Name: Dreidimensionale entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Rekonstruktion eines dreidimensionalen entzündlichen Gingiva-Gewebemodells mit drei menschlichen Zelltypen in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Wundheilung, Geweberegeneration und Entzündung bei parodontalen Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde zum Teil von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (26861689 und 17 K 11813) unterstützt. Die Autoren möchte Herr Nathaniel Green für das Korrekturlesen zu danken.

Dieses Protokoll soll menschliche Gingiva-Äquivalente, gingival Wunde Modelle und Gingivitis-Modelle zu erstellen. Menschliche Haut epidermalen Keratinozyten (HaCaT) wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Professor Norbert E. Fusenig Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Deutschland)7. Menschliche gingivale Fibroblasten (HGFs) waren von gingival Gewebe gemäß den zuvor veröffentlichten Protokolle8isoliert. Einwilligung war vorher, und die Studie wurde nach den Richtlinien der Ausschuss Ethik, die Nippon Dental University School of Life Dentistry in Tokio zugelassen (Zulassungsnummer: NDU-T2012-35). Protokoll-Schritte 1 – 3 sollte in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden.
1. Vorbereitung des 3D menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (GTE) (Abbildung 1A)
<ol><li>MEM-Alpha und 10 % Wiederaufbau Puffer Mix Kollagen Typ-A-Gel mit 10 % konzentriert (2,2 g Nahco33 und 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) in einem 15 mL steriles Röhrchen durch pipettieren. Halten Sie die gemischten Kollagen-Lösung auf Eis bis verwendet.</li>
	<li>24-Well-Kultur-Einsätze (Pore Größe 3,0 µm) in einer 24-Well-Platte zu platzieren.</li>
	<li>
HGFs von der Kultur-Oberfläche mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung entfernen. Aussetzen der Zellen in 10 mL Kulturmedium A (MEM-Alpha + 20 % FBS + 1 % GlutaMAX). Zählen der Zellen durch einen Bürker-Türk-Zelle-Zähler.
	<ol>
<li>Extrahieren Sie die gewünschte Menge an Zellen (1-5 X105 Zellen/mL), dann 4 Minuten bei 190 X g zentrifugieren.</li>
		<li>Unterbrechen Sie die Zellen in der gemischten Kollagen-Lösung. Halten Sie die Mischung auf dem Eis erst im nächsten Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 mL der Zelle-Kollagen-Mischung (0,5 – 2,5 x 105 Zellen/gut) in der Kultur einfügen ohne Bläschen zu produzieren. Inkubieren Sie die Mischung für 10-30 min in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 ° C zu gerinnen die Mischung in ein Gel. Hinweis: Fügen Sie die Kollagen-Mischung in die Mitte der Kultur einfügen ungleiche Bildung von Kollagen Gel zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in den Brunnen und 0,5 mL in den Einsatz. Inkubation der Kultur-Platte für 24 h oder über Nacht in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie HaCaT-Zellen von der Kultur-Oberfläche mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung. Die Zellen in 10 mL Medium B auszusetzen (DMEM + 10 % FBS + 1 % GlutaMAX) und die Zellen zu zählen. Extrakt die benötigte Menge von Zellen (1 – 5 x 105 Zellen/mL) mit einer Pipette, Zentrifuge für 4 min bei 190 X g. auszusetzen, die Zellen in der mittleren B.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium aus der Kultur-Einsätzen, die durch Absaugen die HGF-Kollagen-Mischung enthalten. 0,5 mL HaCaT Zellsuspension (0,5 – 2,5 x 105 Zellen/Brunnen) auf der Oberseite der HGF-Kollagen-Mischung zugeben. Inkubation der Kulturen für 24 Stunden oder über Nacht. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollte das Medium in der Kultur gut mittlere A, werden während des Mediums in der Kultur einfügen sollte mittlere B.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium mit KSR Medium (Co Kulturmedium) (MEM-Alpha + 15 % Ko-Serum Ersatz + 1 % GlutaMAX) + 5 % FBS. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in die Kultur gut und 0,5 mL in der Kultur einfügen. Inkubation der Kulturen für 24 – 48 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium mit KSR Medium + 1 % FBS. Fügen Sie 1 mL in die Kultur gut und 0,5 mL in der Kultur einfügen. Inkubation der Kulturen für 24 Stunden oder über Nacht.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Kulturmedium in der Kultur gut mit 0,7 – 1 mL KSR Medium. Entfernen Sie das Medium vollständig aus dem Kultur einfügen (Kultur-Oberfläche sollte Luft ausgesetzt werden). 1 – 2 Wochen inkubieren Sie der Kulturen. Ändern Sie das Medium in der Kultur auch zwei Mal pro Woche. Hinweis: Lassen Sie nicht die mittlere Ebene steigen über der Kultur-Oberfläche (die oberste Schicht aus Keratinozyten). Immer halten Sie die Kultur Oberfläche trocken.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Verwundeten GTE (Abbildung 1 b)
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 – 3 mm Durchmesser Gewebe Puncher. Mit einem Autoklaven bei 121 ° C für 20 min zu sterilisieren.</li>
	<li>Der Gewebe-Puncher senkrecht in GTE über 300 µm Tiefe schieben, und ein Loch in das Gewebe um eine Wunde zu simulieren.</li>
