Name: Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Lernen Sie die Inseltransplantation ins Omentum bei diabetischen Mäusen. Diese Methode kombiniert isolierte Inseln mit Hydrogel zur Verbesserung der Überlebensrate und Funktion. Sie ermöglicht Forschern, neue Therapien für Diabetes Typ I zu entwickeln.

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Einige der Autoren dieser Arbeit wurden zum Teil durch Zuschüsse aus nationalen Schlüssel R & D Program of China (2017YFC1103704), Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds für High Level medizinische Disziplin Bau von Shenzhen (2016031638), unterstützt Shenzhen-Stiftung für Wissenschaft und Technologie (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Stiftung Gesundheit und Familienplanung-Kommission (SZXJ2017021).

Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden von der medizinischen Animal Center der Guangdong Provinz erhalten. Die Verwendung von Tieren wurde von der Ethik Review Committee der Shenzhen zweiten Volks Krankenhaus, nach den Grundsätzen des Tierschutzes genehmigt.
(1) Inselversetzung, das Omentum
Hinweis: Dieses Protokoll erfordert 2 Personen zu erreichen.
<ol><li>Montieren Sie chirurgische Materialien, die in Tabelle 1aufgeführt sind. Bereiten Sie aseptischen Bereich im OP-Bereich mit sterilen Materialien wie Vorhänge und Einwegartikel und erhalten Sie aseptische Bedingungen in der gesamten Operation zu. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente. Sterile Kleider zu tragen.</li>
	<li>Wählen Sie die Inseln mit einer 200 µL Pipettenspitze unter dem Stereomikroskop. Jede Maus erhalten 450 – 500 Islet Äquivalent (IEQ) pro Tansplant. Für jedes Tier Platz genug Inselchen für eine einzelne Transplantation in ein steriles 1,5 mL Snap-Top Rohr mit 100 µL CMRL-1066 Medium. Hinweis: Inselchen können am Tag der Transplantation isoliert werden, aber es ist besser, sie am Vortag zu isolieren, um Wiederherstellung für die Isolierung Prozess ermöglichen.</li>
	<li>Halten Sie die Snap-Top-Rohre mit kleinen Inseln auf dem Eis bis zu verpflanzen.</li>
	<li>Tauen Sie der Basalmembran Matrix Hydrogel auf und halten sie auf dem Eis nach Herausnahme aus der Tiefkühltruhe-20 ° C. Das Hydrogel ist bei 4 ° C bis 10 ° C flüssig und erstarrt bei höheren Temperaturen.</li>
	<li>Wiegen Sie und Etikettieren Sie aller diabetische Mäusen Empfänger. 60 mg/kg Pentobarbital-Natrium intraperitoneale Injektion. Test der die Tiefe der Narkose durch die Verabreichung einer Zehe-Klemme. Geben Sie eine zusätzliche 10 mg/kg-Pentobarbital-Natrium, reagiert das Tier auf die Prise. Wenn es gibt keine zurückziehen Reflex, das Niveau der Anästhesie ist korrekt für die Chirurgie.</li>
	<li>Tupfer der Operationsstelle auf dem Bauch mit 70 % Ethanol. Rasieren Sie die Haare von der Website mit einer Razer Blade und desinfizieren Sie den Bereich mit Jodophor. Verwalten Sie Tierarzt Salbe für die Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.</li>
	<li>Verwenden Sie die ophthalmologische Schere um den Bauch entlang der Mittellinie des Bauches durch einen Schnitt von 4 bis 5 cm. Bewegung öffnen den Darm auf die linke Seite und decken mit Kochsalzlösung getränkten Gaze, übermäßige Austrocknung bei der Operation zu verhindern.</li>
	<li>Können Sie Wattestäbchen vollständig aussetzen das Gesichtsfeld des Magens und lokalisieren das Omentum (befindet sich unterhalb des Magens). Verwenden Sie zwei Paare von feinen Pinzette um das Omentum ausdehnen. Achten Sie darauf, um Beschädigungen durch reißen zu vermeiden.</li>
	<li>Das Hydrogel ist zu diesem Zeitpunkt vollständig aufgetaut. Drehen Sie das Rohr mit den Inselchen für 30 s bei 200 x g und Entfernen der Überstand. Aspirieren Sie 50 µL Hydrogel, das Röhrchen mit den kleinen Inseln hinzu, und Aufschwemmen Sie die Mischung sanft Vermeidung von Blasenbildung. Halten Sie die Rohre auf dem Eis während des Verfahrens.</li>
	<li>Verwenden Sie zwei Paare der Zange zu holen die Kanten der Omentum und sanft heben Sie es zum bilden einer Furche zwischen den Magen Wand und Darm, die eine kleine Menge Flüssigkeit mit der Islet Transplantation aufnehmen können.</li>
	<li>Lassen Sie die zweite Person in das Verfahren zu unterstützen und aspirieren Sie die resuspendierte Insel-Hydrogel-Mischung (der gesamte Inhalt des Röhrchens) mit einer Pipettenspitze 200 µL, liefern Sie die Inhalte in die Nut.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Mischung in die Nut gut aufgestellt ist, durch sanft anheben oder Absenken der Kanten der Omentum. Komplette Positionierung der Mischung innerhalb von 3 Minuten vor dem Hydrogel erstarrt als Effekt der Körpertemperatur. Wenn das Hydrogel untergegangen ist, Falten Sie das Omentum um das Transplantat zu decken. Hinweis: das Omentum haften an der umgebenden Magen Wand wie Hydrogel erstarrt.</li>
	<li>Nachdem das Hydrogel völlig erstarrt ist, verwenden Sie Wattestäbchen, um den Darm wieder in die Bauchhöhle, kümmert sich um die Website der Transplantation nicht berühren neu zu positionieren.</li>
	<li>20 µL der Cephalosporin hinzufügen (5 ~ 10 mg) in der Bauchhöhle um Infektionen zu vermeiden, verwenden Sie dann 4: 0 Naht um den Bauch zu schließen.</li>
	<li>Die Maus in seinen Käfig zurück und wiederholen Sie alle Schritte für jede Maus-Empfänger. Halten Sie die Mäuse warm und überwachen Sie visuell zu, bis sie voll und ganz ausreichend Bewusstsein um sternalen liegen beizubehalten wiederhergestellt. Bewahren Sie die Mäuse von anderen Tieren getrennt auf, bis sie sich vollständig erholt haben.</li>
