ein in-Vivo -Tool für die Überwachung und Quantifizierung des gesamten metastasierendem Prozesses in Nagetier Tumormodellen. Wichtiger ist, wurde es entwickelt, um Tierversuche bei gleichzeitiger Reduzierung der Inter Tier Variabilität zu minimieren. Längs der nichtinvasiven Ganzkörper-Bildgebung eignet sich hervorragend auf metastasiertem Auswuchs, zu informieren, für welche per se es schwierig ist, genau vorherzusagen, Zeit und Ort ihres Auftretens. Ganzkörper-3D-Bildgebung wurde daher in der Mitte der Methodenentwicklung. Um die Skala Lückenschluss zwischen Ganzkörper- in-Vivo Bildgebung und Potenzial nachgeschalteter Ex Vivo histologische Bestätigung, eine Multi-Scale imaging ein Dual-Mode-Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Ansatz war angenommen3, 6.
Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist die empfindlichste 3D Ganzkörper-imaging-Technologie derzeit bietet hervorragende Eindringtiefe und absolute Quantifizierung7 mit einer Auflösung von < 1 mm8,9. Derzeit kann präklinische Zelle tracking auf der Ganzkörper-Ebene durch Radionuklid Bildgebung zuverlässig detektieren Zellen bei dichten ~ 1.000 Zellen pro Volumen von 1 Million Zellen3,6 mit Auflösungen im Sub-Millimeter-Bereich. Im Gegensatz zu intravitalen Mikroskopie einzelne Krebszellen Verbreitung nicht erkannt, aber es erfordert keine chirurgische Eingriffen (z. B. Fenster Kammern), beschränkt sich nicht auf ein kleines Sichtfeld und nicht durch niedrige Gewebe eindringen und streuen. Biolumineszenz-Bildgebung ist bietet eine kostengünstige Alternative aber zugeordneten Scatter und Lichtabsorption sowie schlechte Eindringtiefe und folglich in Quantifizierung2stark eingeschränkt. Fluoreszenz Ganzkörper-Bildgebung ist für den Erwerb von 3D-Bildern verwendet worden, aber es ist viel unempfindlicher gegenüber Biolumineszenz oder Radionuklid Technologien2. Dennoch, Fluoreszenz bietet die Möglichkeit, ex Vivo nachgelagerten Gewebeanalysen Zytometrie oder Mikroskopie durchzuführen. Letzteres schließt die Skala-Lücke zwischen makroskopischen Ganzkörper-Bildgebung (mm Auflösung) und Fluoreszenz mikroskopisch kleine Gewebe Analyse (µm Auflösung)3. Daher ergänzen Radionuklid und Fluoreszenz Modalitäten, von der ganz-Körper-Ebene bis hin zu den (Sub-) zellulären Skala.
Reporter-Gen Bildgebung eignet sich hervorragend für längere Zelle je nach Bedarf in der Metastasierung Forschung verfolgen. In dieser Anwendung es ist besser als direkte Zelle Kennzeichnung von Label-Verdünnung (i) nicht betroffen und somit unbegrenzt Zeiterfassung und live Zellzahlen (Ii) besser widerspiegelt. Infolgedessen ist Ganzkörper-Handy tracking-besonders nützlich für Anwendungen, in denen nachvollziehbare Zellen vermehren oder in Vivozu erweitern, zum Beispiel bei Krebs Forschung3,6, für den Nachweis von Teratom Bildung im Stamm Zell-Forschung, oder für die Quantifizierung der immunen Zellen-Erweiterung5.
Verschiedenen Radionuklid-basierte Reporter Gene sind vorhanden2. Dazu gehören Enzyme wie Herpes-Simplex-Virus HSV11 Thymidin-Kinase (HSV1 -Tk), Transporter wie z. B. der Natrium-Iodid-Symporter (NIS) oder die Noradrenalin-Transporter (NET) sowie Oberfläche Zellrezeptoren wie Dopamin D2-Rezeptor) D2R). NIS ist ein glykosylierten Trans-Membran-Protein, das Iodid-Aufnahme, z. B. in follikulären Zellen in der Schilddrüse für die anschließende Synthese von Schilddrüsenhormonen10aktiv vermittelt. Dieser Prozess wird durch die Symport Na+ angetrieben und stützt sich auf die zellulären Natrium-Gradienten, von Na+gepflegt werden/+k-ATPase11. Infolgedessen NIS besser widerspiegelt lebenden Zelle Zahlen als andere Journalisten wie Jodid/Radiotracer Aufnahme mit einer aktiven Na+zusammenhängt/k+ Gradienten, anstatt die bloße Anwesenheit des Transporters. Traditionsgemäß Radioiodide ist verwendet worden für die NIS-Bildgebung. Für Handy-Tracking berichteten alternative NIS Radiotracer, die in der Schilddrüse nicht metabolisch eingeschlossen sind überlegene6sein. Das vor kurzem entwickelt PET Radiotracer [18F] Tetrafluoroborate ([18F] BF4–)12,13 zeigt überlegene Pharmakokinetik im Vergleich zu Radioiodide6 während bei bestimmten Aktivitäten mit hohem14 ohne die Notwendigkeit einer komplexen Radiochemie Einrichtungen zur Verfügung. [18F] BF4– kann über zwei verschiedene Wege synthetisiert werden. Die erste Methode basiert auf Isotop Austausch von nicht-radioaktiven 19F BF4– mit radioaktiven 18F12. Die zweite Methode ist durch Zugabe von 18F, nicht radioaktiv Boron Trifluoride14. Die letztere Methode wurde berichtet, dass höhere spezifische Aktivitäten14 ergeben und ist die Methode der Wahl für die vorklinische Bildgebung.
