Name: Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Insel-Autoantikörper mit hochsensitiven Elektrochemilumineszenz-Assays nachweisen. Diese nicht-radioaktive Methode ermöglicht die frühzeitige Vorhersage von Typ-1-Diabetes und lässt sich auf andere Autoimmunerkrankungen übertragen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R zu gewähren.

1. Puffer Vorbereitung
<ol><li>Puffer (2 X PBS, pH 7,9) Beschriftung: In 400 mL entionisiertem Wasser (DD), 100 mL 10 X PBS hinzugeben, pH bis 7,9 mit NaOH einstellen.</li>
	<li>3 mM von Biotin: 1 mg Biotin in 588 µL Puffer Kennzeichnung zu lösen.</li>
	<li>3 mM von Sulfo-Tag: auflösen 150 Nmol Sulfo-Tags in 50 µL Puffer bezeichnen.</li>
	<li>Antigen-Puffer (5 % BSA): In 500 mL 1 X PBS, 25 g des Bovine Serum Albumin (BSA) hinzufügen.</li>
	<li>0,5 M Essigsäure Lösung ansetzen.</li>
	<li>1,0 M Tris-HCl-Puffer pH 9.0: bereiten Sie 1 M Tris-HCl-Puffer, und passen Sie pH bis 9.0 mit HCl.</li>
	<li>Beschichtung-Puffer (3 % Blocker A): In 500 mL 1 X PBS, 15 g Blocker A. hinzufügen</li>
	<li>Waschen-Puffer (0,05 % Tween 20, PBST): In 5000 mL 1 X PBS, 2,5 mL Tween 20 hinzugeben.</li>
	<li>Lesung-Puffer (2 x lesen Puffer T mit Tensid): Add-in DD-Wasser 500 mL, 500 mL 4 x lesen Puffer T mit Tensid (Table of Materials).</li>
	<li>Lagern Sie Biotin und Sulfo-Tag in einem Gefrierschrank-20 ° C. Hinweis: Beide Biotin und Sulfo-Tag Lösungen sollte immer frisch zubereitet werden, kurz vor der Kennzeichnung Verfahren.</li>
</ol>2. Bezeichnung der menschlichen Inselchen Autoantigen mit Biotin und Sulfo-tag
Hinweis: Eine hohe Konzentration des Antigens, ≥0.5 mg/mL, empfiehlt sich für eine effizientere Kennzeichnung Reaktion.
<ol><li>Bestimmen Sie das molare Verhältnis von menschlichen Inselchen Autoantigen für Biotin und Sulfo-Tag.<ol>
<li>Erhalten Sie die Antigen molare Zahl dividiert das Antigen Gewicht durch das Molekulargewicht.</li>
		<li>Verwenden Sie das molare Verhältnis von 1:5 für das Antigen mit kleineren Molekulargewicht (≤10 kd) und das molare Verhältnis von 01:20 für das Antigen mit größeren Molekulargewicht (> 50 kd).</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen für Biotin oder Sulfo-Tag, indem Sie die molare Anzahl durch seine Konzentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie die menschliche Inselchen Autoantigen mit Biotin oder Sulfo-Tag mit das molare Verhältnis von 1:5. Hinweis: Das Protein in Tris oder Glycin Puffer-Systemen ausgetauscht werden, 2 x PBS-Puffer mit pH 7,9 mit der Dimensionierung Spin Spalte.</li>
	<li>Da Biotin und Sulfo-Tag lichtempfindlich sind, decken Sie die Reaktionsgefäße mit Alu-Folie. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.</li>
	<li>Während der Inkubation die Spin-Spalte prime durch Abgabe 2 x PBS-Puffer in der Spalte dreimal. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 X g 2 min. lang jedes Mal. Hinweis: Derzeit die Kennzeichnung Reaktion durch Überbrückung, vollzieht sich immer noch und muss gestoppt werden.</li>
	<li>Stoppen Sie die Kennzeichnung Reaktion durch die Reinigung der beschriftete menschliche Inselchen Autoantigen. Zu reinigen, passieren Sie die Autoantigen durch die Spin-Spalte und Zentrifugieren Sie die Spalte bei 1000 X g für 2 min.</li>
	<li>Die beschriftete Antigenkonzentration (µg/µL) mit der Menge an Antigen-Protein und das Endvolumen zu bestimmen. Hinweis: Rund, es werden 90-95 % Beibehaltung der beschriftete Antigen nach jedem Spin-Spalte übergeben.</li>
	<li>Aliquoten das beschriftete Antigen und Store beschriftete Antigen bei-80 ° C.</li>
</ol>3. definieren Sie die besten Konzentrationen und Kennzahlen für die zwei beschriftete Antigene für den Assay (Checker Board Assay)
<ol><li>Bereiten Sie zwei Serumproben, eine hohe Positive und eine negative, mit einem Gesamtvolumen von 200 µL für jeden.</li>
	<li>Aliquoten 4 µL Serum und 1 X PBS hinzufügen, bis der letzte Band 20 µL pro Bohrloch für eine 96-Well-PCR-Platte ist. Verwenden Sie die Hälfte einer Platte für die hohe positive Probe und die andere Hälfte für das negativ-Beispiel, wie in Abbildung 2Agezeigt.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL von Biotin und 10 µL Sulfo-Tag Antigen und Verhalten Verdünnungsreihen für die zwei unterschiedlich beschriftete Antigene als dargestellt in Abbildung 2Abezeichnet. Führen Sie eine horizontale serielle Verdünnung für eine beschriftete Antigen und eine vertikale serielle Verdünnung für das markierte Antigen.</li>
