Ein Graben/Tunneling Test zur Erkennung von Hypoxie in Drosophila Melanogaster Larven

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, Drosophila-Larven zu identifizieren, die trotz normaler Sauerstoffwerte an Gewebehypoxie leiden. Bei Drosophila gibt es viele Mutationen, die zu einem langsamen, schlechten Wachstum der Larven und einigen Larven zur Trägheit führen. Dieser Assay identifiziert innerhalb dieser Klasse von Larven diejenigen, die an Gewebehypoxie leiden.

Letztendlich wird dieser Assay dazu beitragen, mehr Mutationen zu identifizieren, die durch verschiedene physiologische Prozesse zu Sauerstoffmangel im Gewebe führen. Die Idee zu diesem Assay entstand aus der Beobachtung, dass Larven mit geschädigten Atemwegen oder Luftröhren zwei seltsame Verhaltensweisen zeigten. Diese abnormalen Verhaltensweisen sind das Versäumnis, sich während des frühen Larvenlebens in die Nahrung einzugraben, und das Versäumnis, sich während der Wanderphase in ein weicheres Substrat einzugraben.

Richten Sie die Kontrolle und experimentelle genetische Kreuzungen in Eiablageschalen ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Halte die Fliegen mindestens zwei Tage lang im Dunkeln, bevor du mit dem zeitgesteuerten Sammeln von Eiern beginnst. Für eine zeitgesteuerte Eierentnahme setzen Sie die Erwachsenen früh am Tag auf neue Trauben-Agar-Platten um, die mit einem frischen Abstrich Hefepaste dekoriert sind, und lassen Sie die Erwachsenen vier Stunden lang Eier auf die Teller legen.

Nach vier Stunden die erwachsenen Tiere auf frische Trauben-Agar-Platten umfüllen. Als nächstes inkubieren Sie die vierstündigen Sammelplatten über Nacht bei 25 Grad Celsius. Bis zum nächsten Nachmittag werden die meisten Larven geschlüpft sein.

Planen Sie mindestens 50 für jede Versuchsgruppe ein. Bereiten Sie für einen einzigen Durchlauf des Assays mindestens fünf Assay-Platten pro Versuchsgruppe vor. Fügen Sie 16 Gramm Flugagar und 700 Milliliter deionisiertes Wasser durch Erhitzen hinzu.

Bereiten Sie ein 17,5 Milliliter Nipagen in 95%Ethanol zu. Erhitzen Sie die Agarlösung, bis sie sich fast vollständig aufgelöst hat. Geben Sie dann Nipagen-Lösung zur Agar-Lösung und erhitzen Sie, bis sich das Agar vollständig aufgelöst hat.

Kühlen Sie die Agarlösung kurz ab, dann beladen Sie 10 Zentimeter große Platten mit 15 Millilitern der Agarlösung. Sobald das Agar geliert, legen Sie die Deckel auf die Platten und lassen Sie sie einige Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Ausgehärteter Agar muss sich fest anfühlen und nicht zerbröckeln, wenn Stücke herausgeschnitten werden.

Sobald das Agar ausgehärtet ist, verwenden Sie eine 1,5 Zentimeter große Korkplatte, um ein zentrales Loch in das Agar-Gel in jeder Platte zu bohren. Dann die Löcher ordentlich mit frischer Hefepaste füllen. Um die Larven auf die Testplatte zu übertragen, stellen Sie ein einfaches Werkzeug her.

Biege eine Kurve in die Spitze eines Plastik-Mikrospatels und tauche die Spitze in Hefepaste, damit sie an den Larven haftet. Nehmen Sie nun die ersten Larven des Stadiums einzeln auf und legen Sie sie auf die Agarplatte in der Nähe des Futterhügels. Für jede Versuchsgruppe sind mindestens fünf Platten mit je 10 Larven vorzubereiten.

Um eine Reproduzierbarkeit zwischen den Assay-Replikaten zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass nur 10 Larven auf jeder Assay-Platte platziert werden. Achten Sie darauf, die Testplatte sorgfältig zu überprüfen, um festzustellen, dass jedes Mal, wenn Sie eine Larve mit der Mikrospatelspitze abgeben, nur eine Larve übertragen wird. Sobald eine Platte beladen ist, beschriften Sie sie, decken Sie sie ab und legen Sie sie dann mit dem Deckel nach oben bei Raumtemperatur in die Dunkelheit.

Untersuchen Sie jeden Teller täglich, bis alle Larven abgestorben oder verpuppt sind. Im Folgenden finden Sie Beispiele für Platten für einen Wildtyp-Stamm für den zweiten bis achten Tag des Assays. Am zweiten Tag werden die Larven in der Nahrung vergraben und es findet kein Tunnelbau statt.

Der Tunnelbau beginnt am dritten Tag und erreicht sein Maximum zwischen dem fünften und achten Tag, wenn die Larven aufhören zu wandern und sich in ihren Tunneln verpuppen. Übertragen Sie die Puppen vorsichtig mit einer gebogenen Nadel auf eine Traubenplatte und zählen Sie, falls gewünscht, wie viele Puppen sich befinden. Achten Sie auf die Puppenbildung und untersuchen Sie die Puppen auf Anomalien.

