Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, adulte Skelettmuskel-Satellitenzellen mittels Immunfluoreszenz zu identifizieren. Diese Methode kann zentrale Fragen zur Anzahl und Verteilung von Muskelstammzellen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen beantworten. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass man Muskelstammzellen in ihrer physiologischen Umgebung mit nur begrenzter Manipulation identifizieren kann.

Faiza Naz, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Bereiten Sie zunächst ein Flüssigstickstoffbad vor, indem Sie flüssigen Stickstoff in einen Dewargefäß gießen. Gießen Sie anschließend 10 Milliliter Methylbutan in ein 20-Milliliter-Kunststoffbecherglas und überführen Sie das Becherglas in das Flüssigstickstoffbad.

Legen Sie den präparierten Musculus tibialis anterior auf die flache Oberfläche eines kleinen Spritzenkolbens aus Kunststoff. Bedecken Sie anschließend den präparierten Muskel mit ein paar Tropfen Optimum Cutting Temperature Compound oder O.C.T. Nehmen Sie das Becherglas mit Methylbutan aus dem Flüssigstickstoffbad und tauen Sie die Oberfläche mit den Griffen einer Schere auf. Tauchen Sie das mit O.C.T. bedeckte Gewebe schnell in das geschmolzene Methylbutan, um es einzufrieren.

Als nächstes lösen Sie das eingebettete Gewebe mit einer Pinzette vom Kolben und übertragen es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen im flüssigen Stickstoff. Um mit dem Kryostatenschnitt zu beginnen, geben Sie einen Tropfen O.C.T.COMPOUND auf die Mitte des Probenhalters eines Kryostaten und lassen Sie ihn teilweise erstarren.

Stecken Sie dann das eingebettete Gewebe mit der Knöchelseite nach unten und der Knieseite nach oben in die O.C.T.-Verbindung. Montieren Sie anschließend den Probenhalter auf den Kryostaten und schneiden Sie das Gewebe im Abstand von 10 Mikrometern. Sammeln Sie vier bis acht Kryosektionen auf jedem frostbeschichteten Objektträger.

Trocknen Sie die Schnitte drei Stunden lang bei Raumtemperatur, sammeln Sie die Objektträger dann in einer Objektträgerbox und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie als Nächstes einen Objektträger aus der Objektträgerbox und erwärmen Sie ihn auf Raumtemperatur. Verwenden Sie dann einen Flüssigkeitsblocker-Stift, um einen Bereich um die Kryosektionen herum zu markieren, um zu verhindern, dass Flüssigkeiten von der Seite abfließen.

Geben Sie in einem Abzug 300 bis 500 Mikroliter 4%-Paraformaldehyd in die markierte Stelle. Inkubieren Sie den Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Abschnitte zu fixieren. Spülen Sie anschließend das Paraformaldehyd mit PBS in einem Objektträgerbehälter vom Objektträger ab.

Um mit der Antigengewinnung zu beginnen, füllen Sie einen Objektträgerbehälter mit 200 Millilitern Citratpuffer und geben Sie den Objektträger in den Behälter. Übertragen Sie dann den Objektträgerbehälter für 10 Minuten unter hohem Druck in einen Schnellkochtopf. Der Schritt der Antigen-Entnahme ist optional, wenn die Schnitte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur getrocknet und sofort fortgesetzt werden.

Dann ist der Schritt der Antigen-Entnahme nicht erforderlich. Werden die Schnitte jedoch länger als drei Stunden bei Raumtemperatur getrocknet und dann bei minus 80 Grad Celsius gelagert, ist der Schritt der Antigen-Entnahme erforderlich. Kühlen Sie anschließend den Objektträgerbehälter 10 Minuten lang unter fließendem Wasser ab.

Füllen Sie dann den Objektträger in einen neuen Behälter mit 200 Millilitern PBST um und spülen Sie ihn mit PBST aus. Geben Sie wassergetränkte Labortücher in das Tablett, markieren Sie dann den gespülten Objektträger mit einem PAP-Stift und legen Sie ihn in das Tablett. Geben Sie 200 Mikroliter Blocklösung in den Objektträger.

Dann das Tablett abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Der Blockierungsschritt ist sehr wichtig, da es sich bei dem verwendeten Pax7-Antikörper um einen monoklonalen Maus-Antikörper handelt. Der Maus-auf-Maus-Blockierungsschritt reduziert die unspezifischen Bindungen.

Spülen Sie dann den Objektträger mit PBST in den Objektträgerbehälter und legen Sie ihn wieder in das Tablett zurück. Geben Sie 200 Mikroliter Primärantikörpermischung in den Objektträger und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie anschließend den Objektträger mit PBST aus, fügen Sie dann 200 Mikroliter Sekundärantikörpermischung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Spülen Sie den Objektträger nach der Inkubationszeit mit PBST aus. Verdünnen Sie DAPI in einem Objektträgerbehälter und inkubieren Sie den Objektträger drei Minuten lang in dem Behälter. Spülen Sie dann den DAPI fünf Minuten lang mit PBST aus.

Montieren Sie abschließend die Folie mit Montagemedium und bringen Sie ein Deckglas an. In dieser Studie gelingt es, Satellitenzellen in adulten Ruhemuskelschnitten unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Das Hintergrundrauschen, das normalerweise bei erwachsenem Muskelgewebe und bestimmten Arten von Fasern auftritt, wird durch den Einsatz von Maus-auf-Maus-Blockaden reduziert.

Die spezifischen Immunfärbesignale werden durch die Verwendung von Sekundärantikörpern verstärkt, die mit hellen Alexa-Farbstoffen konjugiert sind. Ein konfokales Zwei-Photonen-Mikroskop nimmt im Vergleich zum Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop ein schärferes Bild auf. Das gleiche Protokoll kann auch auf Muskelgewebe von juvenilen Mäusen, Mausembryonen und verletzten adulten Muskelgeweben angewendet werden.

Sowohl juveniles als auch embryonales Muskelgewebe weisen stärker aktivierte Satellitenzellen oder myogene Pax7-Vorläufer mit relativ größeren Zellkernen auf. Dadurch wird es einfacher, die Satellitenzellen jüngerer Mäuse sichtbar zu machen als die von erwachsenen Mäusen. Im verletzten Muskelgewebe sind mehr aktivierte Pax7-positive Zellen sichtbar.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Rauschen durch Autofluoreszenz und unspezifische Maus-zu-Maus-Immunbindung nicht vollständig eliminiert werden kann, aber mit diesem Protokoll kann das Rauschen weitgehend reduziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Satellitenzellen in Muskelkryosektionen identifiziert.