Name: Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Messung des mitochondrialen Calcium-Zuflusses in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Diese Protokolle nutzen Plattenleser- und Konfokalmikroskopie-Techniken für die Calcium-Signalisierung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus American Heart Association (J.Q.K.).

Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Emory University genehmigt.
Hinweis: Der erste Teil ist die Versuchsdurchführung zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten kardialen Mitochondrien mit einem Teller-Reader.
(1) Reagenzien und Lösungen
<ol><li>500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung zu machen: 225 mM Mannit, 75 mM Saccharose, 4 5 mM-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 1 mM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA), pH auf 7,4 eingestellt mit KOH. Durch einen 0,22-μm-Filter zu sterilisieren und bei 4 ° c Lagern Sicherstellen Sie, dass der MS-EGTA-Puffer vorgekühlt auf 4 ° C vor dem Gebrauch ist.</li>
	<li>100 mL KCl Puffer vorzubereiten: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA und pH-Wert auf 7.2 mit KOH eingestellt. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mM Kalzium grün-5N Lager in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Die Kalzium-grün-5N-Aktie kann Aliquotted und bei-20 ° c gelagert</li>
	<li>
Substrate für Ca2 + Aufnahme vorzubereiten.
	<ol>
<li>1 M Natrium Pyruvat, pH 7.4 vorbereiten. Bewahren Sie es an Aliquote bei-20 ° C.</li>
		<li>500 mM Malate, pH 7.4 vorbereiten. Bewahren Sie es an Aliquote bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung der kardialen Mitochondrien
<ol><li>Die Maus nach institutionellen Standards einschläfern. Hinweis: Für unsere institutionell anerkannte Methode der Euthanasie, Mäuse wurden betäubt durch Isofluorane Einatmen und durch zervikale Dislokation geopfert.</li>
	<li>Sammeln Sie Herzen durch Eröffnung der Brusthöhle, schneiden auf beiden Seiten der Rippen entlang flankieren das Herz, die Membran wegschneiden und Herzgewebe besteuert. Hinweis: In diesem Protokoll erfolgt mitochondriale Isolierung aus ganzem Herzen gesammelt von einer Erwachsenen Maus (ca. 120 mg), die was für 3-4 Versuche ausreichen sollte. Für mitochondriale isoliert von anderen Mitochondrien-reichen Geweben wie der Leber kann bis zu 200 mg des Gewebes nach dem beschriebenen Protokoll verwendet werden.</li>
	<li>Spülen Sie das Gewebe gründlich in 25 mL eiskaltes 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) um sicherzustellen, dass alles Blut aus den Herzkammern herausgedrückt wird. Hinweis: Das Herz wird ausreichend gespült werden, wenn die Flüssigkeit aus dem Herzen drückte klar ausgeführt wird.</li>
	<li>Hacken Sie das Herz in kleine Stücke in 5 mL eiskaltes 1 X PBS mit einer scharfen Schere.</li>
	<li>Verwerfen der PBS und Hackfleisch Herzgewebe zu einem vorgekühlt 7 mL Glas-Teflon Dounce Homogenisator mit 0,10 bis 0,15 mm Spiel zu übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL eiskaltes MS-EGTA-Puffer und homogenisieren Sie Probe zu, bis Gewebe Stücke nicht mehr sind sichtbar (ca. 11 Striche). Hinweis: Nicht das Gewebe zu homogenisieren, als das Ziel ist intakte und funktionsfähig Mitochondrien zu erhalten.</li>
	<li>Übertragen Sie das Homogenat auf eine 15 mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Homogenat 600 X g bei 4 ° C für 5 min zum pellet-Kerne und ungebrochene Zellen.</li>
	<li>Den überstand auf eine frische 15 mL Tube übertragen und bei 10.000 x g bei 4 ° C für 10 min in Mitochondrien pellet Zentrifugieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand und halten Sie die mitochondriale Pellet auf Eis.</li>
	<li>Waschen Sie die mitochondriale Pellet zweimal mit eiskalten MS-EGTA-Puffer. Für jede Wäsche Aufschwemmen der mitochondrialen Pellets in 5 mL MS-EGTA Puffer, bei 10.000 x g bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren und den überstand verwerfen.</li>