	<li>Injizieren Sie 50 µL Cefazolin Natrium (0,05 mg/mL) pro Tag für eine Woche als postoperative Prophylaxe. Bupivicaine + Buprenorphin zu verwalten, d. h. gelten 1-3 Tropfen von 0,25 % Bupivicaine an der Schnitt Stelle topisch vor Platzierung der Wunde Clips. Verwalten Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) über die intraperitoneal (IP)-Route.</li>
	<li>-Fasten Blutzuckerspiegel aus einer Rute-Vein Blutprobe mit einem Blutzuckermessgerät Messen einmal am Tag nach der Transplantation. Beim Umpflanzen, das Omentum, kann die Islet Transplantation haben eine verzögerte Funktion und ein ganz normaler Blutzuckerspiegel für 2 – 3 Wochen nicht zu erreichen.</li>
	<li>Entfernen Sie für Histologie das omentalis Transplantat von der Maus am Ende des Experiments nach der Transplantation. Befestigen Sie das Gewebe nach der histologischen Protokolle. Das Transplantat kann für Immunostaining oder Immunfluoreszenz Studien analysiert werden.</li>
</ol>2. alternative Methode für die Transplantation, das Omentum
Hinweis: Eine alternative Fibrin-Thrombin-Hydrogel, die bei Raumtemperatur verwendet wird kann die Basalmembran Matrix Hydrogel ersetzt werden. Es besteht aus 2 Komponenten, einem Fibrin Sealer Proteinlösung (50 U/mL Thrombin und 10 mg/mL Fibrinogen). Wenn die Komponenten vermischt sind, bilden sie ein Blutgerinnsel, das die kleinen Inseln an Ihrem Platz hält.
<ol><li>Verwenden Sie das Fibrin-Thombin Hydrogel zusammengesetzte bei Raumtemperatur. Wie in Schritt 1.2 erhält jede Maus 450 – 500 Inselchen Äquivalente (IEQ) / Transplantation. Legen Sie die kleinen Inseln in einem sterilen 1,5 mL Snap-Top-Rohr mit 100 µL CMRL-1066 Medium. Unmittelbar vor der Transplantation, aspirieren Sie die kleinen Inseln in einer sterilen PE50 Schläuche für eine Länge von 10 cm und sanft Zentrifugieren (30 s bei 200 X g), eine lose Pellets zu bilden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Tier, wie oben (Schritte 1,5-1,8) mit dem Omentum ausgebreitet. Mischen Sie die Hydrogel-Komponenten (10 µL/Stück) und auf das Omentum. (Abbildung 3D)</li>
	<li>Die Inseln von den Schlauch auf das Hydrogel sofort zu vertreiben. Das Hydrogel bildet ein Gerinnsel um die Inseln. (Abbildung 3E)</li>
	<li>Umklappen Sie das Omentum, Hydrogel und Inselchen, einen Beutel zu bilden. (Abbildung 3F) Führen Sie Schritte 1.13 auf 1.18.</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+research+and+clinical+practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+Induction+Immunotherapy+Promotes+Long-Term+Insulin+Independence+After+Islet+Transplantation+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes.</a> American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+to+improve+islets+of+Langerhans+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
<li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%3A+recent+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+metabolic+syndrome+and+obesity%3A+targets+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).</li>
<li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27834384">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Cantarelli, E., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+transplantation+sites+for+pancreatic+islet+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts.</a> Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).</li>
<li>Cantarelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+for+preclinical+islet+transplantation%3A+no+model+fits+all+%28research+purposes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes).</a> Islets. 5 (2), 79-86 (2013).</li>
<li>Beli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum+to%3A+CX3CR1+deficiency+accelerates+the+development+of+retinopathy+in+a+rodent+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes.</a> J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).</li>
<li>Hafner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Patterns+of+Retinal+Oxygen+Saturation+and+Microvascular+Hemodynamic+Parameters+Preceding+Retinopathy+in+Patients+With+Type+II+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).</li>
<li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).</li>
<li>Voigt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Progression+Rate+of+Diabetic+Retinopathy+in+Type+2+Diabetes+Patients+in+Correlation+with+the+Duration+of+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).</li>
<li>Baidal, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+of+an+Intraabdominal+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas.</a> New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. , (2016).</li>
<li>Berman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+endocrine+pancreas%3A+intraomental+islet+transplantation+within+a+biologic+resorbable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold.</a> Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28109023">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment.</a> Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).</li>
<li>Hajizadeh-Saffar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+VEGF+expression+by+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+stromal+cells+reduces+the+minimal+islet+mass+required+to+reverse+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
</ol>

Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte.

Inselversetzung in die Leber über die Pfortader ist die am häufigsten verwendete Methode der Inselversetzung beim Menschen, aber es gibt noch Effizienz und Sicherheitsbedenken wie Portalader Thrombosis und Leber Steatose17. Neuere Studien zeigen, dass das Omentum eine geeignete Alternative zu der Leber, aber muss noch mehr Forschung vor der Übersetzung klinischer12,14,18,19</s...

Laut der International Diabetes Federation (IDF) betrifft Diabetes Mellitus derzeit 382 Millionen Menschen mit einer projizierten Anstieg auf 592 Millionen Menschen durch 2035-1. In beiden allogene und xenogene Inselversetzung ist systemischer immunsuppressive Therapie notwendig. Ohne Immunsuppression ist Immunabwehr eine der Hauptursachen des Transplantats Verlust2. Auch gibt es ein erhebliches Problem der transplantierten Inselchen Verlust aufgrund der sofortigen Blut vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR)3,4. Aber auch in Abwesenheit einer Immunantwort z. B. in Phänomen oder Auto-Transplantation Modelle, Inselzellen transplantiert in der Leber über die Pfortader verloren aufgrund einer Entzündung und/oder ungünstigen Umgebungsbedingungen, wie z. B. schlechte Durchblutung Versorgung mit eingeschränkter Oxygenierung und/oder Nährstoffe5,6. Infolgedessen um langfristige metabolische Funktion zu gewährleisten, sind höhere Inselchen Zahlen notwendig, um die erste Zelle Verlust auszugleichen, die Engraftment7reduziert.
In einem Versuch, die Insel Engraftment optimieren mehrere alternative anatomische Standorte wurden experimentell untersucht sowie klinisch, mit dem Versprechen, noch keine endgültige Ergebnisse8. Während einige der alternativen Websites einfachen und sicheren Zugang bieten (zB., Haut, Niere Kapsel, gastrische Submukosa und Vorderkammer des Auges) oder eine breitere Fläche für größere Insel Massen (zB., Bauchhöhle), überleben und physiologische metabolische Leistung der transplantierten Inselchen noch begrenzt sind und bleiben ein Anliegen-9. Die Suche nach einem geeigneteren Standort für Inselchen Engraftment ist im Gange.
Das Omentum war unter den vielen anatomischen Stätten, die in der frühen Entwicklung der Inselversetzung untersucht und erwies sich eine erfolgreiche Umgebung für Inselchen10,11,12,13wurden, 14. Allerdings intraportal Inselchen Infusion wurde die klinische Wahl Due teilweise auf die relative Einfachheit des Verfahrens und erste Erfolge in der Tier-Modelle6. Auch auszugsweise, die negative damit verbundenen Website, besonders massive frühem Verlust der Insel, waren weniger verstanden und weniger einschränkend in den frühen Tagen der experimentellen Inselversetzung als Feld gereift. Mit neueren zwingende Beweise, die darauf hinweist, dass intravaskulären Inselchen Infusion weit von ist eignet sich das Omentum wieder auf dem Vormarsch als potentiell wertvolle Website für Stammzelltransplantation.
Das Omentum (in Form von einem omentalis Beutel) bietet relative Vorteile gegenüber der Leber15,16. Es ist gut vaskularisierte und leicht zugänglich. Es ermöglicht Abruf des Transplantats (falls erforderlich) und/oder Biopsie. Die ischämische Periode erlebt durch die kleinen Inseln ist im Vergleich zu der Leber reduziert, und das Omentum kann relativ akzeptieren, dass große Inselchen Massen, die nicht intraportally, wo ein Druckanstieg Portal kann Komplikationen verursachen können.
Ein Phänomen Mausmodell der Transplantation diente in das Protokoll in der Studie beschäftigt C57BL/6 männliche Mäuse zwischen 6 – 8 Wochen alt, mit einem Körpergewicht von 20 – 25, g. Islet Empfänger Diabetiker mit einer einzigen Injektion von Streptozocin mit einer Dosis von 250 gerendert wurden, getestet mg/kg Ip. Die Induktion von Diabetes kann als erfolgreich, wenn der Blutzuckerspiegel der Maus größer als 24 Mmol/L 48 h nach der Injektion ist und über diesem Niveau bei einem Mindestaufenthalt von 5 Tagen bleibt.
