Name: Getrocknete Blut und Serum Spots als ein nützliches Werkzeug für die Lagerung der Probe, Cancer Biomarkers zu bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Lagerung von Blut und Serum als getrocknete Spots für Biomarker-Analysen bei Krebs und Infektionskrankheiten. Diese Methode ermöglicht die Probenaufbewahrung ohne Gefrieren für mindestens zwei Wochen.

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Wir möchten Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung bedanken.

Peripherem Blut und Serum wurden gesammelt und gespeichert von gesunden Spendern und Patienten, die schriftliche Einwilligungserklärung, an der Studie teilzunehmen gab. Das Studienprotokoll wurde von der lokalen Ethik-Kommission im Einklang mit den ethischen Standards gemäß der Deklaration von Helsinki 1964 genehmigt.
(1) Blut Lagerung im DBS
<ol><li>
Blut-Musterkollektion
	<ol>
<li>Sammeln Sie 3 mL des peripheren Blutprobe in einer 3 mL-Tube mit 5,4 mg Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Hinweis: Bewahren Sie peripherem Blut als DBS so bald wie möglich und innerhalb von 8 h.</li>
		<li>Schreiben Sie die Patienten Code-Nummer auf der unteren rechten Ecke der Karte Bildschirmschoner.</li>
		<li>Vorsichtig das Blut mit einer 5-mL-Pipette aufzuwirbeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blut Flecken auf DBS
	<ol>
<li>Pipette und einen Blutfleck (50 µL) auf die Bildschirmschoner-Karte (Table of Materials) mit 50-200 µL Spitze zu übertragen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.2.1. auf insgesamt 3 – 5 Blutpunkte haben. Entsorgen Sie die alte Spitze und nehmen Sie ein neues Kennwort für jedes Blut aliquoten.</li>
		<li>Lass die DBS über Nacht trocknen bei Raumtemperatur in einer horizontalen Position über eine offene nicht saugende Oberfläche, direkten Sonneneinstrahlung zu vermeiden. Lassen Sie die Abdeckung der Bildschirmschoner Karte geöffnet Blut trocknen zu erleichtern. Hinweis: Partikel in der Luft oder Staub während dieser Trocknung betrifft keine downstream-Anwendungen.</li>
		<li>Speichern Sie die Karte bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) DNA-Extraktion ab DBS gemäß DNA Extraktion Kit Datenblatt (Abschnitt für getrocknete Blutflecken)
<ol><li>
Vorbereitung der Probe
	<ol>
<li>3 getrocknete Blutflecken von der Karte zu verwenden. Schneiden Sie jeder der getrockneten Blutflecken von der Karte und trennen Sie sie von der Karte mit einer Pinzette. Schneiden Sie die getrennten getrocknete Blutflecken in kleine Stücke (ca. 1 mm Durchmesser).</li>
		<li>Legen Sie die kleinen Stücke in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probe-Verdauung
	<ol>
<li>Fügen Sie 180 µL Lyse Puffer 1 im Kit (Table of Materials), um das Rohr zur Verfügung gestellt. Fügen Sie 20 µL Proteinase K. Nicht mischen Sie Lyse Puffer 1 vor mit Blut beschmutzt Karte in 1,5 mL Röhrchen Pipettieren mit Proteinase k. Durch Vortexen mischen.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr in eine Thermoincubator und bei 56 ° C für 60 min inkubieren. Wenn die Thermoincubator nicht mit einem Shaker, Wirbel der Probe ausgestattet ist alle 10 – 15 min. für mindestens 10 s, kümmert sich nicht um die Temperatur der Probe verringern lassen. Zentrifugieren Sie kurz die Rohre zum Tropfen aus dem Deckel entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschschritt
	<ol>
<li>Fügen Sie 200 µL der Lyse Puffer 2 (Table of Materials) und Wirbel für 10 s.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in einem Thermomixer oder beheizten orbital Inkubator und bei 70 ° C für 10 min inkubieren. Wenn die Thermoincubator nicht mit einem Shaker ausgestattet ist Wirbel die Proben einmal für mindestens 10 s, kümmert sich nicht um die Temperatur der Proben verringern lassen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.1. Die 400 µL lysate von 1,5 mL-Tube auf Elution Spalte (Table of Materials) übertragen. Zentrifugieren Sie die Spalte bei 6.000 x g für 1 min.</li>
		<li>Setzen Sie die Elution Säule in eine neue 2 mL sammelröhrchen und entsorgen Sie die alte Version.</li>
