Getrocknete Blut und Serum Spots als ein nützliches Werkzeug für die Lagerung der Probe, Cancer Biomarkers zu bewerten

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der translationalen Forschung zu beantworten, wie z.B. die Möglichkeit, Biomarker bei Patienten aus Entwicklungsländern zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, Blut- und Serumproben mindestens zwei Wochen lang ohne Einfrieren zu lagern und qualitativ hochwertiges Material für nachgelagerte Analysen wie qPCR und ELISA bereitzustellen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Krankheiten wie Krebs und Infektionskrankheiten.

Diese Methode kann auch in diagnostischen oder Forschungsbereichen wie der Erforschung pränataler Krankheiten oder der Analyse infektiöser Pathologien wie HIV angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir begannen, Biomarker zwischen einer kaukasischen und einer afrikanischen Fallserie zu vergleichen, für die keine gefrorenen Proben verfügbar waren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Blutuntersuchung schwer zu erlernen sind.

Bei diesem Verfahren werden drei Milliliter einer Blutprobe in einem drei Milliliter Röhrchen mit 5,4 Milligramm EDTA entnommen. Schreiben Sie die Patientencodenummer in die untere rechte Ecke der Sparkarte. Suspendieren Sie das Blut vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Pipette.

Als nächstes pipettieren Sie und übertragen Sie einen Blutfleck auf die Sparkarte. Wiederholen Sie die Schmierblutung mit einer neuen Spitze für jedes Blutaliquot, um insgesamt drei bis fünf Blutflecken zu erhalten. Lassen Sie die getrockneten Blutflecken (DBS) über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, wobei die Abdeckung der Sparkarte in horizontaler Position auf einer offenen, nicht saugenden Oberfläche geöffnet ist und direkte Sonneneinstrahlung vermieden wird.

Bewahren Sie die Karte am nächsten Tag bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel auf. Die DNA wird aus drei getrockneten Blutflecken von der Sparkarte extrahiert. Beginnen Sie damit, jedes DBS von der Karte abzuschneiden und von der Karte zu trennen.

Schneiden Sie das abgetrennte DBS in kleine Stücke von etwa einem Millimeter Durchmesser. Legen Sie die kleinen Stücke aus einem DBS in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Um die Proben zu verdauen, geben Sie in das Röhrchen 180 Mikroliter Lysepuffer aus einem handelsüblichen DNA-Extraktionskit und fügen Sie dann 20 Mikroliter Proteinase K.Mix durch Vortexen hinzu.

Legen Sie das Röhrchen in einen Thermo-Inkubator und inkubieren Sie es unter Schütteln bei 56 Grad Celsius für 60 Minuten. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um Tropfen vom Deckel zu entfernen. Beginnen Sie die Wäsche, indem Sie 200 Mikroliter Lysepuffer zwei hinzufügen und 10 Sekunden lang vortexen.

Legen Sie das Röhrchen in einen Thermomischer und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Legen Sie die Elusionssäule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das alte. Fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei der 6000-fachen Schwerkraft.

Legen Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Auffangröhrchen und entsorgen Sie das alte. Fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 6000-facher Schwerkraft. Legen Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Auffangröhrchen und entsorgen Sie das alte.

Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei der 20.000-fachen Schwerkraft, um die Membran zu trocknen. Um die DNA zu eluieren, setzen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Entnahmeröhrchen. Geben Sie 50 Mikroliter destilliertes Wasser auf die Mitte der Membran und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei der 20.000-fachen Schwerkraft. Entnehmen Sie die Elue und legen Sie sie wieder in die Mitte der Membran. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei der 20.000-fachen Schwerkraft für eine Minute.

Entsorgen Sie die Membran. Nach der Messung der DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer lagern Sie die DNA bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Für dieses Verfahren werden zunächst sieben Milliliter periphere Blutprobe in einem Sieben-Milliliter-Röhrchen ohne EDTA entnommen.

Lassen Sie die Blutprobe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen. Schreiben Sie die Patientencodenummer in die untere rechte Ecke der Sparkarte. Zentrifugieren Sie die Blutprobe bei 1100-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen und geben Sie es in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie das Blut vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Pipettieren und einen Punkt Serum auf die Sparkarte übertragen.

Wiederholen Sie die Schmierblutungen, um insgesamt drei bis fünf Blutflecken zu haben. Lassen Sie die getrockneten Sero Spots bei geöffneter Hülle der Sparkarte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Bewahren Sie die Karte am nächsten Tag bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in einer Plastiktüte mit Trockenmittel auf.

Bei einer Lagerung von mehr als 14 Tagen bei minus 20 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie sich auf den ELISA-Assay vor, indem Sie bei Bedarf das DSS für jede Probe auftauen. Um das Protein aus dem DSS zu eluieren, schneidet man ein DSS in kleine Stücke von etwa einem Millimeter Durchmesser und gibt die Stücke in ein 1,5 Milliliter Röhrchen.

Fügen Sie dann vier Mikroliter PBS hinzu. Schütteln Sie die Proben bei niedriger Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius über Nacht. Verwenden Sie am folgenden Tag eine geeignete Verdünnung des Proteinelus als Serumprobe für die Analyse des sekretierten Proteins oder der Wachstumsfaktoren mit einem handelsüblichen Kit.

In diesem Protokoll wurden Blut- und Serumproben als getrocknete Flecken auf Filterpapier bei Raumtemperatur gelagert. Vor und nach der Blutentnahme wird eine repräsentative Proteinsparkarte vorgezeigt. Um zu bestätigen, dass die Lagerung auf Filterpapier und das Verfahren zur Bluteluierung die Probenqualität nicht beeinträchtigen, wurden ELISA-Assays für Vitamin-D-bindende Proteine (DBP-Werte) an acht Serumproben durchgeführt, die in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen gesammelt und sofort bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder als getrocknete Serumflecken gesammelt wurden.

Der Variationskoeffizient (CV) zwischen übereinstimmenden Stichproben lag zwischen 2 % und 24 % und der mittlere CV betrug 9,6 %. Nach der Beherrschung kann diese Technik in 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können nachgelagerte Methoden der Molekularbiologie oder Proteinanalytik durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik die Zusammenarbeit der Forschung auf dem Gebiet der translationalen Forschung und der Biomarker-Analyse mit Instituten aus der ganzen Welt, die nicht über die Laborausrüstung verfügen, um biologische Proben unter Standardbedingungen zu lagern.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Blutproben in getrocknetem Blut und Serumflecken richtig lagern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut und chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel getroffen werden sollten.