	<li>Nach der letzten Wäsche überstand verwerfen und Aufschwemmen der Mitochondrien in 100 μL des Eis kalt MS-EGTA-Puffer. Halten Sie die Mitochondrien auf Eis. Hinweis: Mitochondrien sollte für Experimente innerhalb 1 h verwendet werden.</li>
	<li>Mitochondriale Proteinkonzentration mit einem Bradford Protein Assay-26zu messen.</li>
</ol>3. Platte Leser-basierte Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme
Hinweis: Hier ist es beschrieben das Protokoll für die Analyse der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme mit einem multimode-Platte-Reader mit Injektoren ausgestattet. Jede Platte Leser mit der Fähigkeit des Lesens Kalzium grün-5N Fluoreszenz (Anregung/Emission von 506/532 nm) in einem kinetischen Modus mit automatisierten Reagenz Injektoren, die Reaktion vor Licht geschützt zu halten verwendet werden können.
<ol><li>Programm der Platte Leser eine kinetische durchführen von Kalzium grün-5N Fluoreszenz mit Messungen pro Sekunde für eine gesamte Assay 1.000 lesen s. zusätzlich, Reagenz Injektoren, 5 μL CaCl2 -Lösung auf die 30 zu verzichten-Programm s, 150 s, 300 s , 480 s und 690 s Zeitpunkten. Hinweis: Der Zeitplan für das CaCl2 Injektionen sind benutzerdefiniert und experimentelle Bedürfnissen angepasst werden können.</li>
	<li>Erstklassige Reagenz Injektoren mit CaCl2 -Lösung verwendet werden. Hinweis: Die Konzentration der CaCl2 -Lösung ist benutzerdefiniert und in nachfolgenden Ausführungen zu den Betrag von Ca2 + erforderlich, um MPTP Öffnung auszulösen titrieren eingestellt werden kann.</li>
	<li>Geben Sie 200 μg der Mitochondrien in einer einzelnen einer 96-well-Platte.</li>
	<li>Geben Sie das entsprechende Volumen der KCl-Puffer in der, so dass das Gesamtvolumen der Mitochondrien und KCl Puffer um 197 μL geht.</li>
	<li>Die Mitochondrien-Mischung 1 μL 1 M Pyruvat und 1 μL von 500 mM Malate hinzufügen. Pipettieren sanft zu mischen, und inkubieren der Mitochondrien mit der Substrate für 2 min bei Raumtemperatur erlauben Mitochondrien um erregt zu werden.</li>
	<li>Fügen Sie 1 μl 1 mM Kalzium grün-5N bestand. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren. Hinweis: Schützen Sie die Reaktion von Licht nach Zugabe von Kalzium grün-5N Farbstoff.</li>
	<li>Starten Sie die vorprogrammierte kinetische Protokoll und Monitor Kalzium grün-5N Fluoreszenz.</li>
</ol>(4) Reagenzien und Lösungen
Hinweis: Der zweite Teil ist Experimentelles Verfahren für die konfokale Bildgebung der mitochondrialen Ca2 + in kultivierten Zellen
<ol><li>Tyrode Lösung (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Glukose und 10 mM HEPES, pH 7,2 mit KOH) zu machen. Bei 4 ° c Lagern Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>Waschlösung (100 mM Kalium Acetat, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM Phosphokreatin, 10 mM HEPES, pH 7,2 mit KOH) vorzubereiten. Bei 4 ° c Lagern Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung, enthält 0,005 % Saponin in Waschlösung. Bereiten sie täglich frisch.</li>
	<li>Bereiten Sie 0 Ca2 + interne Lösung (100 mM Kalium Acetat, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH-Wert auf 7,2 mit KOH eingestellt). Bei 4 ° c Lagern Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>Bereiten Sie interne Lösung mit Ca2 +. Die interne Lösung über fügen Sie CaCl2 erreichen die gewünschte Konzentration von freien Ca2 hinzu +. Die Höhe der CaCl2 hinzufügen wird berechnet mit dem MaxChelator-Programm (maxchelator.stanford.edu).</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mM Rhod-2/AM Lager in DMSO und bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mM MitoTracker Grüne Lager in DMSO und bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern.</li>
</ol>5. Beschichtung Zellen für die Bildgebung
<ol><li>22 x 22 cm2 Glasdeckgläser mit 100 % Ethanol waschen und Deckgläsern an der Luft trocknen lassen.</li>