NIS wird hoch in die Schilddrüse Geweben ausgedrückt. Es drückt sich auch in die Speicheldrüsen, Contactlinse und stillende Milchdrüsen sowie den Magen, sondern auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu der Schilddrüse-10. Daher kann die hervorragenden Kontrast Bildgebung in anderen Körperregionen mit NIS erreicht werden. Es ist auch höchst homologe zwischen Mensch, Ratte und Maus-10. Darüber hinaus gibt es keine Berichte über Toxizität auf ektopische Expression von NIS in nicht-Schilddrüsenhor Zellen. Wichtig ist, wurde NIS auch nicht Host Immune Antworten, weder beim Menschen noch bei Nagetieren zugeordnet. NIS ein Reportergen diente als Promotor-Aktivität15,16,17 und gen Ausdruck18,19,20,21,22 messen ,23 in mehreren unterschiedlichen Kontexten. Es dient auch für die nicht-invasive Bildgebung Gen Therapie Vektoren24,25und Zellen in Herz4, hämatopoetischen26, Entzündung5und neuronale Studien27zu verfolgen. Vor kurzem hat NIS auch als ein Reportergen verwendet Krebs Metastasen in Vivo3,6verfolgen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, sind die wesentlichen Vorteile dieser Methode gegenüber früheren Techniken: (i) hochsensiblen nichtinvasive 3D in Vivo Lokalisierung und Quantifizierung von metastasierendem verbreiten, (Ii) automatisierte Produktion von [18F] BF4– am Aktivitäten mit hohem Molaren, (Iii) einen erheblichen Rückgang der benötigten Tiere durch longitudinale Bildgebung, (iv) die Akquisition gepaarte Daten aus nachfolgenden bildgebenden Sitzungen verbesserte statistische Daten, wodurch die Verwendung von Tieren und (V) wiederum weiter reduziert die intrinsische Option für ex-Vivo -Bestätigung der Krebszellen im Gewebe durch Zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>Schritt 1) Engineering und Charakterisierung von Krebszellen zur Expression des Radionuklid-Fluorescnece-Fusionsreporters NIS-FP.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazol</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Trivialer Name: Hoechst 33342; CAS-Nummer: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat - 10 mg/ml Lösung in Wasser.</td></tr><tr><td>4T1 murine Brustkrebs-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td> für <td>Details siehe ATCC Website</td></tr><tr><td>Automatischer Zellzähler, z.B. CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Model TT Cell Counter and Analyzer</td></tr><tr><td>CASYclean Reinigungsreagenz</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>CASYton Isotonisches Verdünnungsmittel</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Fluoreszenzmikroskop, z.B. Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland</td><td></td><td>Bestückung mit Plan-Neofluor 25& 0,5 NA und Plan-Apochromat 63 x 1,4NA Öl-UV-Objektive und Diodenlaser (405 nm), Argon-Ionen (458, 477, 488, 496, 514 nm) und HeNe (543 und 633 nm); Für die Bildaufnahme und -analyse wurde eine Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) verwendet</td></tr>: <tr><td>Deckgläser Nr. 1,5, Dicke</td>, <td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr>, <tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr>, <tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td>, <td>Supplement mit 10 % (v/v) FBS und L-Glutamin (2 mM), um das optimale Wachstumsmedium für MDA-MB-231-Zellen zu bilden.</td></tr><tr><td>FACS-Sortierer, z.B. BD FACSAria III&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Ausgestattet mit einer BD FACS DIVA Software, einem 6-Laser-System (375/405/488/561/633 nm-Laser) - Zellen sortiert mit einem 100 &mu; M Düse unter 20 psi Fließdruck, Fensterverlängerung von 2,0 &mu; m, 2,0 Neutraldichtefilter und 3 kV Plattenspannung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Hitze inaktiviert bei 56 &Grad; C für 30 min</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, z.B. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-Pertechnetat Energiefenster 110-155 keV&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 18F Energiefenster 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &micro; g/ml; Stattdessen kann DAPI (von verschiedenen Anbietern) verwendet werden.