Um die Tunnel in der Assay-Platte abzubilden, entnehmen und entsorgen Sie zunächst vorsichtig alle Hefenahrungen aus der zentralen Vertiefung jeder Platte. Fluten Sie dann jede Platte vorsichtig mit Leitungswasser und reiben Sie mit einem weichen Pinsel vorsichtig alle Rückstände ab, die sich auf der Agaroberfläche abgespielt haben. Einige Agarstücke können dort zerbröckeln, wo die Tunnelbildung am intensivsten ist.

Dies kann später korrigiert werden. Tauschen Sie das Wasser mehrmals aus und bürsten Sie den Schmutz vorsichtig ab, bis die Platte vollständig sauber ist. Spülen Sie die Platte dann ein letztes Mal mit entionisiertem Wasser ab, decken Sie sie ab und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Es ist wichtig, die Agarplatten mit einem sanften Wasserfluss und sanften Pinselstrichen zu reinigen, damit Sie keine Teile des Agargels abbrechen oder beschädigen. Bereiten Sie am nächsten Tag ein TIFF-Dateibild der Platte mit schwarzem Hintergrund vor, um die Tunnel als helle weiße Linien darzustellen. Gel-Dokumentationssysteme eignen sich gut für diesen Schritt.

Quantifizieren Sie dann die Tunnelbildung im Bild mit Bild J mit dem Werkzeug Oval, definieren Sie das Agar-Gel bis zum plastischen Rand der Petriplatte, aber nicht einschließlich. Wenden Sie dann einen automatischen Schwellenwert an, um ein umgekehrtes Bild der Platte zu erzeugen, sodass die Tunnel als schwarze Linien angezeigt werden. Um dunkle Bereiche zu korrigieren, die keine Tunnel enthalten, verwenden Sie die Farbauswahl und die Pinselwerkzeuge, um diese Bereiche auszubleichen.

Wählen Sie anschließend im Pulldown-Menü Analysieren die Option Skala festlegen aus, und klicken Sie auf , um die Skala zu entfernen. Gehen Sie dann zum Fenster Messungen einstellen unter Analysieren und aktivieren Sie Bereich und Grenzwert auf Schwellenwert. Drücken Sie nun die Strg-Taste mit der M-Taste, um eine Messung des schwarzen Bereichs im Bild in der Pixeleinheit zu erhalten, die den getunnelten Bereich darstellt.

Um den durch Agarerosion um das zentrale Loch verlorenen Tunnelbau zu quantifizieren, deaktivieren Sie die Option Auf Schwellenwert begrenzen. Verwenden Sie das Zauberstabwerkzeug, um das zentrale Loch zu definieren, und drücken Sie Strg plus M, um den Wert in Pixel zu messen. Subtrahieren Sie von diesem Wert den Pixelwert eines Lochs mit einem Durchmesser von 1,5 Zentimetern.

Addieren Sie die Differenz zum zuvor ermittelten Pixelwert, um den gesamten Pixelwert des Tunnelings zu erhalten. Bei Platten, bei denen der fehlende Agar über den zentralen Tunnelring hinausragt, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um zu verhindern, dass die Quantifizierung Bereiche außerhalb des zentralen Bereichs umfasst. Verwenden Sie die Werkzeuge Farbwähler und Pinsel, um einen schwarzen Balken hinzuzufügen, wie gezeigt, um den quantifizierten Bereich zu begrenzen.

Der beschriebene Assay wurde verwendet, um eine potentielle Hypoxie bei Larven mit eingeschränkter Funktion des nicht aufblasbaren Gens in den Luftröhren zu untersuchen. Das Gen wurde als RNAi über Gal4 UAS unterdrückt. Es wurden zwei Gal4-Leinen verwendet.

Atemloses Gal4, das sich durch die gesamte Entwicklung im gesamten Trachealsystem ausdrückt. Oder cut(ue)Gal4, das sich während des Larvenlebens in einem kleinen Trachealschnitt stark exprimiert. Die Kontrolllarven enthielten eine der Gal4-Linien, aber keine aufblasbare RNAi.

Larven mit cut(ue)Gal4, die nicht aufblasbare RNAi antreiben, waren während der gesamten Entwicklung sowohl in Bezug auf das Wachstum als auch auf das Verhalten nicht von Kontrollen zu unterscheiden. Die starke Unterdrückung von nicht aufblasbarer RNAi in der gesamten Luftröhre mit blt-Gal4 führte jedoch dazu, dass das Graben in der Fressphase nicht gegraben werden konnte und führte zu einer hohen Sterblichkeitsrate. Auch diese Larven zeigten während der Wanderphase ein völliges Fehlen von Tunnelbildung.

Darüber hinaus waren die atemlosen Gal4-Versuchslarven kleiner, dünner und träger als die Kontrollen und blieben noch lange nach der Verpuppung aller anderen Gruppen als Larven erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Drosophila-Larven auf Gewebehypoxie testen können, indem Sie überwachen, inwieweit sie sich in ihre Nahrungshügel eingraben oder in ein weiches Substrat eindringen. Das völlige Fehlen von Tunnelbildung ist ein starker Indikator für eine Hypoxie des Gewebes.