	<li>Legen Sie die Glasdeckgläser in einzelnen Vertiefungen der Gewebekultur 6-Well Platte. Hinweis: Deckgläsern können mit Laminin, Poly-L-Lysin oder ähnliche Matrix zur Förderung Zellhaftung beschichtet werden.</li>
	<li>Trypsinize und Platte der Zellen auf den Deckgläsern für ca. 70 % Zusammenfluss mit dem Ziel, am Tag der Bildgebung.</li>
</ol>6. Laden Zellen mit dem Rhod-2/AM und MitoTracker Green
<ol><li>Bereiten Sie Rhod-2/AM-MitoTracker green funktionierende Lösung. Fügen Sie 20 μL Rhod-2/AM 1 mM Lager, 0,2 μl MitoTracker Grün 1 mM Lager und 2,5 μL 20 % Pluronic F-127 zu 1 mL der Tyrode Lösung. Die Endkonzentration von Rhod-2 in die Arbeitslösung 20 µM und die Endkonzentration von MitoTracker Green 200 nM.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Wachstumsmedium aus dem Deckglas. Hinweis: Ein Waschschritt ist nicht vor dem Farbstoff Lösung zusätzlich notwendig.</li>
	<li>Fügen Sie die Rhod-2/AM-MitoTracker grüne Lösung tropfenweise Weise auf das Deckglas bis das Deckglas gerade ist bedeckt (ca. 3-4 Tropfen pro Deckglas).</li>
	<li>30 min bei Raumtemperatur, damit die Zellen mit den Farbstoffen laden lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>De-esterify Rhod-2/AM. Entfernen Sie vorsichtig die Rhod-2/AM-MitoTracker grüne Lösung, mit frischen Raumtemperatur Tyrode-Lösung zu ersetzen, und inkubieren Sie es für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden.</li>
</ol>(7) confocal Imaging der mitochondrialen Rhod-2/AM und MitoTracker Green Fluoreszenz
<ol><li>Übertragen Sie das Deckglas auf dem Mikroskop imaging Kammer und füllen Sie die Kammer mit Waschlösung.</li>
	<li>Stellen Sie unter Einstellungen für die Beobachtung von Zellen im Phasenkontrast bei 40 X die Bildschärfe bis Zellen sichtbar sind und im Fokus.</li>
	<li>
Permeabilize der Plasmamembran von Rhod-2/AM-MitoTracker Green geladen Zellen, Zytosol lokalisiert Rhod-2, unter Beibehaltung der Mitochondrien lokalisiert Farbstoff zu entfernen.
	<ol>
<li>Entfernen Sie die Waschlösung aus dem Deckglas.</li>
		<li>Ersetzen Sie es durch Permeabilisierung Lösung für ca. 1 min.</li>
		<li>Überwachen Sie visuell die Plasmamembran Morphologie im gesamten Permeabilisierung Prozess. Permeabilized Zellen entwickeln eine aufgeraute Oberfläche.</li>
		<li>Wenn Permeabilisierung abgeschlossen ist, sofort entfernen Sie die Permeabilisierung Lösung und ersetzen Sie es mit 0 Ca2 + interne Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gleichzeitig Bild Rhod 2 Fluoreszenz (Anregung mit dem 559 nm Laserlinie und Emission gesammelt bei Wellenlängen zwischen 575-675 nm) und MitoTracker grüne Fluoreszenz (Anregung mit 488nm Laserlinie und Emission bei Wellenlängen zwischen gesammelt 505-525 nm). Fokus auf permeabilized Zellen anzeigen eine klare ns1 Rhod-2 und MitoTracker grün.</li>
	<li>Verringern des Mikroskop-Lasers und gain-Einstellungen so, dass die mitochondriale Rhod 2 Fluoreszenz dim und gerade noch sichtbar ist.</li>
	<li>Wählen Sie Mikroskop Einstellungen, 2-dimensionale Scans auf einem entsprechenden Frame Rate und Zeit Platz für die jeweilige Anwendung zu erwerben. Eine Bildrate von 30 Bilder/s wird empfohlen, die Kinetik der Veränderungen der mitochondrialen Ca2 +genau zu erfassen.</li>
	<li>Entfernen Sie die 0 Ca2 + interne Lösung ohne zu stören, die Zellen oder Mikroskop Fokus.</li>
	<li>Starten Sie Bildaufnahme.</li>
	<li>Fügen Sie Ca2 +-vollgestopft interne Lösung bei 10 s zeigen entweder manuell oder mit einem Perfusion System.</li>
	<li>Wählen Sie Regionen von Interesse (ROIs) Regionen des ns1 mitochondriale Rhod-2 bis MitoTracker grün-Signal in der Bild-Datenerfassungs-Software umfassen. Hinweis: Für jede ROI werden willkürlich Fluoreszenz (F) Werte für jeden Zeitpunkt der Aufnahme erzielt. Diese Werte sind Hintergrund subtrahiert und normiert auf die anfängliche Fluoreszenz (vor Ca2 + Zusatz; F0) und im Laufe der Zeit zur Datenpräsentation und Quantifizierung der Amplitude der Änderung der mitochondrialen Ca2 +als F/F0 dargestellt.</li>
</ol>