</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Lösung 200 mM konzentriertes, sterilfiltriertes lineares</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Linear, 25 kDa; Transfektionsreagenz für die 293T-Zelllinie.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 humane Brustkrebszellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Weitere Informationen finden Sie auf der ATCC-Website</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>Anfrage von unserem Labor</td><td>n/a</td><td>Für Details (Generierung und Karten) siehe Ergänzende Informationen</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>Anfrage von unserem Labor</td><td>n/a</td><td>Für Details (Generierung und Karten) siehe Ergänzende Informationen</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>Plasmide, die für die VSV-G-Hülle kodieren</td></tr><tr><td>pRRE</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>Verpackungsplasmid</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>Verpackungsplasmid</td></tr><tr><td>Paraformaldehydlösung 4 % (w/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Enthält Penicillin (10.000 Einheiten/ml) und Streptomycin (10 mg/ml), sterilfiltrierte</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>pH 7,4, sterilfiltriert und ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol - Vinylacetat)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Trivialname: Mowiol 4-88; CAS-Nummer: 9002-89-5</td></tr><tr><td>Puromycindihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>aus Streptomyces alboniger, rekonstituiert in sterilem Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge, z.B. Rotina 380 R Tischzentrigfuge</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Ergänzung mit 10% (v/v) FBS und L-Glutamin (2mM), um das optimale Wachstumsmedium für 4T1-Zellen zu bilden.</td></tr><tr><td>SFCA Spritzenvorsatzfilter 0,45 &mu; m</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzen 10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Unsterile Einwegspritzen</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop für Gewebekulturen, z.B. EVOS-FL&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Cell Imaging System ausgestattet mit einem 10-fachen Objektiv (PlanFL PH2, 10-fach; /0,25, &infin;/1,2) und einer Farbkamera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung 10-fach</td>;<td>Sigma</td><td>59418C</td> <td>(0,5 % (w/v) Trypsin, 0,2 % (w/v) EDTA) gammabestrahlt durch das SER-TAIN-Verfahren und ohne Phenolrot&nbsp;</td></tr><tr><td>Weizenkeim-Agglutinin Alexa Fluor 633 Konjugat&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>W21404</td><td>Verwendet bei 1:1000 (2 &micro; g/mL) für die Immunfluoreszenz von Zellen</td></tr><tr><td>Schritt 2) Etablierung von in vivo Tumormodellen.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Messschieber</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Für die Inhalation</td></tr><tr><td>Fluoreszenzlampe, z.B. NightSea Fluoreszenzlampe DFP-1</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Ausgestattet mit GFP- und RFP-Emissionsfiltern und NightSea-Filterbrille (DFP-1)</td></tr><tr><td>Spritzen 0,3 mL U-100 Insulin</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &mal; 1/2'' - 0,33 &mal; 12 mm</td></tr><tr><td>Standardmaterialien/-geräte für die aseptische Technik und Tierhaltung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schritt 3) Herstellung von [18F]BF4- unter Verwendung einer automatisierten Radiotracer-Syntheseplattform.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acetonitril (wasserfrei)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>Bortrifluoriddiethyletherat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216607</td><td>BF3. OEt2, durch Redestillation gereinigt, &ge; 46,5 % BF3Basis. CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Plattform für die automatisierte Radiotracersynthese (ARS), z. B. FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegkassetten für die ARS-Plattform, z. B. FASTLab-Kassetten</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Entwicklerpaket</td></tr><tr><td>Polygram Alox N/UV254 Polyesterplatten</td><td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>RadioTLC-Platten, 40-fach; 80 mm</td></tr><tr><td>Starke Anionenaustauschpatrone, z.B. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023525</td><td>Zustand mit 1M NaCl (10 mL) und H2O (10 mL)</td></tr><tr><td>Aluminiumoxid-Neutralpatrone, z.B. Sep-Pak Alumina N Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023561</td><td>Zustand mit H2O (10 mL), Aceton (10 mL) und Luft (20 mL)</td></tr><tr><td>Wasser für Injektionszwecke USP</td><td>GE Healthcare Nitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filter</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Steril 0,2 &micro; m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>Step 4) In vivo Bildgebung von NIS-FP-exprimierenden Zellen mittels nanoPET/CT.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Für die Inhalation</td></tr><tr><td>Präklinisches PET/CT Multimodales Bildgebungsinstrument, z.B. nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Ungarn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzbrenner, z.B. NightSea Fluoreszenzbrenner DFP-1</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Ausgestattet mit GFP- und RFP-Emissionsfiltern und NightSea Filterbrille (DFP-1)</td></tr><tr><td>Induktionskammer für Nagetieranästhesie</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>Mit Dreiwegeventilen (x2), Schlauchanschluss für den Einlass, PVC-Schlauch für den Gaseinlass (2 m) und 22 mm Spülschlauch (2 m)</td></tr><tr><td>Nagetieranästhesiesystem</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>Inklusive Tiermaske in geeigneter Größe für Tiere von Interesse und Isolfluran-Verdampfer</td></tr><tr><td>Sterile physiologische Kochsalzlösung</td><td>Thermo Scientific Oxoid BO0334B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzen 0,3 mL U-100 Insulin</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &mal 1/2'' - 0,33 &mal; 12 mm, zur intravenösen Injektion von Radiotracer</td></tr><tr><td>Veterinary Scavenger</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>VetScav Filterwiegemechanismus - 240 V mit automatischer Temperaturkompensation und LED-System</td></tr><tr><td>5) In vivo Datenanalyse.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Monte Carlo basierter iterativer 3D-Algorithmus</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Ungarn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>6) Ex vivo Analysen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- Methylbutan&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D</td><td>Vorgekühlt über flüssigem Stickstoff zum Einfrieren von OCT-eingebettetem Gewebe</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Deckblätter 22-mal; 50 mm</td><td>VWR International</td><td>SMITMCQ211022X50</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat, z.B. Kryostat MNT</td><td>SLEE Medical</td><td></td><td>zweiteilige modulare Histologie-Einbettungsmaschine, ausgestattet mit einem Einbettmodul, einem Gewebeaufbewahrungsfach und einer Kühlplatte</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson/Stratech</td><td>111-175-144</td><td>Verwendet bei 1:500 (2 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Lager 125 mg/mL</td></tr><tr><td>Mikrotomklingen, z.B. Feather S35&nbsp;</td><td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop (Weitfeld oder konfokal), z.B. Nikon Eclipse Ti-E Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ausgestattet mit 10&fach;, 20&fach; (Luft) und idealerweise 403 Mal; (Öl-)Objektive bzw. Laser/Filter bzw. Filterwürfel, die für Hoechst 33342, GFP und Cy5</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter geeignet sind, z.B. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-Pertechnetat Energiefenster 110-155 keV, 18F Energiefenster 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzadapter für Präpariermikroskope, z.B. NightSea Adapter</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Ausgestattet mit GFP- und RFP-Emissionsfiltern</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound&nbsp;</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Wachsstift, z. B. PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Wachsstift zum Zeichnen um den Gewebeschnitt herum, um die erforderlichen Färbe-/Waschlösungsmengen zu reduzieren</td></tr><tr><td>Paraformaldehydlösung 4 % (w/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Polyklonale Anti-Maus verwendet 1:50 (20 & Mikro; g/mL) für Gewebe Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Objektträger, z.B. Superfrost Objektträger</td><td>VWR, Lutterworth, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>erhältlich von verschiedenen Anbietern.</td><td></td><td>Tris-gepufferte Kochsalzlösung; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl bei pH 7,4</td></tr></tbody></table>