		<li>Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 1 (Table of Materials) und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min.</li>
		<li>Legen Sie die Spalte in eine neue 2 mL sammelröhrchen und entsorgen Sie die alte Version.</li>
		<li>Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 2 (Table of Materials) und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min.</li>
		<li>Legen Sie die Spalte in eine neue 2 mL sammelröhrchen und entsorgen Sie die alte Version.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 3 min um die Membran zu trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elution Schritt
	<ol>
<li>Legen Sie die Spalte in eine neue 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und verwerfen Sie dem Sammelrohr zu.</li>
		<li>Platz 50 µL destilliertes Wasser in die Mitte der Membran. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 20.000 X g für 1 min. sammeln das Eluat und legen Sie sie wieder in der Mitte der Membran.</li>
		<li>Zentrifuge das Rohr auf 20.000 X g für 1 min. verwerfen die Membran.</li>
		<li>Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Shop-DNA bei-20 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Aus DBS extrahierte DNA lässt sich mehrere Analysen wie SNP Bewertung durch Real-Time PCR oder DNA-Sanger-Sequenzierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Serum-Speicher für DSS
<ol><li>
Blut-Musterkollektion
	<ol>
<li>7 mL peripherem Blut Probe in einer 7 mL Tube ohne EDTA zu sammeln. Lassen Sie die Blutabnahme, für 30 min bei Raumtemperatur gerinnen.</li>
		<li>Schreiben Sie die Patienten Code-Nummer auf der unteren rechten Ecke der Karte Bildschirmschoner.</li>
		<li>Zentrifugieren der Blutprobe auf 980 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Bewahren Sie Serum als DSS so bald wie möglich und innerhalb von 8 h.</li>
		<li>Sorgfältig entfernen des Überstands aus der Tube und überträgt es auf eine neue 15 mL Tube. Vorsichtig das Blut mit einer 5-mL-Pipette aufzuwirbeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Serum Schmierblutungen in DSS
	<ol>
<li>Pipette und eins von Serum (50 µL) auf die Bildschirmschoner-Karte zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, um eine Gesamtmenge von 3 – 5 Blutpunkte haben. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, genau 50 µL Serum in jedem Fleck pipette. Serum sollte nicht über der gestrichelten Linie der Karte hinausgehen.</li>
		<li>Lassen Sie die DSS über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Lassen Sie die Abdeckung der Bildschirmschoner Karte geöffnet Blut trocknen zu erleichtern.</li>
		<li>Speichern Sie die Karte bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel bis zur Verwendung. Wenn der Speicher länger als 14 Tage ist, speichern Sie die Karte bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ELISA-Assay ausgehend von DSS
<ol><li>
Eluieren Sie Protein von DSS.
	<ol>
<li>Bei Bedarf tauen Sie ein DSS für jede Probe auf. DSS in kleine Stücke (ca. 1 mm im Durchmesser) schneiden. Setzen Sie die Stücke in ein 1,5 mL Röhrchen mit 400 µL PBS.</li>
		<li>Schütteln Sie die Proben über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Schütteln sie bei niedriger Intensität. PBS sollte die Abdeckung des Rohres beim Schütteln nicht nass werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie das Protein Eluat als einer Serumprobe für sekretierten Proteine/Wachstum Faktorenanalyse nach ELISA Kit Anweisungen, nach entsprechenden Verdünnungen. Hinweis: Dieses Verfahren funktioniert gut für DBP Erkennung9. Für andere ELISA-Assays kann ein Optimierungsschritt erforderlich sein.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Dieses Protokoll untersucht das Potential für die Lagerung von Blut und Serum auf Filterpapier bei die Übungseinheiten keine Mitarbeiter oder Infrastrukturen benötigt für die korrekte Handhabung von Blutproben haben. Vor allem Vollblut oder Serum gesammelt in standard Röhren oder per Finger-stechen kann mit dieser Methode gespeichert werden und gibt es keine Notwendigkeit, sofort nach der Blutentnahme Proben bei-20 ° C oder-80 ° C eingefroren. DBS/DSS können bei Raumtemperatur bis zu 14 Tage lang ohne jede Änderung im Bl...