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Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom. Die Platte Leser-basierte Kalzium grün-5N Methode Monitore Extramitochondrial Ca2 + Ebenen und ist ein Ca2 + Aufnahme Assay, der gut geeignet für Messungen in isolierten Mitochondrien ist. Während wir repräsentative Ergebnisse aus isolierten murinen kardialen Mitochondrien gezeigt haben, kann dieser Assay Mitochondrien isoliert von Geweben mit hoher mitochondriale Fülle einschließlich Leber, Skel...

Mitochondrien sind kritische Websites der intrazellulären Ca2 + -Lager- und Signaltechnik. Jahrzehntelange Forschungen haben gezeigt, dass Mitochondrien die Fähigkeit haben zu importieren und sequester Ca2 + 1,2. Mitochondrien, sind jedoch nicht nur passive Websites von Ca2 + -Lager. Ca2 + auf die mitochondriale Kompartiment führt grundlegende Signalisierung Funktionen einschließlich der Regulierung metabolische Ausgabe und Aktivierung von mitochondrialen vermittelte Zelle Tod wegen, wurde zuvor3überprüft. Für die Stoffwechselregulation erhöht Ca2 + die Aktivität von drei Matrix-lokalisierte Dehydrogenases Tricarboxylic Säure Zyklus sowie die Atmungskette komplexe, Erhöhung der Mitochondrien Energie Produktion4,5 . Mit mitochondrialen Ca2 + Überlastung und Dysregulated mitochondriale Ca2 + Handling Ca2 + Trigger mitochondrialen Permeabilität Übergang pore (MPTP) Öffnung, was zu inneren mitochondrialen Membran Permeabilisierung, Membran Verlustrisiko, mitochondriale Dysfunktion, Schwellungen, Bruch und letztlich Zelle Tod6,7,8,9. Daher wirkt sich mitochondriale Ca2 + Signalisierung direkt zelluläre Leben und Tod Wege durch metabolische Kontrolle und MPTP-Tod-Achse.
In den letzten Jahren, es wurde rasch erweitert Interesse an der Erforschung der mitochondrialen Ca2 + Dynamik im großen Teil zur Identifizierung der molekularen Bestandteile der mitochondrialen Ca2 + Uniporter Komplex, eine mitochondrial Inner Membran-Transporter, der eine primäre Ca2 + ist in der mitochondrialen Matrix 10,11,12importieren. Identifizierung von diesen strukturellen und regulatorischen Untereinheiten der Uniporter hat die Möglichkeit, gezielt genetisch mitochondriale Ca2 + Zustrom zu modulieren, mitochondriale Funktion und Dysfunktion hervorgebracht und erleichtert das Studium der der Beitrag der Uniporter komplex und mitochondriale Ca2 + Zustrom Krankheit13,14,15. In der Tat hat die mitochondriale Ca2 + Signalisierung in den Pathologien von den unterschiedlichsten Krankheiten wie Herzerkrankungen, Neurodegeneration und Krebs16,17,18verwickelt, 19,20.
Angesichts der grundlegenden Bedeutung der mitochondrialen Ca2 + signalisieren in den Stoffwechsel und Zelltod und kombiniert mit der großen Reichweite von biologischen Systemen auswirkt, mitochondriale Ca2 + Signalisierung, Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom von großem Interesse sind. Nicht überraschend, wurden eine Vielzahl von Techniken und Instrumenten zur mitochondrialen Ca2 + Messung entwickelt. Dazu gehören Methoden, die nutzen Sie Tools wie z. B. fluoreszierende Ca2 +-empfindlichen Farbstoffen21,22 und genetisch codierte Ca2 + Sensoren gezielt zu den Mitochondrien, wie z. B. Cameleon und Aequorin23, 24. Das Ziel dieses Artikels ist, markieren Sie verschiedene Methoden und Modellsysteme in denen mitochondrialen Ca2 + Aufnahme gemessen werden kann. Wir präsentieren zwei experimentelle Methoden zur Beurteilung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom Kapazität. Mit kardialen Mitochondrien als Beispiel, wir ausführlich eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N, die ideal geeignet ist für isolierte Gewebe Mitochondrien14 . Mit kultivierten Zellen der NIH-3 t 3, erläutern wir im folgenden eine konfokalen Mikroskopie Imaging-basierte Test zur Messung der mitochondrialen Ca2 + in permeabilized Zellen mit der Ca2 + sensibler Farbstoff Rhod-2/AM25.