Phänomen Inselchen wurden isoliert aus der Bauchspeicheldrüse von Alter abgestimmt Geber auf zuvor veröffentlichten Methoden mit einigen Änderungen. Kurz gesagt, wurde die Kollagenbildung in der Gallenblase anstelle der Gallengang injiziert. Dies geschah als eine Verbesserung um die Benutzerfreundlichkeit der Injektion zu erleichtern. Kollagenase-Infusion war gefolgt von Inkubation, Gewebe Störungen, gradient Dichtetrennung und Handlese, reine Inselchen zu erhalten. Inselchen wurden kultiviert über Nacht in CMRL-1066 Medium ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in Korbflaschen T175 bei 37 ° C unter 95 % Luft - 5 % CO2 vor der Transplantation.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 Zoll (12-13 cm) Schere</td><td>RWD Life Science&nbsp;</td><td>S12030-11</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>RWD Life Science</td><td>F11010-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleine gewickelte Clips</td><td>RWD Life Science</td><td>R33003-01</td><td></td></tr><tr><td>Acutenaculum</td><td>RWD Life Science</td><td>F31044-13</td><td></td></tr><tr><td>2 Paar Gewebezange</td><td>RWD Life Science</td><td> F13023-10</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Naht mit Nadel</td><td>Chenghe, China</td><td>17094</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipette und Spitzen</td><td>Gilson</td><td>PN11</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Basic Blutzuckermesssystem&nbsp; &nbsp;</td><td>Johnson & Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Philips</td><td>HC1099/15</td><td></td></tr><tr><td>Material und Tiere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P3761</td><td>Für die Anästhesie&nbsp;</td></tr><tr><td>Hydrogel&nbsp;</td><td>bdbiosciences.com</td><td>356234</td> Basalmembran-Matrix-Fibrin-Thrombin-Hydrogel<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Baxter.com</td><td>1501250</td><td>Komponenten gerinnen beim Mischen</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Yingniu medical, Anhui, China</td><td>23170608</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Lierkang medical technology, Shangdong, China</td><td>170521</td><td></td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung</td><td>Baxter.com</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Cephalosporin</td><td>Lukang medical, Shangdong, China</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Baxter.com</td><td>2G3508</td><td></td></tr><tr><td>Gleitmittel Augensalbe</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>203964</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ V</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066 Medium</td><td>Celltrans, Wenzhou, China</td><td>X018D1</td><td></td></tr><tr><td>histopaque</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>10771</td><td>Dichtegradient</td></tr><tr><td>PE50-Schlauch</td><td>Braintreesci.com</td><td>PE50 100 FT</td><td>Polyethylen .023" x .038</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C1359</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT)</td><td>Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL</td><td>4583</td><td>Einbettungsmedium</td></tr><tr><td>Insulin Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923</td><td>8138S</td> Hämatoxylin-Färbemedium <td></td></tr><tr><td></td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Färbemedium</td><td>Beyotime Biotech, China</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Mäuse</td><td>Medical Animal Center der Provinz Guangdong</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>T175 Kolben</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Schnappverschluss-Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr></tbody></table>