Das Hauptziel der Forschung in Krebs-Biomarker ist die Identifizierung neuer biologischer Parameter, die verwendet werden können, für die Diagnose und für Vorhersage Prognose der Patienten, für die Bestimmung, ob ein Patient auf eine bestimmte Behandlung ansprechen wird. Dieses Forschungsgebiet ist von grundlegender Bedeutung für die Entdeckung des innovativen Krebstherapien und spielt eine Schlüsselrolle in maßgeschneiderte Behandlung.
Bei jedem Schritt der Biomarker-Identifizierung und Validierung durchgeführten Verfahren müssen zuverlässig und reproduzierbar sein. Ein Eckpfeiler für den Erfolg der translationalen Forschung ist die korrekte Lagerung von biologischen Proben wie Blut und Serum. Dies ist der erste Schritt zur Gewinnung qualitativ hochwertige biologische Material, das verwendet werden kann, molekularbiologische Experimente oder Protein-Tests durchführen.
Multizentrische Studien sind oft erforderlich, um genügend Patienten um aussagekräftige Daten zu erhalten. Nicht alle Institute sind in der Lage, Proben bei-80 ° C zu speichern oder Proben zu anderen internationalen Zentren in Trockeneis zu senden. Die Verwendung von Filterpapier für die Blutentnahme ist eine einfache Methode zum Speichern von Blut und Serum und erfordert keine sofortige Einfrieren der Proben1,2. Ein Tropfen Blut oder Serum kann auf das Papier, verließ über Nacht trocknen und dann für bis zu 14 Tage bei Raumtemperatur1,2gespeichert gesichtet werden. So haben Forscher Zeit senden Sie die Proben an andere Laboratorien. Die Verwendung von getrocknetem Blut Flecken (DBS) und getrocknete Serum Flecken (DSS) könnte so vereinfachen Sie die Zusammenarbeit zwischen den Instituten in Industrie-und Entwicklungsländern.
Aufgrund seiner einfachen Handhabung, ist DBS Stichproben in verschiedenen Arten von Tests für serologische oder genetische nachgeschalteten Analysen weit verbreitet. Beispielsweise wurden in der Vergangenheit häufig DBS HIV-screening in Entwicklungsländern1,2,3,4,5verwendet. Ein weiterer Vorteil dieser Speichermethode ist, dass Finger-Schwänze, so dass seine Verwendung für Neugeborenen-screening Tests 6,7,8Blutproben entnommen werden können. Einfach Probe Handhabung und Transport sind weitere Vorteile des DBS, vor allem für Proben an remote-Standorten wo gibt es keine Laborgeräte. In einer früheren Publikation verwendeten wir DBS und DSS, um Vitamin D und Vitamin-D-bindendes Protein (DBP) in einer Reihe von kaukasischen und afrikanischen Patienten9zu testen. Unsere afrikanischen Kollegen konnten nicht Trockeneis zu erhalten. Um die biologische Marker zum Verständnis der Unterschiede in der Vitamin-D-Weg zwischen den zwei ethnischen Bevölkerungen zu vergleichen, haben wir das Verfahren mit übereinstimmenden Muster gespeichert unter Standardbedingungen und auf Filterpapier weiter optimiert. Nach der Optimierung des DBS/DSS-Verfahrens, konnten wir DBP und Vitamin D im Patientenserum in beiden Kohorten analysieren. Wir haben auch eine Reihe von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) nach der Extraktion der DNA aus Vollblut für Kaukasier und DBS für Afrikaner9. Dieses Protokoll ermöglicht qualitativ hochwertige Blutproben bei Raumtemperatur gelagert werden, ohne die verschiedenen Arten der nachgeschalteten Analysen von Molekularbiologie bis hin zu ELISA-Assays. Es wird empfohlen für den Einsatz an biologischen Materialien in multizentrischen Studien verwalten oder für die Zentren, die nicht über Einrichtungen für standard Lagerbedingungen. Das folgende Protokoll stellt den Höhepunkt dieser optimierten Verfahren.