<table><tbody><tr><td>Olympus FV1000 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Multimode-Mikroplatten-Reader mit Injektoren</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Homogenizer</td><td>Kimble</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Deckgläser</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6 Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Calcium grün-5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker grün FM</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>L-Apfelsäure</td><td>Sigma</td><td>M1125</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Fisher</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat Magnesiumsalz</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Phosphokreatin Dinatriumsalz</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>Calbiochem</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

analysen der mitochondrialen calcium zustrom in isolierten mitochondrien und kultivierten zellen

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2 + Handhabung durch Mitochondrien ist eine kritische Funktion reguliert physiologische und pathophysiologische Prozesse in einem breiten Spektrum von Zellen. Die Fähigkeit, genau den Zustrom und Ausfluss von Ca2 + von Mitochondrien zu messen ist wichtig für die Bestimmung der Rolle der mitochondrialen Ca2 + Umgang in diesen Prozessen. In diesem Bericht stellen wir Ihnen zwei Methoden zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Handhabung in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Wir beschreiben zunächst eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme über die Ca2 + sensibler Farbstoff Kalzium grün-5N. Leser-basierte Plattenformat umgeht die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung und Kalzium grün-5N Farbstoff ist ideal geeignet zur Messung von Ca2 + aus isolierten Gewebe Mitochondrien. Für unsere Anwendung beschreiben wir die Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme in den Mitochondrien von Herzgewebe Maus isoliert; Allerdings kann dieses Verfahren angewendet werden, zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme in den Mitochondrien isoliert von anderen Geweben wie z. B. Leber, Skelettmuskel und Gehirn. Zweitens, beschreiben wir eine konfokale Mikroskopie-basierten Test zur Messung der mitochondrialen Ca2 + in permeabilized Zellen mithilfe des Ca2 + sensibleren Farbstoffs Rhod-2/AM und imaging mit 2-dimensionale Laserscanning-Mikroskopie. Dieses Protokoll Permeabilisierung beseitigt cytosolischen Farbstoff Kontamination, spezifische Aufzeichnung der Veränderungen der mitochondrialen Ca2 +ermöglicht. Laserscanning-Mikroskopie ermöglicht darüber hinaus hohe Bildraten erfassen schnelle Veränderungen mitochondrialen Ca2 + als Reaktion auf verschiedene Medikamente oder Reagenzien in die externe Lösung angewendet. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um mitochondrialen Ca2 + Aufnahme in vielen Zelltypen, einschließlich Primärzellen wie kardialen Myozyten Neuronen und immortalisierte Zelllinien zu messen.