	<li>Verwenden Sie in diesem Schritt die Verwundeten GTE für die Untersuchung von Wunde heilen und Geweberegeneration. Alternativ zu beheben GTE mit 10 % Formalin neutraler Pufferlösung histologische Analysen durchzuführen.</li>
</ol>3. Vorbereitung des entzündlichen GTE (iGTE) (Abbildung 1 b)
<ol><li>THP-1-Zellen nach dem vorherigen Bericht9zu kultivieren.</li>
	<li>Mix Kollagen Typ-A-Gel mit 10 % konzentriert RPMI 1640, 10 % Wiederaufbau Puffer (2,2 g Nahco33 und 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) und 10 ng/mL PMA. Halten Sie die gemischten Kollagen-Lösung auf dem Eis bis zur Verwendung.</li>
	<li>Anzahl 1 – 2 x 106 THP-1 Zellen und Zentrifuge für 4 min bei 190 X g. aussetzen der Zellen in 1 mL der Lösung gemischt Kollagen. Halten Sie die Mischung auf dem Eis erst im nächsten Schritt.</li>
	<li>Fügen Sie 10 – 30 µL THP-1-Kollagen Mischung in den verletzten Bereich der GTE. Ersetzen Sie das Kulturmedium 0,7 – 1 mL KSR 10 ng/mL von PMA-haltigem Medium.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 ° C für 72 h.</li>
	<li>Verwenden Sie das Modell für die Untersuchung von Gingivitis oder Parodontitis (z. B. hinzufügen potenzielle entzündungshemmendes Medikament iGTE zu sehen, seine Auswirkungen auf die Cytokine Release10). Alternativ lassen Sie 72 h PMA-Behandlung Weg, fügen Sie 2 µg/mL LPs in die Kultur hinzu und inkubieren Sie das Gewebe in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 ° C für 48 h11,12.</li>
</ol>4. Fixierung und ganze montieren Immunostaining GTE und iGTE Kulturen
<ol><li>
Fixierung der Kulturen.
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus 24-Well-Platte. Waschen Sie das Gewebe 2 Mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Die Kultur gut 1 mL 10 % Formalin neutraler Pufferlösung, die Einlage und 1 mL hinzufügen. Lassen Sie die 24-Well-Platte über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie die 10 % Formalin neutraler Pufferlösung am folgenden Tag.</li>
		<li>Waschen Sie für ganze Berg Immunostaining Gewebe 3-4 Mal mit PBS nach der Fixierung.</li>
		<li>Gehen Sie für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und regelmäßige Immunostaining mit Austrocknung, Paraffin einbetten und schneiden. Hinweis: Für ganze Berg Immunostaining kann dieser Schritt entfallen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ganzen Berg immunostaining Hinweis: Dieses Protokoll wurde von der Referenz 13 geändert.<ol>
<li>Waschen Sie das Gewebe 3 X in PBS 0,5 – 1 % Triton, 10-30 min jedes Mal.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gewebe zweimal für 30 min in blocking-Puffer (PBS 1 % Triton + 10 % BSA), bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Waschen Sie das Gewebe 2 × in blockierende Puffer, 5 – 10 Minuten jedes Mal.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL Primärantikörper Lösung am erforderlichen Verdünnung/Konzentration auf die Einsätze. Verwenden Sie eine dünne Kunststoff Frischhaltefolie wickeln die Einsätze um Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gewebe für 1 bis 2 Tage bei 4 ° c</li>
		<li>Waschen Sie das Gewebe 3 Mal für 30 min in PBS 1 % Triton + 10 % BSA. Waschen wieder 3 Mal für 5 min in PBS 1 % Triton.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL Sekundärantikörper in blocking-Puffer (PBS 1 % Triton + 10 % BSA) und 5 µL Hoechst 33342 Lösung (NucBlue Live Cell Fleck) für jeden Einsatz. Verwenden Sie eine dünne Kunststoff Frischhaltefolie wickeln die Einsätze um Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.</li>
		<li>1 bis 2 Tage bei 4 ° c inkubieren Wickeln Sie die 24-Well-Platte in einem feuchten Papiertuch, und steckte sie dann in ein Kunststoff-Pack im gesamten Inkubation verwendet werden.</li>
		<li>Waschen Sie das Gewebe 3 Mal für 10 min in PBS 1 % triton</li>
		<li>Verwenden einer spitzen Nadel, schneiden Sie die Membran von der Kultur einfügen, um das Gewebe zu erhalten. Platzieren Sie die Membran auf einer Folie. Hinweis: Das Gewebe sollte auf der Membran.</li>
		<li>Fügen Sie 2 – 3 Tropfen Fluoreszenz Mount Medium. Decken Sie das Gewebe mit einem Deckglas und Speicher bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Analyse.</li>
		<li>Zeigen Sie Gewebe mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie (LSM an).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
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<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
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<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
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<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Dieses Protokoll basiert auf Methoden der Schaffung von Gingiva-äquivalente und Subkutane Fettgewebe Äquivalente von vorherigen Berichte8,21,22beschrieben. Obwohl dies eine einfache und einfache Methode, erfordern einige Schritte besondere Aufmerksamkeit. Beispielsweise sollte die Kollagen-Mischung auf dem Eis bis zur Verwendung, Gelbildung in der Lösung zu vermeiden gehalten werden. Wenn die Kollagen-Mischung in das Kultur einf...