eine methode zur inselversetzung, omentum in maus

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Inselversetzung ist vorgeschlagen worden, eine mögliche Behandlung für Typ-1-Diabetes sein. Den letzten überzeugende Hinweise darauf, dass intravaskulären Inselchen Infusion bei weitem nicht Ideal ist und daher das Omentum ist wieder auf dem Vormarsch als potenziell wertvollen Standort für Inselversetzung. Dieses Experiment erfordert die Isolierung von hochwertigen Inselchen und die Implantation von den kleinen Inseln an der diabetischen Empfänger. Transplantation, das Omentum erfordert chirurgische Schritte, die optisch besser nachgewiesen werden können. Hier sind die einzelnen Schritte für dieses Verfahren vorgestellt. Zwei Methoden die isolierte Inseln mit Hydrogel zu mischen, bevor Sie die Mischung in den omentalis Beutel von diabetischen Mäusen platzieren werden hier beschrieben. Verschiedenen Hydrogele werden für die unterschiedlichen Bedingungen verwendet. Blutzuckerspiegel der Diabetiker Maus Empfänger Phänomen Inselchen in der Omentum wurden bis zu 35 Tagen beobachtet. Einige Tiere geopfert wurden nach 14 Tagen, Immuno-histochemische Analyse durchzuführen. Diese prä-klinischen Transplantation Ansatz kann als vorläufige Daten vor der Übersetzung bis zur klinischen Transplantation verwendet werden.

