Ökosystem-Herstellung (EcoFAB)-Protokolle für den Bau von Labor Ökosysteme entwickelt, um die Pflanze-Mikroben Interaktionen zu untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, standardisierte Ansätze für die Konstruktion vereinfachter Modellpflanzenökosysteme, genannt EcoFABs, zu definieren, die kontrollierte, replizierte Laborexperimente zur Untersuchung von Pflanzenmikrobeninteraktionen ermöglichen, die im Feld weiter getestet werden können. Diese Methode kann verwendet werden, um die Interaktionen von Pflanzenmikroben in kontrollierten Umgebungen zu untersuchen, was es uns ermöglicht, detaillierte mechanistische Einblicke in die Funktionen von Mikrobiomen zu gewinnen, um sie für eine nachhaltige Landwirtschaft nutzbar zu machen. Wir haben an der Entwicklung dieses ersten Eco-FAB mitgewirkt, das eine Vielzahl verfügbarer 3D-Drucktechnologien einsetzt und die Wachstumskammern der Pflanzen sterilisiert, die sowohl nicht ablenkende hochauflösende Bilder als auch chemische Analysen ermöglichen.

Das hier entwickelte Eco-FAB-Gerät eignet sich gut für die Analyse von Interaktionen mit Pflanzenmikroben, da es die Analyse der Wurzelmorphologie und die massenspektroskopische Bildgebung umfasst. Nach dem Bau der Eco-FAB-Formen werden unter Verwendung des 3D-Drucks gemäß dem Textprotokoll in einem Einwegbehälter von einem Liter je nach Versuch 40 Milliliter Siloxanelastomerbasis mit unterschiedlichen Volumina des Härters gemischt. Stellen Sie den Behälter für mindestens 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen aus der Elastomermischung zu entfernen.

Entfernen Sie dann die Mischung und gießen Sie sie in die zusammengebaute 3D-gedruckte Kunststoffform. Um eine einheitliche PDMS-Schicht zu erzeugen, müssen Luftblasen vorsichtig entfernt werden. Verwenden Sie Druckluft, um alle Luftreste abzublasen, nachdem Sie die Mischung in die Form umgefüllt haben.

Halten Sie die Form auf einem Heizblock vier Stunden lang bei 85 Grad Celsius. Lasse die Form fünf Minuten abkühlen. Ziehen Sie dann den Einsatz vorsichtig aus der Form heraus und trennen Sie das PDMS langsam mit einem Universalmesser vom Gussrahmen.

Drücken Sie den Formboden mit PDMS nach oben aus dem Gießrahmen. Trennen Sie dann mit einem Messer oder anderen Werkzeugen die PDMS-Schicht vorsichtig an den Rändern vom Formboden und ziehen Sie sie langsam von der Formoberfläche ab. Erstellen Sie mit einer stumpfen Nadel von 15 Gauge einen Einlasskanal auf den PDMS-Schichten, indem Sie 1,6 Millimeter große Löcher in dieses Teil bohren.

dann eine Schere, um die Kanten der PDMS-Layer zu kürzen. Um die PDMS-Schichten dauerhaft mit den Objektträgern zu verbinden, wird die Haftseite der PDMS-Schicht mit Methanol an einem 7,6 x fünf Zentimeter großen Objektträger gespült und anschließend mit Druckluft oder einer Reinststickstoffpistole trockengeblasen. Legen Sie den Objektträger und die PDMS-Schicht mit den Klebeseiten nach oben in einen Plasmareiniger.

Schließen Sie die Kammer und das Gasentlüftungsventil. Schalten Sie dann das Vakuum ein und pumpen Sie die Kammer eine Minute lang ab. Schalten Sie den Plasmagenerator ein und schalten Sie die Radiofrequenz oder den HF-Pegel eine Minute lang auf hoch.

Schalten Sie dann sowohl die Vakuumpumpe als auch die Plasmaleistung aus und entlüften Sie die Kammer zur Atmosphäre. Nehmen Sie den Objektträger und die PDMS-Schicht aus der Plasmakammer und drücken Sie alle vier Kanten der PDMS-Schicht schnell und gleichmäßig auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass der mittlere ovale Bereich, bei dem es sich um die Wurzelkammer handelt, den Objektträger nicht berührt.

Spülen Sie die Eco-FAB-Geräte mit Reinstwasser ab. Legen Sie ein Eco-FAB-Gerät in einen Eco-FAB-Behälter und fügen Sie 70 % Ethanol hinzu, bis das Gerät untergetaucht ist. Schließen Sie dann den Behälterdeckel und schütteln Sie ihn vorsichtig, um alle Oberflächen im Inneren mit Ethanol zu benetzen, und stellen Sie sicher, dass die Wurzelwachstumskammer des Eco-FAB-Geräts mit Ethanol gefüllt ist und nur sehr wenige oder keine Luftblasen vorhanden sind.

Nachdem Sie die Geräte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, gießen Sie das 70%ige Ethanol ab und ersetzen Sie es durch 100%iges Ethanol. Inkubieren Sie die Geräte dann fünf Minuten lang. Lassen Sie nach der Inkubation das Ethanol ab und lassen Sie das sterilisierte Eco-FAB 16 Stunden lang in einer Laminar-Flow-Haube, um es vollständig zu trocknen.