Parodontale Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Zahnverlust bei Erwachsenen. Gingivitis und Parodontitis sind die häufigsten parodontalen Erkrankungen. Die beiden präsentieren Biofilm-vermittelten akute oder chronische entzündliche Veränderungen im Zahnfleisch. Gingivitis ist geprägt von akuten Entzündungen, während Parodontitis in der Regel als chronische Entzündung präsentiert. Bei der histologischen Ebene ausgelöst bakterielle Komponenten die Aktivierung von Immunzellen, wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen und Mastzellen1,2. Diese Immunzellen, vor allem Makrophagen, interagieren mit lokalen Zellen (einschließlich Zahnfleisch Epithelzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Osteoblasten) wodurch entzündliche Läsionen im parodontalen Gewebe3,4. Experimentelle Modelle der Parodontalerkrankungen wurden in verschiedene Arten von Tieren, wie Ratten, Hamster, Kaninchen, Frettchen, Eckzähne und Primaten. Die Physiopathologie von Tiermodellen ist jedoch anders als die des Menschen, macht es schwierig, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren und bewerten neue Medikamente von Parodontalerkrankungen5. Co-Kultur von parodontale Bakterien und menschlichen mündliche Epithelzellen Monolage wurde verwendet, zu untersuchen, den Mechanismus der parodontalen Infektionen6. Dennoch fehlt Monolayer-Kulturen der mündlichen Zellen die dreidimensionale (3D) zelluläre Architektur von intaktem Gewebe; Daher können nicht sie die in-vitro- Situation imitieren.
Hier sind 3D entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (iGTE) gegründet, um parodontale Erkrankungen in Vitrodarstellen. Das 3D-Modell der Parodontalerkrankungen nimmt eine Zwischenstellung zwischen Monolage Zellkulturen und Tiermodellen. Drei Arten von menschlichen Zellen, einschließlich HaCaT Keratinozyten, gingival Fibroblasten und Makrophagen THP-1, sind Co auf Kollagen Gel angebaut und durch entzündliche Initiatoren iGTE bauen stimuliert. IGTE simuliert eng die in-Vivo -Bedingungen der Zelldifferenzierung, Zell-Zell-Interaktion und Makrophagen Aktivierung im Zahnfleisch. Dieses Modell hat viele Einsatzmöglichkeiten für Drug screening und testen neue pharmakologische Ansätze bei parodontalen Erkrankungen sowie zur Analyse von zellulärer und molekularer Mechanismen in der Wundheilung, Entzündung und Regeneration des Gewebes.