<table><tbody><tr><td>Whatman Protein Sparkarten 903 Protein Sparkarte, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Nützlich für die Lagerung von Proben bei Raumtemperatur für nachgelagerte Analysen</td></tr><tr><td>Falcon Serologische Pipetten, 5 mL</td><td>Stammzell</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 & Mikro; L-Spitzen</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Dies ist ein DNA-Extraktionskit, das für die Isolierung kleiner DNA-Mengen entwickelt wurde. &nbsp;</td></tr><tr><td>Puffer ATL (im QIAamp DNA-Mikrokit enthalten)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dies wird im Text als Lysepuffer 1 gemeldet</td></tr><tr><td>Puffer AL (im QIAamp DNA-Mikrokit enthalten)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dies wird als Lysepuffer 2 im Text</td></tr><tr><td>QIAamp Mini-Eluspalten</td><td>gemeldet Qiagen</td><td></td><td>Dies wird als Spalte im Text</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (im QIAamp DNA Microkit enthalten)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dies wird als Waschpuffer 1 im Text</td></tr><tr><td>AW2&nbsp; (im QIAamp DNA Microkit enthalten)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Dies wird als Waschpuffer 2 im Text</td></tr><tr><td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D Systeme</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

getrocknete blut und serum spots als ein nützliches werkzeug für die lagerung der probe, cancer biomarkers zu bewerten

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Blut-Sample-Qualität ist entscheidend für genaue nachgeschalteten Analysen wie Real-Time PCR und ELISA zu gewährleisten. Richtige Lagerung von biologischen Materialien ist der Ausgangspunkt, reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Alle Proben sollten auf die gleiche Weise von Blutentnahme zur Lagerung behandelt werden. Je nach den Analysen durchgeführt werden sollten Vollblut und Serumproben bis zur Verwendung bei-20 ° C oder-80 ° C gelagert werden. Blut/Serum Proben sollte auch regelmäñig, mehrere Einfrieren Auftauen zu vermeiden. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Probe Bedingungen während des Transportes von einem Labor zum anderen. Trockeneis ist nicht verfügbar, oder die Sendung dauert länger als ein paar Tage, sind alternative Ansätze erforderlich. Eine Option ist, Filterpapier für die Blutentnahme zu verwenden. Hier schlagen wir eine Methode für Blut und Serum-Sample-Sammlung, die nutzt getrocknete Blutflecken (DBS) und getrocknete Serum Flecken (DSS). Wir entwickelten das Verfahren, um durch Real-Time PCR DNA von DBS für die nachgelagerten Bewertung der einige Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu extrahieren. Wir haben auch einen ELISA-Test ab Proteine eluiert von DSS optimiert. Diese Methode kann mit anderen ELISA-Assays oder Verfahren, die Bewertung von Proteinen verwendet werden.

Wir nutzten die DBS und DSS Verfahren zum Speichern von Blut und Serum bei Raumtemperatur ohne dass die Qualität des biologischen Materials. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die Protein-Karte-Saver ohne Blut und nach der Blutentnahme. Um zu bestätigen, dass die Speicherung auf Filterpapier und das Verfahren zum Blut eluieren probenqualität nicht beeinträchtigen, haben wir einen Vergleich mit Standardspeicher Methoden durchgeführt. Wir extrahierten DNA aus 3...

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und nützliche Methode zum Speichern von peripherem Blut und Serum/Plasma für nachgelagerte Analysen wie Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Bewertung und ELISA-Assay.

Getrocknete Blut und Serum Spots als ein nützliches Werkzeug für die Lagerung der Probe, Cancer Biomarkers zu bewerten