radionuklid-fluoreszenz-reporter-gen imaging zu tumorprogression in nagetier tumormodellen verfolgen

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metastasierung ist für die meisten Krebstodesfälle verantwortlich. Trotz der umfangreichen Forschung bleibt das mechanistische Verständnis der komplexen Prozesse für Metastasen unvollständig. In-Vivo -Modelle sind von größter Bedeutung für die Metastasierung Forschung, aber erfordern Raffinesse. Tracking-spontane Metastasen durch nicht-invasive in Vivo Bildgebung ist nun möglich, aber bleibt eine Herausforderung, da es langjährige Beobachtung und hohe Empfindlichkeit erfordert. Wir beschreiben ein längs kombinierte Radionuklid und Fluoreszenz Ganzkörper- in-Vivo imaging-Ansatz für die Verfolgung von Tumorprogression und spontane Metastasierung. Dieser Reporter-gen-Methodik beschäftigt die Natrium-Iodid Symporter (NIS) verschmolzen zu einem fluoreszierenden Protein (FP). Krebszellen sind stabil ausdrückliche NIS-FP gefolgt von Auswahl basierend auf Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung entwickelt. Mäuse sind entsprechende Tumormodellen gegründet. NIS-FP mit dem Ausdruck ihrer Krebszellen sind nicht-invasiv verfolgt in Vivo auf Ganzkörper-Ebene durch die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) mit der NIS Radiotracer [18F] BF4–. PET ist derzeit das empfindlichste in Vivo imaging-Technologie in dieser Größenordnung zur Verfügung und ermöglicht die zuverlässige und absolute Quantifizierung. Aktuelle Methoden setzen auf großen Kohorten von Tieren, die zur Beurteilung der Metastasen zu unterschiedlichen Zeitpunkten eingeschläfert werden oder verlassen sich auf kaum quantifizierbaren 2D Bildgebung. Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens sind: (i) hochsensiblen nichtinvasive in Vivo PET 3D-Bildgebung und Quantifizierung, (Ii), automatische PET-Tracer-Produktion, (Iii) eine signifikante Reduktion erforderlichen Tierzahlen durch bildgebende Wiederholungsoptionen, (iv). die Übernahme der gepaarten Daten aus nachfolgenden bildgebenden Sitzungen bietet bessere statistische Daten und (V) die intrinsische Option für ex-Vivo -Bestätigung der Krebszellen im Gewebe durch Fluoreszenzmikroskopie oder Zytometrie. In diesem Protokoll beschreiben wir alle Schritte, die erforderlich für routinemäßige NIS-FP-bot nicht-invasive in Vivo Krebs Zelle Tracking mit PET/CT und ex-Vivo Bestätigung der in-Vivo -Ergebnisse. Dieses Protokoll hat Anwendungen über Krebsforschung, wann immer in Vivo Lokalisation, Ausdehnung und langjähriger Überwachung einer Zellpopulation ist von Interesse.