<table><tbody><tr><td>Kollagen Typ I-A</td><td>Nitta Gelatine Inc</td><td></td><td>Zur Herstellung von Dermis aus GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Zellkultureinsatz (für 24-Well-Platte), Porengröße 3,0 &mu; m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>Für Gewebekultur</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Zellkulturreagenz</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Zellkulturreagenz Gewebelocher</td></tr><tr><td></td><td>Shibata System Service Co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Für Stanzen von Löchern in GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell Stain)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Für die Markierung von Zellkernen</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td></td><td>Zum Einbetten von Proben nach der Immunfärbung</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 8+18 Antikörper [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Zur Identifizierung von Epithel</td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Zur Beobachtung der Oberflächentopographie und -zusammensetzung von Proben:</td></tr><tr><td>Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie</td><td>LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>Zur Beobachtung der Immunfluoreszenzfärbung von Proben</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>Zur Identifizierung von Epithel</td></tr><tr><td>Anti-vimentin Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Zur Identifizierung von Fibroblasten und aktivierten Makrophagen</td></tr><tr><td>Anti-TE-7 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Zur Identifizierung von Fibroblasten in der Dermis</td></tr><tr><td>Anti-CD68 Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>Zur Identifizierung von Makrophagen</td></tr><tr><td>Humane CD14-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Zur Identifizierung von Makrophagen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-konjugierter sekundärer Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierter sekundärer Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Für Immunfluoreszenz-Färbung</td></tr><tr><td>EVOS FL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Zur Beobachtung der Immunfluoreszenzfärbung der</td></tr><tr><td>Probe THP-1-Zellen</td><td>Riken BRC-Zellbank</td><td>RCB1189</td><td>Zur Herstellung von iGTE</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristat 13-acetat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Zur Differenzierung von THP-1-Zellen</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale entzündliche menschliches gewebe Äquivalente der gingiva

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Parodontale Erkrankungen (z.B. Gingivitis, Parodontitis) sind die führenden Ursachen für Zahnverlust bei Erwachsenen. Entzündung im Zahnfleisch ist die grundlegende physiopathologie der Parodontalerkrankungen. Aktuelle experimentelle Modelle der Parodontalerkrankungen entstanden in verschiedenen Arten von Tieren. Die Physiopathologie von Tiermodellen ist jedoch anders als die des Menschen, macht es schwierig, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren und bewerten neue Medikamente für parodontale Erkrankungen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Rekonstruktion von entzündlichen Gewebe Entsprechungen des Zahnfleisches (iGTE) in Vitro. Wir erstellen zunächst menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (GTE) durch die Verwendung von zwei Arten von menschlichen Zellen, einschließlich menschliche gingival Fibroblasten (HGF) und menschliche Haut epidermalen Keratinozyten (HaCaT), dreidimensionale Bedingungen. Wir erstellen eine Wunde Modell mithilfe eine Gewebe Puncher, ein Loch in der GTE Punsch. Nächste, menschliche THP-1 Monozyten mit Kollagen Gel gemischt werden in das Loch in der GTE injiziert. Durch Adimistration von 10 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) für 72 h, THP-1-Zellen unterschieden in Makrophagen in Form entzündlicher Herde in GTE (iGTE) (IGTE auch kann sein Stumilated mit 2 µg/mL von Lipopolysacchariden (LPS) für 48 h, Entzündung zu initiieren ). IGTE ist das erste in-vitro- Modell der entzündlichen Gingiva mit menschlichen Zellen mit einer dreidimensionalen Architektur. IGTE spiegelt die wichtigsten pathologische Veränderungen (Immunzellen Activition, intrazellulären Interaktionen zwischen Fibryoblasts, Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen) in parodontale Erkrankungen. GTE, Verwundeten GTE und iGTE dient als vielseitige Werkzeuge, um die Wundheilung zu studieren, Geweberegeneration, Entzündungen, Zell-Zell-Interaktion und Bildschirm mögliche Medikamente für parodontale Erkrankungen.

HaCaT-Zellen angezeigt typische Keratinozyten Morphologie unter Phasenkontrast-mikroskopische Beobachtung (Abbildung 2A). Scanner Elektron mikroskopische (SEM) Bilder zeigten, dass viele Mikrovilli HaCaT Zelloberflächen abgedeckt wurden. Interzelluläre Verbindungen zwischen HaCaT-Zellen wurden durch Membranverfahren (Abb. 2 b) vermittelt. HaCaT-Zellen ausgedrückt gingivalen Epithel Marker K8/1814, darauf h...

Das Ziel des Protokolls ist eine entzündliche menschlichen Gingiva Modell in Vitrozu bauen. Dieses Gewebe Modell pflegt Co drei Arten von menschlichen Zellen, HaCaT Keratinozyten, gingival Fibroblasten und THP-1 Makrophagen, dreidimensionalen Bedingungen. Dieses Modell kann angewendet werden, für die Untersuchung von parodontaler Erkrankungen wie Gingivitis und Parodontitis.