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der translationalen Forschung zu beantworten, wie z.B. die Möglichkeit, Biomarker bei Patienten aus Entwicklungsländern zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, Blut- und Serumproben mindestens zwei Wochen lang ohne Einfrieren zu lagern und qualitativ hochwertiges Material für nachgelagerte Analysen wie qPCR und ELISA bereitzustellen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Krankheiten wie Krebs und Infektionskrankheiten.Diese Methode kann auch in diagnostischen oder Forschungsbereichen wie der Erforschung pränataler Krankheiten oder der Analyse infektiöser Pathologien wie HIV angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir begannen, Biomarker zwischen einer kaukasischen und einer afrikanischen Fallserie zu vergleichen, für die keine gefrorenen Proben verfügbar waren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Blutuntersuchung schwer zu erlernen sind.Bei diesem Verfahren werden drei Milliliter einer Blutprobe in einem drei Milliliter Röhrchen mit 5,4 Milligramm EDTA entnommen. Schreiben Sie die Patientencodenummer in die untere rechte Ecke der Sparkarte. Suspendieren Sie das Blut vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Pipette.Als nächstes pipettieren Sie und übertragen Sie einen Blutfleck auf die Sparkarte. Wiederholen Sie die Schmierblutung mit einer neuen Spitze für jedes Blutaliquot, um insgesamt drei bis fünf Blutflecken zu erhalten. Lassen Sie die getrockneten Blutflecken (DBS) über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, wobei die Abdeckung der Sparkarte in horizontaler Position auf einer offenen, nicht saugenden Oberfläche geöffnet ist und direkte Sonneneinstrahlung vermieden wird.Bewahren Sie die Karte am nächsten Tag bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel auf. Die DNA wird aus drei getrockneten Blutflecken von der Sparkarte extrahiert. Beginnen Sie damit, jedes DBS von der Karte abzuschneiden und von der Karte zu trennen.Schneiden Sie das abgetrennte DBS in kleine Stücke von etwa einem Millimeter Durchmesser. Legen Sie die kleinen Stücke aus einem DBS in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Um die Proben zu verdauen, geben Sie in das Röhrchen 180 Mikroliter Lysepuffer aus einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit und fügen Sie dann 20 Mikroliter Proteinase K.Mix durch Vortexen hinzu.Legen Sie das Röhrchen in einen Thermo-Inkubator und inkubieren Sie es unter Schütteln bei 56 Grad Celsius für 60 Minuten. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um Tropfen vom Deckel zu entfernen. Beginnen Sie die Wäsche, indem Sie 200 Mikroliter Lysepuffer zwei hinzufügen und 10 Sekunden lang vortexen.Legen Sie das Röhrchen in einen Thermomischer und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Legen Sie die Elusionssäule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das alte. Fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei der 6000-fachen Schwerkraft.Legen Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Auffangröhrchen und entsorgen Sie das alte. Fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 6000-facher Schwerkraft. Legen Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Auffangröhrchen und entsorgen Sie das alte.Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei der 20.000-fachen Schwerkraft, um die Membran zu trocknen. Um die DNA zu eluieren, setzen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Entnahmeröhrchen. Geben Sie 50 Mikroliter destilliertes Wasser auf die Mitte der Membran und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei der 20.000-fachen Schwerkraft. Entnehmen Sie die Elue und legen Sie sie wieder in die Mitte der Membran. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei der 20.000-fachen Schwerkraft für eine Minute.Entsorgen Sie die Membran. Nach der Messung der DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer lagern Sie die DNA bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Für dieses Verfahren werden zunächst sieben Milliliter periphere Blutprobe in einem Sieben-Milliliter-Röhrchen ohne EDTA entnommen.Lassen Sie die Blutprobe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen. Schreiben Sie die Patientencodenummer in die untere rechte Ecke der Sparkarte. Zentrifugieren Sie die Blutprobe bei 1100-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur für 15 Minuten.Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und geben Sie es in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie das Blut vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Pipettieren und einen Punkt Serum auf die Sparkarte übertragen.Wiederholen Sie die Schmierblutungen, um insgesamt drei bis fünf Blutflecken zu haben. Lassen Sie die getrockneten Sero Spots bei geöffneter Hülle der Sparkarte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Bewahren Sie die Karte am nächsten Tag bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel auf.Bei einer Lagerung von mehr als 14 Tagen bei minus 20 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie sich auf den ELISA-Assay vor, indem Sie bei Bedarf das DSS für jede Probe auftauen. Um das Protein aus dem DSS zu eluieren, schneidet man ein DSS in kleine Stücke von etwa einem Millimeter Durchmesser und gibt die Stücke in ein 1,5 Milliliter Röhrchen.Fügen Sie dann vier Mikroliter PBS hinzu. Schütteln Sie die Proben bei niedriger Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius über Nacht. Verwenden Sie am folgenden Tag eine geeignete Verdünnung des Proteinelus als Serumprobe für die Analyse des sekretierten Proteins oder der Wachstumsfaktoren mit einem handelsüblichen Kit.In diesem Protokoll wurden Blut- und Serumproben als getrocknete Flecken auf Filterpapier bei Raumtemperatur gelagert. Vor und nach der Blutentnahme wird eine repräsentative Proteinsparkarte vorgezeigt. Um zu bestätigen, dass die Lagerung auf Filterpapier und das Verfahren zur Bluteluierung die Probenqualität nicht beeinträchtigen, wurden ELISA-Assays für Vitamin-D-bindende Proteine (DBP-Werte) an acht Serumproben durchgeführt, die in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen gesammelt und sofort bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder als getrocknete Serumflecken gesammelt wurden.Der Variationskoeffizient (CV) zwischen übereinstimmenden Stichproben lag zwischen 2 % und 24 % und der mittlere CV betrug 9,6 %. Nach der Beherrschung kann diese Technik in 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können nachgelagerte Methoden der Molekularbiologie oder Proteinanalytik durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik die Zusammenarbeit der Forschung auf dem Gebiet der translationalen Forschung und der Biomarker-Analyse mit Instituten aus der ganzen Welt, die nicht über die Laborausrüstung verfügen, um biologische Proben unter Standardbedingungen zu lagern.Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Blutproben in getrocknetem Blut und Serumflecken richtig lagern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut und chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel getroffen werden sollten.