Wir beschreiben ein Protokoll für die präklinische in Vivo Verfolgung von Krebsmetastasen. Es basiert auf einem Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Kombination von Natrium Iodid Symporter, entdeckt nichtinvasive [18F] Tetrafluoroborate-PET, und ein fluoreszierendes Protein für optimierte ex Vivo Bestätigung. Die Methode ist anwendbar für präklinische in Vivo Zelle tracking über Tumorbiologie.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das Tumorwachstum und die Metastasierung bei lebenden Nagetieren durch Bildgebung zu verfolgen. Ein Radionuklidfluoreszenz-Fusionsreporter ermöglicht den nicht-invasiven In-vivo-Nachweis mittels Positronen-Emissions-Tomographie mit dem Fluorophor, der die Ex-vivo-Bestätigung der Ergebnisse unterstützt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wenn Zellen in lebenden Tieren über einen längeren Zeitraum verfolgt werden müssen.Es kann zum Verständnis der Fernmetastasierung und des Einflusses von Behandlungen auf die Tumorprogression beitragen. Bei der beschriebenen Technik handelt es sich um die Verfolgung von Krebszellen durch hochempfindliche und nicht-invasive in vivo Bildgebung mit einem PET-Tracer, der durch automatisierte Synthese hergestellt wird. Sie bietet eine deutliche Reduzierung des Tiereinsatzes im Vergleich zur herkömmlichen Methodik.Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können sich von ihrer Komplexität überwältigt fühlen. Insbesondere die automatisierte Synthese des PET-Radiotracers vereinfacht diesen Prozess erheblich. Wir glauben, dass die visuelle Demonstration dieser Methode diese Ansichten über die kritischen Bildgebungsschritte zeigt, die mit der Bildgebung verbunden sind.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die präklinische Erprobung neuer Therapeutika, die auch entlang der Krebszellen verfolgt werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Krebsbiologie und die Entwicklung von Therapien geben. Immer dann, wenn in vivo die Lokalisierung, Umsiedlung, Expansion und Langzeitüberwachung einer bestimmten Population von Interesse ist.Verwenden Sie zunächst Reportergen-Plasmide, erzeugen Sie Lentivirus-Partikel, transduzieren Sie Zellen und charakterisieren Sie sie. Analysieren Sie dann die Funktion des Reportergens durch Radiotraceraufnahme in den NISFP-exprimierenden Zelllinien. Die gereinigten Zellen und das Wachstumsmedium in sechs Well-Platten aussäen, um sicherzustellen, dass alle Proben in dreifacher Ausfertigung vorbereitet werden.Am nächsten Morgen waschen Sie die Zellen mit freiem Serumwachstumsmedium und inkubieren die Platten mit 50 Kilo Becquerel F18-Tetrafluorborat bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Sammeln Sie dann den Überstand und geben Sie 100 Mikroliter in ein vorbeschriftetes Auffangröhrchen. Entsorgen Sie den restlichen Überstand und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter eiskaltem PVS, das Kalzium und Magnesium in physiologischer Konzentration enthält.Sammeln Sie die Waschlösung und geben Sie 100 Mikroliter der Waschlösung in ein vorbeschriftetes Auffangröhrchen. Wiederholen Sie dann den Waschvorgang noch einmal. Fügen Sie 500 Mikroliter PVS hinzu, das sowohl Trypsin als auch EDTA enthält, um die Zellen anzuheben.Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen ablösen, und überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Ablösung. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein beschriftetes Sammelröhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellproben bei 250 g für vier Minuten bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie einen automatisierten Gamma-Zähler, um die Proben aus jedem der vier Probentypen zu zählen und die prozentuale Aufnahme anhand von Gleichung eins zu ermitteln. Um mit der F18-Tetrafluorboratsynthese zu beginnen, richten Sie die automatisierte Radiosyntheseplattform in einer geeigneten chemischen Haube ein und stellen Sie sicher, dass die richtige XML-Datei auf den Steuercomputer geladen wird. Während der Synthesizer läuft, wird F18-Tetrafuoroborat hergestellt und anschließend auf einer anionischen Austauschpatrone gereinigt.Die Anionenaustauscherpatrone wird mit Wasser gespült und anschließend mit Stickstoffgas getrocknet. Das Endprodukt wird aus der Anionenaustauscherkartusche mit einem Milliliter 0,9 % Natriumchlorid angedeutet und über die Auslassleitung in ein Glasauffangfläschchen überführt. Um mit der Bildgebung zu beginnen, betäuben und bereiten Sie die Mäuse gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.Verwenden Sie dann sterile 0,9%ige Kochsalzlösung, um die F18-Tetrafluorboratlösung auf 5 Megabecquerel pro 50 Mikroliter zu verdünnen. Verwenden Sie eine Spritze mit einer Injektionsnadel, um 100 Mikroliter der F18-Tetrafluorboratlösung zu ziehen. Messen Sie die Radioaktivität in der Spritze und notieren Sie den Wert und den Zeitpunkt der Messung.Verabreichen Sie 50 Mikroliter der F18-Tetrafluorboratlösung intravenös in den vorgewärmten Schwanz. Messen Sie dann die verbleibende Radioaktivität in der Spritze und notieren Sie den Wert und den Zeitpunkt der Messung. Die Injektion des