Dreidimensionale entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein 3D-Modell von entzündlichem Gingivagewebe zu rekonstruieren, indem drei Arten von menschlichen Zellen in vitro verwendet werden. Diese Methode kann helfen, die Wundheilung, die Geweberegeneration und Entzündungen zu untersuchen und potenzielle Medikamente für Parodontalerkrankungen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dies die erste Methode ist, mit der ein In-vitro-Modell der entzündlichen Gingiva unter Verwendung menschlicher Zellen mit einer dreidimensionalen Architektur erstellt werden kann.In ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen fügen Sie Kollagen Typ I-A, 10 % konzentriertes MEM-alpha und 10 % Rekonstruktionspuffer hinzu. Lassen Sie die Kollagenmischung dann bis zur nächsten Anwendung auf Eis. Positionieren Sie anschließend die 24-Well-Kultureinsätze mit einer Porengröße von drei Mikrometern in einer 24-Well-Kulturplatte.Verwenden Sie dann eine 25%ige Trypsin-EDTA-Lösung, um die HGFs vom Kulturkolben zu lösen. Als nächstes suspendieren Sie die abgelösten Zellen in 10 Millilitern Kulturmedium. Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem Burker-Turk-Zellzähler.Nachdem Sie die gewünschte Zellzahl isoliert haben, zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 190-mal g. Suspendieren Sie dann das Zellpellet mit der Kollagenlösung und lassen Sie das Röhrchen auf Eis. Geben Sie anschließend 5 Milliliter Zell-Kollagen-Gemisch in den Kultureinsatz, ohne dass Luftblasen entstehen.Inkubieren Sie dann den Kultureinsatz mit dem Zell-Kollagen-Gemisch bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 10 bis 30 Minuten. Geben Sie nach der Inkubation einen Milliliter des Nährmediums in die Vertiefung und 5 Milliliter des Mediums in den Einsatz. Inkubieren Sie dann die Kulturplatte einen Tag lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Verwenden Sie anschließend 25 % Trypsin-EDTA-Lösung, um die HaCaT-Zellen von der Kulturplatte zu lösen. Sobald die Zellen abgelöst sind, geben Sie 10 Milliliter Medium B zu den Zellen. Zählen Sie dann die Handynummer.Nachdem Sie die gewünschte Zellzahl isoliert haben, zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 190-mal g. Lösen Sie nach der Zentrifugation das Zellpellet in Medium B auf. Saugen Sie anschließend das Medium aus dem Kultureinsatz an. Geben Sie dann 5 Milliliter HaCaT-Zellsuspension über die HGF-Kollagen-Mischung.Lassen Sie den Kultureinsatz einen Tag lang im Inkubator. Tauschen Sie am nächsten Tag das Nährmedium aus. Geben Sie einen Milliliter KSR-Medium aus Co-Kultur, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum, in die Kulturvertiefung und 5 Milliliter in den Kultureinsatz.Inkubieren Sie dann die Kulturplatte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium durch Co-Kultur-KSR-Medium, das mit 1 % fötalem Rinderserum ergänzt wird. Entfernen Sie nach 24 Stunden das gesamte Kulturmedium sowohl aus dem Kultureinsatz als auch aus der Kultur.Geben Sie dann frische 7 bis 1 Milliliter KSR-Medium nur in die Kulturvertiefung und kultivieren Sie zwei Wochen lang. Denken Sie daran, das Medium in der Kulturmulde zweimal pro Woche zu wechseln. Bereiten Sie einen Gewebelocher mit einem Durchmesser von ein bis drei Millimetern vor und sterilisieren Sie den Locher im Autoklaven bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten.Schieben Sie den Gewebestanzer nach dem Sterilisieren etwa 30 Mikrometer tief senkrecht in GTE, um eine Wunde im Gewebe zu erzeugen. Mischen Sie anschließend 10 Nanogramm pro Milliliter PMA, 10 % Rekonstruktionspuffer und 10 % konzentriertes RPMI-Medium mit Kollagen Typ I-A Gel. Lassen Sie die Kollagenmischung dann bis zum nächsten Gebrauch auf Eis.Zentrifugieren Sie anschließend die THP-1-Zellen vier Minuten lang bei 190 mal g. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in einem Milliliter Kollagenlösung suspendieren und auf Eis belassen. Geben Sie dann 10 bis 30 Mikroliter des THP-1-Zell-Kollagen-Gemisches in den verwundeten Bereich des GTE.Ersetzen Sie anschließend das Nährmedium durch 7 bis einen Milliliter KSR-Medium, das 10 Nanogramm pro Milliliter PMA enthält. Inkubieren Sie die Mischung dann 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid. Zur Charakterisierung der rekonstruierten GTE werden H- und E-Färbungen sowie Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt.Die Bilder zeigen GTE in einer gingivaähnlichen Gewebestruktur mit mehreren Schichten aus Epithel und Lamina propria. Die Bilder zeigen auch, dass die HGF-Zellen in den rekonstruierten GTEs unterschiedliche morphologische Merkmale von Fibroblasten aufweisen, die von Kollagenfasern umgeben sind. Anschließend wird eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die Expression von Haut- und Epithelmarkern zu untersuchen.Damit soll validiert werden, ob GTE und iGTE die molekularen Merkmale der echten entzündlichen menschlichen Gingiva aufweisen. Die Bilder zeigen, dass Vimentin und TE-7 stark in der Lamina propria von GTE vorhanden sind. K19, ein spezifischer Marker für das junktionale Epithel bei Parodontitis, exprimiert zwar schwach im GTE-Epithel, ist aber im iGTE-Epithel stark genug.Um die Entzündungsherde in iGTE zu erzeugen, werden schließlich PMA-behandelte THP-1-Monozyten in den verwundeten Bereich des Gewebes injiziert. 72 Stunden nach der PMA-Behandlung werden THP-1-Zellen zu Makrophagen-ähnlichen Zellen differenziert. Die Immunfärbung durch Whole-Mount-Immunfärbung bestätigte, dass diese Zellen zwei wichtige Makrophagenmarker, CD14 und Vimentin, exprimieren und die Entzündungsherde bilden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Kontamination zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Verwendung von LPS zur Stimulierung von Entzündungsreaktionen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie Entzündungen durch die Wirt-Biofilm-Wechselwirkungen induziert werden können.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entzündung, Geweberegeneration und Wundheilung, um den zellulären und molekularen Mechanismus zu erforschen und potenzielle Medikamente für Parodontalerkrankungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein 3D-Modell für entzündliches Zahnfleischgewebe in vitro erstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Diese Studie beschreibt ein effizientes Verfahren zur Isolation und Behandlung Gingiva von der Maus Mundhöhle, um eine Einzelzellen-Kultur zu erzeugen. Die resultierenden Zellen können weiter für die Durchflusszytometrie und molekulare Studien eingesetzt werden.