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Forschung

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Biomarker sind direkt gemessene biologische Indikatoren von Krankheit oder Gesundheit. In der Bevölkerung und Sozialwissenschaften, Biomarker müssen leicht zu bekommen, Transport zu sein, und zu analysieren. Getrocknete Blut Spot (DBS) Sammlung erfüllt dieses Bedürfnis kann im Feld mit hohen Ansprechraten gesammelt und für eine Vielzahl von Biomarkern analysiert werden.

Trockenblut Sammlung von Gesundheits-Biomarker zur Teilnahme am Bevölkerungsstudien maximieren

Hier beschreiben wir einen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) Assay zur Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus in getrockneten Blutflecken mit einem einfachen manuellen Proteinfällungsschritt und Online-Säulenextraktion.

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Die Vorbereitung und Verarbeitung von getrocknetem Blutflecken (DBS) für ihre letzten Endes sind immer noch schlecht für die meisten diagnostischen Anwendungen standardisiert. Um dieses Defizit zu überwinden, ist ein umfassende Schritt für Schritt Protokoll vorgeschlagen und anschließend bewertet im Hinblick auf ihre Wirksamkeit für die Erkennung von Markierungen von Virusinfektionen.

Getrocknete Blutflecken - Vorbereitung und Verarbeitung für den Einsatz in Immunoassays und Molekulare Techniken

Kutane Tumoren werden oft nach Mohs mikrographischen Chirurgie verworfen. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das es dem klinischen Hilfspersonal ermöglicht, kutane Tumor- ( zB Plattenepithelkarzinom-, Basalzellkarzinom- und Melanom-) Proben für nachgeschaltete Laboranwendungen effektiv zu verarbeiten und zu speichern, ohne die klinischen Operationen zu beeinträchtigen.

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Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

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Biobanken sind wichtige Ressourcen für die biomedizinische Forschung und die Biobank for Translational and Digital Medicine Unit am European Institute of Oncology ist ein Modell auf diesem Gebiet. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Standardarbeitsanweisungen von Biobanken für das Management verschiedener Arten von humanbiologischen Proben.

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Die Flüssigbiopsie hat unseren Ansatz für translationale Onkologiestudien revolutioniert, wobei die Probenentnahme, -qualität und -lagerung entscheidende Schritte für ihre erfolgreiche klinische Anwendung sind. Hier beschreiben wir ein standardisiertes und validiertes Protokoll für nachgelagerte zirkulatorfreie DNA-Anwendungen, das in den meisten translationalen Forschungslabors angewendet werden kann.

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Es wird ein Protokoll zur Bestimmung von Biomarkern mit geringer Abundanz aus getrockneten Serumproben vorgestellt, das am Beispiel des Biomarkers Progastrin-freisetzendes Peptid (ProGRP) veranschaulicht wird. Antikörperbeschichtete magnetische Beads werden zur selektiven Aufreinigung und Anreicherung eines proteotypischen ProGRP-Peptids verwendet. Das eingefangene Peptid wird anschließend mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert.

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.

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Dieses Protokoll standardisiert die SDS-PAGE-Analyse für personalisierte Protein-Koronaprofilierungen auf Nanopartikeln und ermöglicht so eine reproduzierbare, skalierbare und kostengünstige Detektion krebsspezifischer Signaturen. Konzipiert für die frühzeitige Diagnose eines pankreatalen ductalen Adokarzinoms, bietet es eine praktische, BERUHIGT ausgerichtete Alternative zu komplexen proteomischen Methoden sowohl in Forschung als auch in klinischen Umgebungen.

Standardisierter SDS-PAGE-Workflow für personalisiertes Protein-Corona-Profiling bei der frühen Krebserkennung

Erfahren Sie die Lagerung von Blut und Serum als getrocknete Spots für Biomarker-Analysen bei Krebs und Infektionskrankheiten. Diese Methode ermöglicht die Probenaufbewahrung ohne Gefrieren für mindestens zwei Wochen.

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