Radiotracers in die Schwanzvene ist von entscheidender Bedeutung.Wir führen es unter Tieranästhesie durch, um das Risiko einer Fehlinjektion und des Verschüttens von Radiotracern zu minimieren. Das Tier bleibt bis zum Beginn der PET-Bildaufnahme unter Narkose. Genau 45 Minuten nach der Radiotracer-Injektion.Stellen Sie als Nächstes einen Timer ein, der von 45 Minuten herunterzählt, und stellen Sie sicher, dass die Maus in sternaler Position auf dem Tisch positioniert ist. Installieren Sie die geeigneten chirurgischen Überwachungsinstrumente und stellen Sie sicher, dass die Instrumente ordnungsgemäß funktionieren, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie dann die Perameter für die CT-Bildgebung und die PET-Bildaufnahme ein.Wenn der Countdown-Timer 15 Minuten anzeigt, beginnt die CT-Bildaufnahme, und wenn der Timer null Minuten anzeigt, beginnt die PET-Bildaufnahme. Messen Sie zunächst die Radioaktivität der gesamten euthanasierten Maus und notieren Sie den Wert und den Zeitpunkt der Messung. Dann sezieren Sie die Mäuse und ernten Sie das notwendige Gewebe.Die Radioaktivität des verbleibenden Schlachtkörpers mit und ohne Schwanz wird gemessen. Notieren Sie diese Werte und notieren Sie die Messzeiten. Wiegen Sie anschließend alle entnommenen Gewebe einzeln und fotografieren Sie die Krebsorgane unter Tageslicht und Fluoreszenzlicht.Betten Sie dann das Gewebe für die nachgelagerte Histologie in die OCT ein. Messen Sie die Radioaktivität aller entnommenen Gewebe, notieren Sie den Wert und notieren Sie den Zeitpunkt der Messung. Stellen Sie abschließend die Daten als Standard-Aufnahmewerte oder SUV dar, wie in Gleichung zwei beschrieben.In diesem Experiment wurde die Genbildgebung mit Radionuklid-Floreszenzrekordern verwendet, um das Fortschreiten des Tumors in einem Nagetiertumormodell zu verfolgen. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine genaue Plasmamembranlokalisierung von NISFPs. Die Funktion und Spezifität des NISFP wurde unter Verwendung der NIS-Aufnahme durch Radiotracer quantifiziert.Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen 4T1NISGFP und 4T1NISRFP exprimierenden Zelllinien mit ähnlichen NIS-Expressionsniveaus festgestellt. Wichtig ist, dass der Prächloratblock in allen Zelllinien zeigte, dass die erhaltene Radiotraceraufnahme auf die spezifische NISFP-Expression zurückzuführen ist. Ganzkörper-PET-Bildgebungen von tumortragenden Tieren lieferten Informationen über die Tumorprogression und die Metastasierung.Das hier gezeigte Beispiel zeigt ausgedehnte lange Metastasen mit mehreren deutlichen Knötchen in der Lunge. Die prozentual injizierten Dosiswerte und das belegte Volumen der einzelnen Metastasen in der Lunge variierten. Die volumennormalisierten prozentualen Dosiswerte lagen jedoch in einem ähnlichen Bereich.Das fluoreszierende Protein im Dual-Mode-Reportergen ermöglichte die Identifizierung von Krebsgewebe unter Blütenlicht während der Sektion von Tieren. Die anschließende ex vivo Radiotracer-Biodistribution zeigte Organe mit hoher Radiotraceraufnahme und damit NIS-exprimierendem Gewebe. Während die Schilddrüse und die Speicheldrüsen sowie der Magen in ihrer Heimat NIS exprimieren, deuten alle anderen positiven Signale auf Krebsgewebe wie Tumor und Metastasen hin.Der Radionuklid-Fluoreszenzreporter ermöglicht auch die Identifizierung von Krebszellen in nachgeschalteten Gewebeschnitten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, den Prozess der spontanen Metastasierung sichtbar zu machen und zu testen, wie Medikamente ihn beeinflussen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, alle Schritte sorgfältig im Voraus zu planen.Zelllinien müssen etabliert, tierische Tumormodelle eingerichtet und alle Reagenzien und Geräte für die Bildgebung müssen am gewünschten Tag verfügbar sein. Wir empfehlen zunächst kleine Pilotversuche. Einmal gemeistert, können die Radiotracer-Produktion und die In-vivo-Bildgebung von Tieren mit sechs Tieren an einem achtstündigen Arbeitstag durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sich einem Reportergen nähern, das eine In-vivo-Zellverfolgung mit dem Radionuklid-Reporter NIS in Kombination mit einem fluoreszierenden Protein ermöglicht. Sie sollten auch in der Lage sein, NISFP-Reporter-exprimierende Zelllinien zu charakterisieren, um den erforderlichen PET-Radiotracer für die In-vivo-Bildgebung herzustellen und in vivo und ex vivo durch Verteilungsexperimente durchzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Fluorozytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.Zum Beispiel, wie das Immunzellprofil eines Tumors und seine Metastasierung zueinander in Beziehung stehen oder sich im Laufe der Zeit verändern. Vergessen Sie nicht, sicherzustellen, dass die von Ihnen produzierten Zelllinien frei von Mikroplasmiden sind, da Berichten zufolge letztere die Ergebnisse beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioisotopen extrem gefährlich sein kann und der Schutz von sich selbst und anderen bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorrang haben muss.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für...

Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

Dieses Video demonstriert das Protokoll für die orthotopische Implantation von grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in die Bauchspeicheldrüse der Maus. Das orthotope Mausmodell hilft bei der Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Therapeutika bei primären und metastasierten Tumoren.

Fluoreszierendes orthotopes Mausmodell: Implantation von GFP-exprimierenden Krebszellen in eine Maus zur Beurteilung der Tumorprogression in vivo

Quelle:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institut für Biowissenschaften, Universität Brasília, 2Abteilung für grundlegende psychologische Prozesse, Institut für Psychologie, Universität BrasíliaDieses Video zeigt das Verfahren zur Verfolgung der Tumorprogression in vivo,...

Biolumineszierende Bildgebung der Progression von Brusttumoren in einem weiblichen Mausmodell

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Molekulartomographie oder FMT für die in vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Protein-markierten Glioblastom-Xenotransplantaten in Mausmodellen. Die Technik ist nützlich, um die Wirkung von Anti-Tumor-Therapeutika auf molekularer Ebene aufzuklären.

Fluoreszenz-Molekulartomographie: Ein bildgebendes Verfahren für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierenden Protein-markierten Glioblastom-Xenotransplantaten im Mausmodell

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

Ein Verfahren zur orthotopischen Implantation von grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 GFP) in die Bauchspeicheldrüse von Balb-c Ola Hsd-Fox1nu Mäusen zur Beurteilung der Tumorprogression und Metastasierung wird hier vorgestellt.

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

Orthotopen intrakraniellen Injektion von Tumorzellen wurde in der Krebsforschung zur Gehirn Tumorbiologie, Fortschreiten, Evolution und therapeutische Reaktion zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen Fluoreszenz Molekulare Tomographie der Tumor Xenografts vorsieht, dass Echtzeit-intravitalen Bildgebung und Quantifizierung eines Tumors in präklinischen Glioblastom Modelle Masse.

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Erfahren Sie, wie Sie Tumorwachstum und Metastasen in Nagetieren mit Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Genen und PET-Bildgebung nicht-invasiv verfolgen. Diese Methode reduziert den Tierverbrauch erheblich.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

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