Falls verfügbar, sterilisieren Sie das System, indem Sie das UV-Licht in der Haube eine Stunde lang einschalten. Um die Sterilisation und Keimung der Samen durchzuführen, weichen Sie die Samen zwei Minuten lang in 70%igem Ethanol ein. Entfernen Sie dann mit einer Pipette das Ethanol und spülen Sie die Samen dreimal mit sterilem Wasser ab.

Als nächstes weichen Sie die Samen fünf Minuten lang in 10%iger Bleichlösung ein. Entfernen Sie dann die Bleichlösung und waschen Sie die Samen dreimal gründlich mit sterilem Wasser. Nach dem Waschen fügst Du den Samen steriles Wasser hinzu und inkubierst das Röhrchen sieben Tage lang bei vier Grad Celsius.

Verteilen Sie die Samen gleichmäßig auf 0,5 Murashige und Skoog oder MS medium mit 0,6% Vitagel. Versiegeln Sie die Platten mit Mikroporenband. Lass die Pflanzen dann auf eine Wurzellänge von etwa fünf Millilitern wachsen.

Um die Sämlinge in Eco-FABs zu übertragen, spülen Sie die Wurzelkammer eines Eco-FAB-Geräts mit einer sterilen Spritze oder Mikropipette und sterilem Wasser dreimal und füllen Sie dann die Wurzelkammer mit dem gewünschten Wachstumsmedium, z. B. 0,5 MS-Medium. Setzen Sie nun vorsichtig einen einzelnen Sämling in das Pflanzenreservoir des Eco-FAB-Geräts ein. Es ist wichtig, dass die Sämlinge vorsichtig von der Platte in den Eco-FAB umgefüllt werden, damit die Wurzeln nicht brechen.

Geben Sie drei Milliliter steriles Wasser in den Behälter und vermeiden Sie das Eco-FAB-Gerät. Dadurch wird die Luftfeuchtigkeit erhöht und die Verdunstung des Mediums aus der Wurzelkammer verringert. Schließen Sie dann den Behälter und verwenden Sie Mikroporenband, um den Deckel zu verschließen.

Stellen Sie den Eco-FAB in einen Pflanzenbrutkasten oder verwenden Sie das Eco-FAB-Beleuchtungssystem in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur, die für das Wachstum der jeweiligen Pflanze geeignet ist. Stellen Sie dann die Kammer auf 24 Grad Celsius ein. Führen Sie schließlich die Erstellung von Metabolitenprofilen und die Massenspektrometrie gemäß dem Textprotokoll durch.

Diese Zahlen zeigen, dass sieben Tage alte Aaabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon und Panicum virgatum in Eco-FABs wachsen. Sowohl die Dikotyledonen als auch die Monokotyledonen wurden im Eco-FAB als ihren Fortpflanzungsstadien gerecht befunden. Diese Sämlinge repräsentieren eine Gruppe von 14 Tage alten Brachypodium-Distachyonen, die in hydroponischem Medium wachsen, sowie in Sand und Erde, die mit hydroponischem Medium bzw. Wasser ergänzt werden.

Die dünne, feste Substratschicht und die Wurzelwachstumskammern lassen Licht für die mikroskopische Abbildung des Wurzelsystems durch. Hier wurde ein Brachypodium-Distachyon-Keimling in das Eco-FAB-Gerät übertragen und seine Wurzelstruktur von einer Kamera in einem Biorad-Gel-Imager aufgezeichnet. Die Quantifizierung der Gesamtwurzelfläche über einen Zeitraum von drei Wochen zeigte eine allmähliche Zunahme im Frühstadium, gefolgt von einem linearen Wachstumstrend bis zum Ende.

In dieser Abbildung wurde ein Eco-FAB, der die pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien, Pseudomonas simiae, WCS417, enthält, in das Wurzelsystem der Pflanze in 10 bis sechs Zellen pro Pflanze eingebracht. WCS147-Mikroben besiedelten die Oberfläche des gesamten Wurzelsystems, wobei sich die Mikroben um die Bereiche der Wurzelspitze konzentrierten. Bei der Auffrischung von Kultursubstraten und dem Sammeln von Wurzelexsudaten aus Eco-FABs ist es wichtig, daran zu denken, die gesamte Arbeit in einer sterilen Haube zu verarbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden.

Eco-FAB-Geräte können auch mit einer reversiblen, physikalischen Versiegelung hergestellt werden, indem entweder eine 3D-gedruckte Klemme verwendet oder die Viskosität des PDMS verändert wird. Dies ermöglicht den Einsatz von festen Wachstumsmedien und der direkten massenspektroskopischen Bildgebung. Nach der Entwicklung von Eco-FAB wird dieses System es Forschern auf der ganzen Welt ermöglichen, diese Labormodell-Ökosysteme zu nutzen, um die Wechselwirkungen von Pflanzenmikroben mithilfe von Systembiologie und Bildgebungstechnologien zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Eco-FAB-System herstellt und welche breiten Anwendungen es in Ökosystemstudien gibt. Wir hoffen, dass dieses Eco-FAB-Design es anderen Wissenschaftlern ermöglichen wird, ihre spezifischen wissenschaftlichen Ziele zu erreichen. Noch wichtiger ist, dass wir hoffen, dass andere Wissenschaftler auf diesem Eco-FAB-Design aufbauen und es verbessern und mit anderen Wissenschaftlern teilen, damit wir als Gemeinschaft diese Laborökosysteme aufbauen können, die es uns ermöglichen, die Wechselwirkungen zwischen Pflanzenmikroben besser zu verstehen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikroben und scharfen Gegenständen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.