Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme
4. April 2018
Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.
Das übergeordnete Ziel dieses neuartigen Arbeitsablaufs ist es, die Belegung bzw. Stöchiometrie von posttranslationalen Proteinmodifikationen an spezifischen Acetylierungsstellen zu bestimmen. Dieser neuartige massenspektrometrische Arbeitsablauf bietet ein höheres Maß an Präzision bei der Quantifizierung. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur reversiblen Proteinregulation durch posttranslationale Modifikation zu beantworten, wie z. B. Lysinacetylierung oder Succinylierungsstellen, die am stärksten modifiziert sind und die Proteinfunktion verändern können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Stöchiometrie der Lysinacetylierung sowie der Succinylierung und Succinylierung auf Stellenebene genau bestimmt wird und die Methode die Stöchiometrie von Peptiden mit mehreren Lysinresten bestimmen kann. Diese Technik ist von großer Relevanz, da sie eine Acetylierungs- und Succinylierungsstöchiometrie oder einen modifizierten Anteil im Vergleich zu einem unmodifizierten Verhältnis zeigt, anstatt eine dimensionslose relative Häufigkeitsänderung zu messen. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich erkannte, dass die Verwendung von datenunabhängigen Erfassungen und MS2-basierter Quantifizierung für die Stöchiometrie-Analyse die Messgenauigkeit erheblich verbessern würde. Vorbereiten von drei Replikaten von 100
Übersicht
Diese Studie stellt einen neuartigen massenspektrometrischen Workflow zur Quantifizierung posttranslationaler Proteinmodifikationen, insbesondere Acetylierung und Succinylierung, vor. Die Methode verbessert die Messgenauigkeit, indem die standortspezifische Besetzung oder Stöchiometrie dieser Modifikationen bestimmt wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Massenspektrometrie
- Proteomik
Hintergrund
- Posttranslationale Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion.
- Das Verständnis von Acetylierung und Succinylierung ist entscheidend, um die reversible Proteinregulation zu untersuchen.
- Herkömmliche Methoden weisen bei der Quantifizierung dieser Modifikationen möglicherweise an Mängel an Präzision auf.
- Diese Studie zielt darauf ab, die Genauigkeit von Stöchiometriemessungen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Workflows zur genauen Quantifizierung der Proteinacetylierung und Proteinsuccinylierung.
- Identifizierung der am stärksten modifizierten Lysin-Stellen und deren Einfluss auf die Proteinfunktion.
- Bereitstellung einer Methode, die Peptide mit mehreren Lysin-Resten analysieren kann.
Verwendete Methoden
- Verhältnisanalyse endogener Modifikationen.
- Quantitative chemische Acylierung unter Verwendung stabiler Isotopen-markierter Anhydride.
- Massenspektrometrie mit datenunabhängiger Erfassung.
- Herstellung mehrfacher Replikate zur Genauigkeitssicherung.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht die präzise Bestimmung der stöchiometrischen Verhältnisse auf Ebene einzelner Bindungsstellen.
- Sie zeigt den Anteil modifizierter gegenüber unmodifizierten Lysinresten auf.
- Höhere Messgenauigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Identifiziert wichtige Acetylierungs- und Succinylierungsstellen, die die Proteinfunktion beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Dieser Arbeitsablauf verbessert die Quantifizierung von Proteinmodifikationen erheblich.
- Er liefert Einblicke in die Regulation der Proteinfunktion durch Acetylierung und Succinylierung.
- Die Methode ist auf eine breite Palette proteomischer Studien anwendbar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung der ortsspezifischen Stöchiometrie von Lysin-Acetylierung und -Succinylierung ermöglicht eine präzise Bestimmung der Besetzung von posttranslationalen Modifikationen, was für das Verständnis der reversiblen Proteinregulation in Wirkstoffzielwegen entscheidend ist. Diese Methode liefert eine unvoreingenommene, proteomweite Messung von Modifikationsgraden und unterstützt die Zielvalidierung, indem sie biologisch relevante Acylierungsstellen von Hintergrundrauschen unterscheidet. Durch die Bereitstellung stöchiometrischer Daten anstelle von relativen Änderungen der Häufigkeit erhöht sie die Vorhersagesicherheit bei der mechanistischen Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der Besetzung von Acetylierung und Succinylierung an spezifischen Lysinresten.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch präzise Messung der Modifikationsstöchiometrie und Klärung des funktionellen Einflusses auf die Proteinaktivität.
- Prädiktiver Wert: Erhöht das Vertrauen in Zielstrukturen, indem modifizierte Stellen identifiziert werden, die am ehesten die Funktion verändern, und somit die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten unterstützt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem sie Daten zur Acylierungsbesetzung auf Ebene der Bindungsstelle liefert.
- Quantitative Ausgabe: Nutzt Fragmentionen-Peakflächen aus der DIA-MS, um eine genaue, störungsmindernde Quantifizierung zu ermöglichen, die für die Assay-Standardisierung geeignet ist.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Bereitschaft für Screenings durch reproduzierbare, multiplexfähige proteomische Analyse von Acetylierung und Succinylierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die modifikationsprofilerende Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung, indem krankheitsrelevante Acylierungsstellen identifiziert werden.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Konzentriert sich auf den Vorhersagewert, indem die Stöchiometrie aus Peptiden mit mehreren Lysinresten bestimmt wird, was eine standortspezifische Auflösung ermöglicht.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem aufgezeigt wird, welche Lysinmodifikationen funktionell bedeutsam und welche stochastisch sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis hin zur Lead-Identifizierung und liefert stöchiometrische Daten zu Acetylierung und Succinylierung, die zum mechanistischen Verständnis sowie zu den Effekten von Verbindungen auf die Proteinfunktion beitragen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem die Besetzung ortsspezifischer Modifikationen als Reaktion auf Störungen quantifiziert wird.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, quantitative Messung von Modifikationsgraden in proteomweiten Proben.
- Analytik: Liefert präzise stöchiometrische Messungen mittels Quantifizierung von Fragmentionen in der DIA-MS, wodurch eine genaue Vergleichbarkeit von Modifikationszuständen gewährleistet ist.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem Acylierungsstellen mit hoher Besetzung identifiziert werden, die als Biomarker oder mechanistische Endpunkte dienen könnten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare proteomweite Methode zur konsistenten Profilierung posttranslationaler Modifikationen über verschiedene Projekte und Zielstrukturen hinweg.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet Vorhersagesicherheit durch genaue stöchiometrische Bestimmung von Acetylierungs- und Succinylierungsstellen auf Ebene einzelner Standorte und verringert so mechanistische Unklarheiten bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch DIA-MS- und Skyline-basierte Quantifizierung und minimiert damit technische Variabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem hochbesetzte, funktionell relevante Modifikationsstellen identifiziert werden, wodurch biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf funktionalen Hinweisen, die auf Modifikationen beruhen.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt Expertise in der massenspektrometriebasierten Proteomik und PTM-Anreicherungstechniken.
- Hängt von DIA-fähigen Messgeräten und der Erstellung spektraler Bibliotheken für eine genaue Quantifizierung der Fragmentionen ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenvorbereitung und chemischen Acylierungsprotokollen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn der Workflow auf unterschiedliche Modellsysteme oder Gewebetypen angewendet wird.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen hinsichtlich der Peptidnachweisbarkeit und der Zugänglichkeit von Lysinresten in komplexen Gemischen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
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Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