Isolation, Verarbeitung und Analyse von Murine Gingivazellen

Methoden, um menschliche 3D-Tumorgewebe als Testsysteme zu erstellen beschrieben. Diese Techniken basieren auf einer dezellularisierten Biologische Vaskularisierte Gerüst (BioVaSc), primäre menschliche Zellen und einer Tumor-Zellinie, die unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen in einer Strömungs Bioreaktor kultiviert werden können, basieren.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

Wir haben ein Verfahren zur Isolierung, phänotypische Charakterisierung und funktionelle Analyse von Immunzellen aus murinen Gingiva etabliert.

Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Diese Studie führt ein Protokoll zur Messung der Mikrozirkulation in menschlichen Mundschleimhaut durch Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung. Die Überwachung der Wundheilung nach Vestibulumplastik kombiniert mit einem xenogenen Kollagen Graft auf ein klinischer Fall zur Geltung kommt.

Ein neuer Ansatz zur Überwachung Graft Neovaskularisation in der menschlichen Gingiva

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine dynamische Kokultur von menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten in röhrenförmigen elektrogesponnenen Gerüsten durchzuführen, um die materialgetriebene Geweberegeneration mit einem Bioreaktor zu untersuchen, der die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht.

Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Anwendung organotypischer Gewebemodelle zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro. Konkret verwendet das beschriebene Modellsystem ein mehrschichtiges orales Epithel, das Mikroorganismen ausgesetzt ist, die mit Biofilmen (Zahnbelag) im Zusammenhang mit Mundgesundheit versus -erkrankung assoziiert sind.

Organotypische Gewebemodellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro

Erfahren Sie die Rekonstruktion eines dreidimensionalen entzündlichen Gingiva-Gewebemodells mit drei menschlichen Zelltypen in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Wundheilung, Geweberegeneration und Entzündung bei parodontalen Erkrankungen.

Dreidimensionale entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva

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