Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die osteoinduktiven Wirkungen von Vitamin D auf kultivierte mesenchymale Stammzellen zu untersuchen, die aus dem Periost der Zahnalveoläre entnommen wurden. Die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen ist seit einem großen Jahrzehnt ein großer Fortschritt in der Zahnmedizin. Sie wurden erfolgreich aus vielen Teilen des Zahngewebes isoliert und kultiviert.

Ziel ist es jedoch, mesenchymale Stammzellen aus dem alveolären Periost zu isolieren und zu kultivieren und das osteoinduktive Potenzial der Vitamin-D-Verbindung zu untersuchen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in diesem Bereich sind, aufgrund der neuen Idee der Knochenbildung in mesenchymalen Stammzellen, die aus dem alveolären Periost stammen, Schwierigkeiten haben. Die Demonstration des Verfahrens durch das Laborpersonal wird Fräulein Hsin-Wen Chi sein,

eine Forschungsassistentin aus meinem Labor. Zu Beginn entnehmen Sie das Periostgewebe von Patienten während einer Zahnoperation mit einem Periostseparator. Sammeln Sie Scheiben, die etwa zwei mal fünf Millimeter groß sind.

Lagern Sie die Gewebeschnitte in DPBS mit Antibiotika. Verwenden Sie im Labor ein Skalpell, um die Fragmente des alveolären periostalen Gewebes innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme gründlich zu zerkleinern. Anschließend wird das Gewebe auf 35-Millimeter-Petrischalen in dem entsprechenden Kulturmedium kultiviert.

Verwenden Sie einen befeuchteten 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxidgas. Entsorgen Sie drei Tage später das gesammelte Periostgewebe und wechseln Sie das Medium. Wenn die Zellen auf etwa 80 % Konfluenz gewachsen sind, lösen Sie die kultivierten Zellen durch Zugabe von Trypsin.

Und die Kultur drei Minuten lang inkubieren. Fügen Sie danach 0,8 Milliliter Medium hinzu, um die Ablösung zu beenden. Nach dem Sammeln und Zählen 5.000 Zellen auf einen Milliliter pro Platte verteilen.

Markieren Sie die plattierten Zellen zu diesem Zeitpunkt als Durchgang eins. Kultivieren Sie diese Zellen und trennen Sie sie wieder, nachdem sie zu 80 % Konfluenz vermehrt sind. Das Medium mit Durchgang eins ist zunächst orange/rot gefärbt.

Wenn das Medium drei Tage später anfängt, sich orange zu färben, wechseln Sie es. Wenn die Passage der ersten Zellen 80 % Konfluenz erreicht, erstellen Sie die Zellen der zweiten bis fünften Generation, indem Sie die gleichen Verfahren wiederholen, die zur Vorbereitung der Nullgeneration auf die erste Generation verwendet wurden. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.

Vier Wochen später beurteilen Sie das Potenzial der Zellen, sich in eine osteogene Linie zu differenzieren, indem Sie die Morphologie der Zellen unter einem Mikroskop beobachten. Stammen Sie die Zellen mit einem von kossa-Assay. Dieser Assay unterscheidet das Vorhandensein von verkalkten Ablagerungen in Ihrer Kultur.

Waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie sie 30 Minuten lang in einem Milliliter 10%Formalin. Entfernen Sie danach das Formalin und waschen Sie die Zellen und behandeln Sie sie mit 5%igem Silbernitrat. Setzen Sie die Zellen eine Stunde lang UV-Licht aus.

Entfernen Sie anschließend das Silbernitrat und behandeln Sie die Zellen viermal für jeweils drei Minuten mit zwei Millilitern 5%igem Natriumsulfat. Ersetzen Sie die Lösung zwischen den Behandlungen. Zum Schluss waschen Sie die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser.

20 von 34 periostalen Gewebeproben ergaben erfolgreich aus dem Knochenmark gewonnene Stammzellkolonien. Es wurden keine Faktoren in Bezug auf die Spender gefunden, die den Kultivierungserfolg signifikant beeinflussen. Anfangs bildeten PDCs Kolonien und kugelförmige Cluster mit einer Mischung aus runden und spindelförmigen Zellen.

Nach der ersten Passage waren die Zellen homogen fibroblastenartig mit einer spindelförmigen Form. Am Ende der osteogenen Differenzierung zeigte der von-kossa-Assay das mögliche Vorhandensein von Calciumablagerungen und eine osteogene Differenzierung an. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Vorläuferzellen in periostalen Zellpopulationen das Potenzial besitzen, sich zu osteogenen Zellen zu differenzieren.

Die osteogenen Vorläuferzellen wurden ebenfalls mit Calcitriol behandelt und mittels RTPCR untersucht, um das Expressionsniveau der alkalischen Phosphatase zu beurteilen, die ein starker Indikator für eine frühe osteogene Differenzierung von Zellen ist. Sowohl die Behandlung von Vitamin C als auch von Calcitriol, einem aktiven Metaboliten von Vitamin D, erhöhten die Expression der alkalischen Phosphatase. Außerdem stieg die Expression des Kollagen-ein-mRNA-Spiegels als Reaktion auf die gleichen Behandlungen an.

Es wurde festgestellt, dass die Expression von Knochensialoprotein-mRNA bei den Zellen, die mit einer höheren Konzentration von Calcitriol behandelt wurden, zunimmt. CBFA one und die Ostocalcium-mRNA-Expression sprachen jedoch nicht auf die Behandlungen an. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten die Zuschauer ein gutes Verständnis für die Mineralisierung und das Kulturprotokoll des menschlichen Alveolärperiosts haben.

Einmal gemeistert, kann dieses Unterfangen in vier bis fünf Wochen erledigt werden, wenn es richtig ausgeführt wird. Bei diesem Versuch ist es wichtig, eine sorgfältige und sterile Technik zu verwenden, um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.