Abbildung 1 zeigt mitochondriale Ca2 + Aufnahme Messungen in isolierten kardialen Mitochondrien mit der Platte Leser-basierte Plattform und die Ca2 + Kalzium grün-5N färben. Unter Kontrolle Bedingungen (Abbildung 1A), kardialen Mitochondrien in KCl-Puffer, enthält Kalzium grün-5N ausgesetzt waren und dann vor der Herausforderung, sequentielle Impulse von CaCl2 (5 μl einer 0,6 mm CaCl2 -...

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca2 + Import Assay mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca2 + Farbstoffs Rhod-2/AM.

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den mitochondrialen Kalziumeinstrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Kalziumsignalgebung zu beantworten, z. B. wie Mitochondrien zur Gestaltung der zytosolischen Kalziumlandschaft beitragen und welche Rolle die mitochondriale Kalziumdynamik bei Krankheitszuständen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass unsere Protokolle an eine Vielzahl von Modellsystemen angepasst werden können, um die mitochondriale Kalziumeinflusskapazität zu beurteilen.Ich werde das auf Plattenlesern basierende Verfahren zur mitochondrialen Kalziumaufnahme demonstrieren. Und Dr. Joshua Maxwell, Dozent in der Abteilung für Pädiatrie, wird das konfokalmikroskopische Verfahren zur Messung des mitochondrialen Kalziumeinstroms demonstrieren. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie das zuvor isolierte Herz gründlich mit 25 Millilitern eiskaltem one-X PBS spülen und darauf achten, dass das Blut vollständig aus den Ventrikeln herausgedrückt wird.In fünf Millilitern eiskaltem one-X PBS mit einer scharfen Schere das Herzgewebe in kleine Stücke zerkleinern. Entsorgen Sie das PBS vorsichtig und geben Sie das Gewebe in einen vorgekühlten Sieben-Milliliter-Glas-Teflon-Dounce-Homogenisator. Dann fünf Milliliter eiskalten MSEGTA-Puffer hinzufügen und homogenisieren, bis keine Gewebestücke mehr sichtbar sind.Übertragen Sie das Homogenat in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es dann fünf Minuten lang bei 600 mal G bei vier Grad Celsius, um unerwünschte Kerne und unzerbrochene Zellen zu pelletieren. Den Überstand in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen und 10 Minuten lang bei 10.000 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, bewahren Sie das mitochondriale Pellet auf Eis auf.Um das Pellet zu waschen, fügen Sie fünf Milliliter eiskalten MSEGTA-Puffer hinzu, resuspendieren Sie es und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei 10.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, wiederholen Sie den Waschgang und halten Sie das Pellet auf Eis. Um die Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme mit einem Plattenlesegerät zu starten, programmieren Sie das Lesegerät so, dass es jede Sekunde für eine Gesamtzeit von 1.000 Sekunden eine kinetische Messung der Calciumgrün-5N-Floreszenz durchführt.Programmieren Sie die Reagenzinjektoren so, dass sie fünf Mikroliter Calciumchloridlösung zu verschiedenen Zeitpunkten abgeben. Grundieren Sie dann die Injektoren mit der zu verwendenden Calciumchloridlösung. Als nächstes fügen Sie 200 Mikrogramm isolierter Mitochondrien in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu und fügen Sie das entsprechende Volumen Kaliumchloridpuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 197 Mikrolitern zu erreichen.Fügen Sie dann einen Mikroliter eines molaren Pyruvats, einen Mikroliter 500-millimolares Malat und einen Mikroliter ein millimolare Calciumgrün-5N-Brühe hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren Sie zwei Minuten lang lichtgeschützt bei Raumtemperatur, damit die Mitochondrien mit Energie versorgt werden. Starten Sie abschließend das vorprogrammierte kinetische Protokoll und überwachen Sie die Calcium Green-5N-Blüte.Für diesen Teil des Protokolls bereiten Sie Rhod-2 AM MitoTracker Green Arbeitslösung vor, indem Sie 20 Mikroliter Rhod-2 AM, 0,2 Mikroliter MitoTracker Green, 2,5 Mikroliter 20%iges pluronisches F-127 und einen Milliliter Tyrode-Lösung mischen. Geben Sie die Rhod-2 AM MitoTracker Green Lösung auf ein zuvor vorbereitetes Deckglas, das mit NIH/3T3-Zellen beschichtet ist, tropfenweise, bis sie bedeckt ist. Damit die Zellen mit den Farbstoffen beladen werden können, inkubieren Sie das Deckglas 30 Minuten