Post-Digestive Zustand der Bauchspeicheldrüse ist in Figur 1Adargestellt. Gereinigte Inselchen sind in Abbildung 1 bdargestellt. Dithizone Färbung und Lebensfähigkeit Prüfung der Inseln sind in Abbildung 2dargestellt. Die wichtigsten Schritte von der Inselversetzung, das Omentum sind in Abbildung 3dargestellt. Die Blutzuckerwerte der Empfänger nach omentalis Transplantat...

Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Letentransplantation wie die Letentransplantation in das Omentum zu beantworten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Typ-I-Diabetes, da das Omentum als potenzieller Wertstandort für die Letentransplantation wieder auftaucht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die isolierten Inselchen mit Hydrogel gemischt werden und die Mischung in den Omentumbeutel der diabetischen Maus gelegt wird.Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines aseptischen Feldes im chirurgischen Bereich mit sterilem Material wie Vorhängen und Einwegartikeln. Legen Sie die sterilisierten chirurgischen Instrumente in das aseptische Feld. Wählen Sie die Spenderinseln unter dem Stereomikroskop mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze aus.Für jedes Tier 450 bis 500 Inselchen sammeln und in ein steriles 1,5-Milliliter-Snap-Top-Rohr mit 100 Mikroliter CMRL 10 66 Medium geben. Legen Sie die Röhre auf Eis, bis sie zur Transplantation bereit ist. Sobald die Inseln geerntet sind, tauen Keller Membran Matrix Hydrogel auf Eis.Wiegen und taggen Sie alle diabetischen Empfängermäuse. Nach der Anästhesisierung der ersten Maus nach einem institutionell zugelassenen Protokoll, testen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie eine Zehenprise. Wenn es keinen Entzugsreflex gibt, ist das Niveau der Anästhesie für die Operation korrekt.Verabreichen Sie die Tierarztsalbe an die Augen, um Trockenheit unter Anästhesie zu verhindern. Den Bauch mit 70% Ethanol abwischen. Dann rasieren Sie die Haare von der Operationsstelle.Bedecken Sie das Tier mit einem sterilen Vorhang und desinfizieren Sie den Bereich mit einem Jodpeeling. Nach der Verwendung von ophthalmologischen Scheren, um einen 4 bis 5 Zentimeter Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches zu erstellen, bewegen Sie den Darm auf die linke Seite und decken Sie mit saline getränkter Gaze, um Austrocknung während des Operationszufalls zu verhindern. Dann verwenden Sie Wattestäbchen, um den Magen vollständig freizulegen und das Omentum unter dem Magen zu lokalisieren.An dieser Stelle sollte das Hydrogel vollständig aufgetaut werden. Drehen Sie das Rohr mit den Inseln 30 Sekunden lang mit 200 mal g. Entfernen Sie nach dem Spin den Überstand.Dann aspirieren 50 Mikroliter des Hydrogels fügen Sie es in das Rohr mit den Inseln und mischen sanft die Bildung von Blasen zu vermeiden. Als nächstes verwenden Sie zwei Paar Zangen, um die Ränder des Omentums aufzunehmen und sanft zu einer Nut zwischen der Magenwand und dem Darm zu heben. An dieser Stelle in der Operation wird eine zweite Person benötigt, um die resuspendierte Insel Hydrogelmischung mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze zu saugen und in die Nut zu geben.Stellen Sie sicher, dass die Mischung gut in der Nut positioniert ist, indem Sie die Ränder des Omentums sanft anheben oder senken. Vervollständigen Sie die Positionierung der Mischung innerhalb von drei Minuten, bevor das Hydrogel erstarrt. Nach den Hydrogel-Sets das Omentum falten, um das Transplantat zu bedecken.Das Omentum haftet an der umgebenden Magenwand, wenn sich das Hydrogel verfestigt. Wenn das Hydrogel vollständig verfestigt ist, verwenden Sie Wattestäbchen, um den Darm in der Bauchhöhle neu zu positionieren, wobei darauf geachtet wird, den Ort der Transplantation nicht zu berühren. Als nächstes 200 Mikroliter eines geeigneten Antibiotikums in die Bauchhöhle geben, um eine Infektion zu verhindern.Verwenden Sie dann 4 O Naht, um den Bauch zu schließen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Standorte des Omentums bei Mäusen klein und anstrengend zu bewerten sind. Legen Sie die Maus in einen erwärmten Erholungskäfig, bis sie vollständig die externe Resüperkraft wiedererlangt.Am nächsten Tag und jeden Tag danach für eine Woche, injizieren Sie Antibiotikum als post-chirurgieische Prophylaxe. Messen Sie auch den nicht fastenden Blutzuckerspiegel aus einer Blutprobe der Schwanzvene mit einem Blutzuckermessgerät einmal täglich nach der Transplantation. Bei der Transplantation in das Omentum kann das Islettransplantat eine verzögerte Funktion haben und zwei bis drei Wochen lang keinen völlig normalen Blutzuckerspiegel erreichen.Das transplantierte Gewebe wurde 14 Tage nach der Transplantation aus der eingeschläferten Maus entnommen. Hier ist das Transplantat als Kernhaufen nach DAPI-Färbung sichtbar. Die Funktionalität des transplantierten Gewebes wird durch Immunfluoreszenzfärbung mit Antiinsulin-Antikörpern aufgedeckt.H&E Färbung zeigt die transplantierten Gewebe umgeben von den Adipozyten des Omentums. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich auch daran zu erinnern, dass das Maus-Omentum zerbrechlich ist.Nach diesem Verfahren, andere Methoden wie in verschiedenen High School verwendet, MB Leistung in allen, die bestimmte Fragen wie die Verbreitung von Derichtise in Vaskulolisierung und die Leistung beantworten wird. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern in ihrer Transplantation den Weg, um die Behandlung von Typ-I-Diabetes in mehr als einem Auszug zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Inselchen in das Omentum in der Maus transplantieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Transplantation menschlicher Pankreasinseln in die vordere Kammer des Mausauges, um die Revaskularisation von menschlichen Inseltransplantaten in vivo zu überwachen. Es hilft auch, den Beitrag von Empfänger- und Spenderzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisierung des Transplantats zu verstehen.

