Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme
April 4th, 2018
Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.
Das übergeordnete Ziel dieses neuartigen Arbeitsablaufs ist es, die Belegung bzw. Stöchiometrie von posttranslationalen Proteinmodifikationen an spezifischen Acetylierungsstellen zu bestimmen. Dieser neuartige massenspektrometrische Arbeitsablauf bietet ein höheres Maß an Präzision bei der Quantifizierung. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur reversiblen Proteinregulation durch posttranslationale Modifikation zu beantworten, wie z. B. Lysinacetylierung oder Succinylierungsstellen, die am stärksten modifiziert sind und die Proteinfunktion verändern können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Stöchiometrie der Lysinacetylierung sowie der Succinylierung und Succinylierung auf Stellenebene genau bestimmt wird und die Methode die Stöchiometrie von Peptiden mit mehreren Lysinresten bestimmen kann. Diese Technik ist von großer Relevanz, da sie eine Acetylierungs- und Succinylierungsstöchiometrie oder einen modifizierten Anteil im Vergleich zu einem unmodifizierten Verhältnis zeigt, anstatt eine dimensionslose relative Häufigkeitsänderung zu messen. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich erkannte, dass die Verwendung von datenunabhängigen Erfassungen und MS2-basierter Quantifizierung für die Stöchiometrie-Analyse die Messgenauigkeit erheblich verbessern würde. Vorbereiten von drei Replikaten von 100
Überblick
Diese Studie präsentiert einen neuartigen massenspektrometrischen Workflow zur Quantifizierung posttranslationaler Modifikationen von Proteinen, insbesondere Acetylierung und Succinylierung. Die Methode verbessert die Messgenauigkeit durch die Bestimmung der stellenspezifischen Besetzung oder Stöchiometrie dieser Modifikationen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Massenspektrometrie
- Proteomik
Hintergrund
- Posttranslationale Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle für die Proteinfunktion.
- Das Verständnis von Acetylierung und Succinylierung ist für die Untersuchung der reversiblen Proteinregulation von entscheidender Bedeutung.
- Herkömmliche Methoden können bei der Quantifizierung dieser Modifikationen an Präzision mangeln.
- Diese Studie zielt darauf ab, die Genauigkeit der Stöchiometrie-Messungen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Workflows zur genauen Quantifizierung der Proteinacetylierung und -succinylierung.
- Identifizierung der am meisten modifizierten Lysinstellen und ihrer Auswirkungen auf die Proteinfunktion.
- Bereitstellung einer Methode zur Analyse von Peptiden mit mehreren Lysinresten.
Verwendete Methoden
- Ratiometrische Analyse endogener Modifikationen.
- Quantitative chemische Acylierung unter Verwendung von stabil isotop markierten Anhydriden.
- Datenunabhängige Akquisition Massenspektrometrie.
- Vorbereitung mehrerer Replikate für Genauigkeit.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine präzise Bestimmung der stellenspezifischen Stöchiometrie.
- Sie zeigt den Anteil modifizierter gegenüber nicht modifizierten Lysinresten.
- Höhere Messgenauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Identifiziert wichtige Acetylierungs- und Succinylierungsstellen, die die Proteinfunktion beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Dieser Workflow verbessert die Quantifizierung von Proteinmodifikationen erheblich.
- Er liefert Einblicke in die Regulation der Proteinfunktion durch Acetylierung und Succinylierung.
- Die Technik ist für ein breites Spektrum proteomischer Studien anwendbar.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation stoichiometry enables precise assessment of post-translational modification occupancy, which is critical for understanding reversible protein regulation in drug target pathways. This method provides unbiased, proteome-wide measurement of modification levels, supporting target validation by distinguishing biologically relevant acylation sites from background noise. By delivering stoichiometric data rather than relative abundance changes, it enhances predictive confidence in mechanistic de-risking during early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying occupancy of acetylation and succinylation at specific lysine residues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise measurement of modification stoichiometry, clarifying functional impact on protein activity.
- Predictive Value: Improves target confidence by identifying which modified sites are most likely to alter function, aiding in portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by providing site-level acylation occupancy data.
- Quantitative Output: Uses fragment ion peak areas from DIA-MS to enable accurate, interference-reduced quantification suitable for assay standardization.
- Scalability: Facilitates screening readiness through reproducible, multiplex-capable proteomic analysis of acetylation and succinylation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase modification profiling to preclinical validation by identifying disease-relevant acylation sites.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by determining stoichiometry from peptides with multiple lysine residues, enabling site-specific resolution.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing which lysine modifications are functionally significant versus stochastic.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, providing stoichiometric acetylation and succinylation data that inform mechanistic understanding and compound effects on protein function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying site-specific modification occupancy in response to perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantitative measurement of modification levels across proteomic samples.
- Analytics: Delivers precise stoichiometry measurements via DIA-MS fragment ion quantification, allowing accurate comparison of modification states.
- Translational Research: Links to preclinical continuity by identifying acylation sites with high occupancy that may serve as biomarkers or mechanistic readouts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability for consistent PTM profiling across projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through accurate site-level stoichiometry of acetylation and succinylation, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via DIA-MS and Skyline-based quantification, minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying high-occupancy, functionally relevant modification sites, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on modification-driven functional evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry-based proteomics and PTM enrichment techniques.
- Dependence on DIA-capable instrumentation and spectral library generation for accurate fragment ion quantification.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and chemical acylation protocols for reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the workflow to diverse model systems or tissue types.
- Involves practical limitations related to peptide detectability and lysine residue accessibility in complex mixtures.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