lang lichtgeschützt bei Raumtemperatur.Um Rhod-2 AM zu entestern, entfernen Sie vorsichtig die Rhod-2 AM MitoTracker Green Lösung und ersetzen Sie sie durch ca. 300 Mikroliter frische Tyrodelösung, um die Zellen zu bedecken. Inkubieren Sie das Deckglas lichtgeschützt für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie nun das Deckglas in die Bildgebungskammer des Mikroskops und füllen Sie die Kammer mit Waschlösung.Passen Sie den Fokus an, um die Zellen und den Phasenkontrast bei 40-facher Vergrößerung zu beobachten. Um die Plasmamembran von Rhod-2 AM MitoTracker Green geladenen Zellen zu permeabilisieren, entfernen Sie die Waschlösung vom Deckglas und ersetzen Sie sie durch ca. 300 Mikroliter Permeabilisierungslösung, um die Zellen zu bedecken. Überwachen Sie die Morphologie der Plasmamembran während dieses Prozesses.Bei der Permeabilisierung entwickeln die Zellen eine aufgeraute Oberfläche. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung sofort nach vollständiger Permeabilisierung und ersetzen Sie sie durch eine kalziumfreie interne Lösung. Als nächstes konzentrieren Sie sich auf permeabilisierte Zellen, die eine klare Kolokalisation von Rhod-2 und MitoTracker Green aufweisen, um die gleichzeitige Fluoreszenz von Rhod-2 und Mitotracker Green abzubilden.Verringern Sie als Nächstes den Mikroskoplaser und die Verstärkungseinstellungen, um die mitochondriale Rhod-2-Blüte dunkel und kaum sichtbar zu machen. Um die Kinetik mitochondrialer Kalziumveränderungen zu erfassen, wählen Sie die Mikroskopeinstellungen, um zweidimensionale Scans mit einer geeigneten Bildrate und einem angemessenen Zeitverlauf zu erfassen. Entfernen Sie die kalziumfreie interne Lösung, achten Sie darauf, die Zellen und den Mikroskopfokus nicht zu stören, und beginnen Sie dann mit der Bildaufnahme.Geben Sie mit einer Spritze manuell eine kalziumreiche interne Lösung zum Zeitpunkt von 10 Sekunden hinzu. Wählen Sie schließlich in der Bilderfassungssoftware interessante Bereiche aus, um Bereiche der Co-Lokalisierung von Rhod-2 und MitoTracker Green Signal einzuschließen. Wenn Calciumchlorid zu isolierten kardialen Mitochondrien hinzugefügt wird, nimmt die Fluoreszenz des Calciumfarbstoffs zu, da die Mitochondrien Calcium aus dem Pufferfloreszenz aufnehmen.Bei der dritten Auflage von Calcium beginnt die Blütenpracht jedoch nach einem Tropfen plötzlich zuzunehmen, was auf eine mitochondriale Calciumüberladung und eine Porenöffnung des Übergangs der mitochondrialen Permeabilität hinweist, was zu einer Permeabilisierung der mitochondrialen Innenmembran führen kann. Auf der anderen Seite, wenn Mitochondrien mit einem Inhibitor der mitochondrialen Kalziumaufnahme vorbehandelt werden, kommt es nach jeder Kalziumzugabe zu einer Zunahme der Blütenblüte. In kultivierten NIH/3T3-Zellen wird das mitochondriale Netzwerk mit dem Farbstoff MitoTracker Green gefärbt.Die Zellen werden ebenfalls mit dem Rhod-2-Farbstoff gefärbt und nach der Saponin-Permeabilisierung wird das zytosolische Rhod-2 weggespült, so dass nur die mitochondriale Färbung übrig bleibt, die mit dem MitoTracker kolokalisiert ist. Da sich Rhod-2 in nicht-mitochondrialen Strukturen anreichern kann, sollte sich die Analyse nur auf Regionen konzentrieren, in denen MitoTracker und Rhod-2 kolokalisieren. Die Zugabe von Calcium führt zu einer Erhöhung der Rhod-2-Fluoreszenz in Kontrollzellen, während es in Zellen, die mit dem Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme behandelt wurden, keine Veränderung der Fluoreszenz gibt.Diese Protokolle können angewendet werden, um die mitochondriale Kalziumaufnahme in vielen Zelltypen zu messen, einschließlich Primärzellen wie Herzmyozyten und Neuronen in immortalisierten Zelllinien sowie isolierter Mitochondrien aus vielen Gewebetypen wie Herz, Leber und Gehirn. Die Kalziumverarbeitung durch die Mitochondrien ist eine kritische Funktion, die sowohl physiologische als auch pathophysiologische Prozesse in verschiedenen Zellen reguliert. Die Fähigkeit, den Einstrom von Kalzium aus den Mitochondrien genau zu messen, ist ein wichtiger Teil der Bestimmung der Rolle des mitochondrialen Kalziumumgangs in diesen Prozessen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den mitochondrialen Kalziumeinstrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen misst.

