Bildung von kovalenten DNA Addukte durch enzymatisch aktivierten Karzinogene und Drogen In Vitro und ihre Entschlossenheit von ³²P-postlabeling

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Beschreibung von Methoden, die die durch Cytochrom p450 und zusätzliche Biotransformationsenzyme katalysierten Reaktionen verwenden, um die Wirksamkeit von Chemikalien oder Arzneimitteln für ihre Aktivierung zu Metaboliten zu untersuchen, die kovalente DNA-Addukte bilden. Diese Methode kann helfen, die zentralen Fragen im Bereich der Entstehung von Krebs und seiner Behandlung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Ihnen eine Art von Methode zeigt, um die Wirksamkeit von Umweltchemikalien oder -medikamenten zur Bildung kovalenter DNA-Addukte zu bewerten, die den Beginn der Krebsentwicklung darstellen.

Die Auswirkungen der Technik zur Bestimmung der krebserregenden Wirkung von Chemikalien. Umweltwirksamkeit, Giftstoffe und Medikamente und bestimmt auch relativ einfache Methoden zur Bildung von kovalenten DNA-Addukten, die von solchen Verbindungen gebildet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Initiierung der Entwicklung von Krebs und seine Behandlung geben kann, kann sie auch auf andere wissenschaftliche Bereiche angewendet werden.

Dazu gehören Studien über molekulare Mechanismen, über DNA-Schäden und orale Studien über die enzymatische Aktivierung und die Vergiftung von Chemikalien. Die Idee zu dieser Methode hörte ich zum ersten Mal, als ich Prozesse untersuchte, die in der Initiationsphase der chemischen Karzinogenese eine Rolle spielen. Bereiten Sie zunächst die Inkubationsmischung vor, indem Sie alle Verbindungen und die Enzymsysteme zu einem Endvolumen von 0,75 Millilitern bei vier Grad Celsius hinzufügen.

Dabei wird das Karzinogen mit der DNA in Gegenwart von Cytochrom p450 inkubiert. Fügen Sie dann Mikrosomen oder reines rekombinantes p450 im Supersom zu der Mischung hinzu. Fügen Sie als nächstes 7,5 Mikroliter 0,1 Millimolar Elliptizin, gelöst in DMSO, und 42,5 Mikroliter Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 0,75 Milliliter einzustellen.

Mischen Sie dann die Komponenten, indem Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang vortexen. Inkubieren Sie das Röhrchen unmittelbar danach bei 37 Grad Celsius bei geöffnetem Deckel für 30 bis 60 Minuten. Mischen Sie anschließend Phenol oder Phenolchloroform im Verhältnis eins zu eins mit der Inkubationsmischung in einem Eppendorf-Röhrchen.

Dadurch wird die Proteinkontamination von der DNA in der Inkubationsmischung entfernt. Dann die Mischung zu einer Emulsion verrühren. Dann die Mischung drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1600 g schleudern.

Sobald die Zentrifugation beendet ist, verwenden Sie eine Pipette, um die obere Wasserphase in ein neues Polypropylenröhrchen zu übertragen. Entsorgen Sie dann die Proteingrenzfläche zusammen mit der organischen Phase. Mischen Sie anschließend die Wasserphase mit dem äquivalenten Volumen an Phenol und Chloroform im Verhältnis eins zu eins.

Wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Geben Sie dann gleiche Mengen Chloroform in die gesammelte Wasserphase und zentrifugieren Sie erneut. Dann fällt die DNA aus der wässrigen Phase aus, indem zwei Volumina kaltes Ethanol hinzugefügt werden, das bei minus 20 Grad Celsius gehalten wird.

Mischen Sie dann die Lösung gut. Zur Vorbereitung der Markierung der DNA-Addukte mischen Sie die Bicinpufferlösung mit radioaktiv markierter ATP-Lösung, um die DNA-Addukte zu markieren. Geben Sie die Markierungsmischung in die NP1-Lösung oder die Butanol-Anreicherungsmischung.

Lassen Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Tragen Sie dann ca. 20 Mikroliter auf die gesamte Probe auf die PEI-Cellulose DC-Platte auf. Nachdem Sie die Probe auf der PEI-Zellulose-DC-Platte gespottet haben, lassen Sie die Platte in D1-Richtung entwickeln, um die Addukte zu reinigen.

Sobald die Platte getrocknet ist, lassen Sie die Platte in Richtung D3 und D4 entwickeln. Für die Entwicklung in D3 verwenden Sie Lithiumformiatpuffer bei einem pH-Wert von 3,5 mit Harnstoff. Für die D4-Entwicklung verwenden Sie Tris-HCl-Puffer mit Lithiumchlorid und Harnstoff.

Um Probleme bei der Entwicklung in D4-Richtung zu vermeiden, entwickeln Sie die Platten auch in D5-Richtung. Zunächst wird die P32-Postlabeling-Technik verwendet, um die Wirksamkeit von mikrosomalem p450-vermitteltem bioaktiviertem Ellipticin bei der Bildung von DNA-Addukten zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen die Bildung von kovalenten DNA-Addukten im Desoxyguanosin der Kälberthymus-DNA in Gegenwart von Ratten- und/oder menschlichen Lebermikrosomen; In der Kontrollgruppe werden jedoch keine Addukte gebildet.

Als nächstes wird das Potenzial von Peroxidase-Enzym-abhängigem aktiviertem Ellipticin untersucht. Das Bild zeigt die Bildung von kovalenten DNA-Addukten in der Kälberthymus-DNA in Gegenwart von Meerrettichperoxidase, Rinderlactoperoxidase und humaner Myeloperoxidase. Tatsächlich werden DNA-Addukte auch aus der Leber-DNA gebildet, wenn die Ratten in vivo mit 40 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Ellipticin behandelt werden.

Interessanterweise zeigt auch das humane Cytochrom p450-Enzym CYP3A4 ein starkes Potenzial, Ellipticin effizient zu Metaboliten wie 12-Hydroxyellipticin und 13-Hydroxyellipticin zu oxidieren. Diese Metaboliten können sich leicht an die DNA binden, um die Addukte zu bilden. Als nächstes werden Nuklease-P1- und n-Butanol-Anreicherungsmethoden verwendet, um die Bildung von DNA-Addukten nach Aktivierung von 3-Nitrobenzanthron mit zytosolischer Reduktase wie NQ01 aus Ratte und Mensch zu untersuchen.

Die Ergebnisse zeigen die Bildung von bis zu fünf DNA-Addukten aus der Kälberthymus-DNA, die aus der Ratte, dem menschlichen Leberzytosol und auch der Leber von Mäusen gewonnen wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die Stabilität der verwendeten enzymatischen Systeme zu erinnern.

Die Enzymaktivität kann abnehmen, wenn sie nicht auf Eis gelagert wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biochemie, der Biochemie der chemischen Karzinogenese, um die Natur des Phänomens von den Initiierungsprozessen der Krebsentwicklung in Organismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wirksamkeit von Umweltchemikalien oder Medikamenten bewerten können, die enzymatisch aktiviert werden sollen, um genetische kovalente DNA-Addukte zu metabolisieren.

Dieser Prozess stellt eine hohe Bedeutung für die Entwicklung krebsbasierter Therapien dar. Vergessen Sie nicht, dass Sie mit Chemikalien arbeiten, die extrem gefährlich sein können. Potentiell krebserregend, radioaktive Chemikalien, zum Beispiel Phosphor ATP.

Daher sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Laborlatexhandschuhe und Plexiglasplatten getroffen werden.