Transplantation von Pankreasinseln: Eine Methode zur Implantation von Pankreasinseln in die vordere Kammer des Mausauges für die In-vivo-Bildgebung

In diesem Video beschreiben wir ein Verfahren zur Infusion von Pankreas-Inselzellen in die Leberpfortader, gefolgt von der Anwendung von Gelschaum, um Blutungen erfolgreich zu verhindern. Postoperative Blutungen sind eine häufige Ursache für eine hohe Mortalität bei Inseltransplantationen.

Mausmodell der Inseltransplantation: Eine chirurgische Methode zur Infusion von Pankreasinseln in die Pfortader und zur Vorbeugung postoperativer Blutungen

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.

Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING)

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Hier stellen wir verfeinerte chirurgische Verfahren zur erfolgreichen Durchführung der intraportalen Inseltransplantation, einem klinisch relevanten, aber technisch anspruchsvollen chirurgischen Eingriff, bei Mäusen vor.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

In diesem Protokoll diskutieren wir die Implementierung eines Modells für eine erfolgreiche orthotope Lebertransplantation (OLT) bei Mäusen. Darüber hinaus werden auch Adjuvantien zur weiteren Analyse der Durchgängigkeit von Transplantaten nach erfolgreicher OLT in einer Maus diskutiert, insbesondere unter Verwendung von Mikrocomputertomographie (microCT)-Scans.

Erfolgreiche orthotope Lebertransplantation bei Mäusen mittels Mikrocomputertomographie-Angiographie

Lernen Sie die Inseltransplantation ins Omentum bei diabetischen Mäusen. Diese Methode kombiniert isolierte Inseln mit Hydrogel zur Verbesserung der Überlebensrate und Funktion. Sie ermöglicht Forschern, neue Therapien für Diabetes Typ I zu entwickeln.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

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