analyses-mitochondrial-calcium-influx-isolated-mitochondria-cultured

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf Plattenlesern basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien. Der Assay analysiert das Fluoreszenzsignal eines kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, um die Kinetik der mitochondrialen Kalziumaufnahme und der Kalziumüberladung zu untersuchen.

Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf konfokaler Mikroskopie basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in kultivierten Zellen. Der Assay verwendet den calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhod-2/AM zur Messung des mitochondrialen Calciums in permeabilisierten kultivierten Zellen.

Calcium-Influx-Assay zur Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme in kultivierten Zellen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Kalziumretentionskapazität durch Überwachung von Echtzeitänderungen der Fluoreszenz bei der Kalziumaufnahme der Mitochondrien. Dieser Assay ist nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Funktion und kalziumbezogener Prozesse, einschließlich Apoptose und neurodegenerativer Erkrankungen.

Bestimmung des Calciumretentionsvermögens isolierter Mitochondrien

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von cryoanalytical Elektronenmikroskopie auf die quantitative Messung der Gesamtkalziumgehalt und die Verteilung auf subzellulärer Auflösung in physiologisch definierte biologische Proben.

Messung des Gesamtcalciums in Neuronen, die durch Elektronensonden-Röntgenmikroanalyse

Der Vergleich des mitochondrialen Membranpotentials zwischen Proben liefert wertvolle Informationen über den zellulären Status. Detaillierte Schritte zur Isolierung von Mitochondrien und zur Beurteilung des Ansprechens auf Inhibitoren und Entkoppler mittels Fluoreszenz werden beschrieben. Die Methode und der Nutzen dieses Protokolls werden anhand eines Zellkultur- und Tiermodells für zellulären Stress veranschaulicht.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Diese Methode nutzt den Beitrag der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zum Protonenleck mit niedriger Leitfähigkeit, um die Spannungsschwelle für die Porenöffnung bei neonatalen Fragile-X-Syndrom-Mäusen mit erhöhtem mitochondrialem Coenzym-Q-Gehalt im Vergleich zur Wildtypkontrolle zu bestimmen.

Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses

Erfahren Sie Methoden zur Messung des mitochondrialen Calcium-Zuflusses in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Diese Protokolle nutzen Plattenleser- und Konfokalmikroskopie-Techniken für die Calcium-Signalisierung.

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

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