	<li>Den Rest von den Assay in 5.3 bis 9.1 beschriebenen Schritten weiter.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis von Signalen aus der hohen positiven Probe gegeneinander der entsprechenden Signale aus dem negativen Beispiel in Abbildung 2 bgezeigt.</li>
	<li>Identifizieren Sie die besten Konzentrationen für Biotin und Sulfo-Tag gekennzeichnet Antigene durch Auswählen eines Punkts mit dem höchsten oder in der Nähe von höchsten Verhältnis von positiven zu negativen. Betrachten Sie die niedrigen Hintergrundsignal aus dem Negativ-Beispiel, das Verhältnis zu identifizieren. Hinweis: Test Tag 1 enthält Schritt 4 mit Schritt 6 fort.</li>
</ol>4. bereiten Sie den Antigen-Puffer mit der richtigen Konzentration von Biotin/Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen
<ol><li>Wählen Sie die rationale Konzentration jedes Antigen anhand der Checker Board Test.</li>
	<li>Bereiten Sie 3 mL Antigen-Lösung pro Platte, mit der rationalen Konzentration von Biotin/Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen für die Antigen-Puffer.</li>
</ol>(5) inkubieren Sie Serumproben mit beschriftete Antigen
Hinweis: Es gibt zwei Protokolle in diesem Abschnitt, eine ohne Serum Säurebehandlung und eine mit Serum Säurebehandlung. Alle Insel-Autoantikörper-Assays außer IAA Assay verwenden regelmäßig Protokoll ohne Serum Säurebehandlung von Schritte 5.1 bis 5.5 während IAA Assay diese Schritte überspringt und Protokoll mit Serum Säurebehandlung von Schritten 5,6 bis 5.9 verwendet.
<ol><li>Aliquoten 4 µL Serum und 1 X PBS hinzufügen, bis der letzte Band 20 µL pro Bohrloch für eine 96-Well-PCR-Platte ist.</li>
	<li>Fügen Sie 20 µL beschriftete Antigen-Lösung pro Bohrloch.</li>
	<li>Decken Sie die PCR-Platte mit Abdichtung Folie zur Vermeidung von Licht ab.</li>
	<li>Setzen Sie die Platte auf einen Shaker (niedrige Geschwindigkeit) bei RT für 2 h.</li>
	<li>Die Teller in den Kühlschrank 4 ° C stellen und inkubieren Sie über Nacht (18-24 Uhr). Hinweis: Das folgende Protokoll der Schritte von 5,6 bis 5.9 dient nur zur IAA-Assay und andere Autoantikörper-Tests diese Schritte überspringen.</li>
	<li>Mix 15 µL Serum mit 18 µL 0,5 M Essigsäure für jede Serumprobe. Inkubieren Sie diese Mischung bei RT 45 min.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antigen-Lösung mit der rationalen Konzentration von Biotin und Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen, basierend auf der Checker Board Test mit Antigen-Puffer. In jedem gut, beschriftet aliquoten 35 µL Antigen Puffer, mit Biotin und Sulfo-Tag Antigen, in eine neue PCR-Platte.</li>
	<li>Vor 45 min Inkubationsschritt (Schritt 5.6) ist fertig, 8.3 µL 1 M Tris pH 9,0 Puffer an der Seite von jedem Bohrloch auf der Antigen-Platte (Schritt 5.6) hinzufügen. Es ist wichtig, die Vermischung zwischen der Tris-Puffer und das Antigen zu begrenzen. Sofort übertragen Sie 25 µL des Serums, welches mit Säure, im Schritt 5.6, in jede Vertiefung behandelt wird und schütteln Sie die Lösung. Decken Sie die PCR-Platte mit Abdichtung Folie zur Vermeidung von Licht ab.</li>
	<li>Legte die Platte auf einen Shaker (niedrige Geschwindigkeit) bei RT für 2 h. den Teller in den Kühlschrank 4 ° C stellen und lassen Sie die Platte zu inkubieren Übernachtung (18-24 Uhr).</li>
</ol>6. bereiten Sie die Streptavidin-Platte
<ol><li>Nehmen Sie eine Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank 4 ° C und lassen Sie die Platte zu RT kommen</li>
	<li>Sobald die Streptavidin-Platte bei RT ist, fügen Sie 150 µL 3 % Blocker A in jede Vertiefung.</li>
	<li>Decken Sie die PCR-Platte mit Folie abdichten.</li>
	<li>Über Nacht inkubieren Sie die Teller in den Kühlschrank 4 ° C. Hinweis: Assay Tag 2 beinhaltet Step 7 zu Schritt 9.</li>
</ol>7. Übertragung Serum/Antigen brütet auf den Streptavidin-Teller
<ol><li>Am nächsten Tag die Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank nehmen Sie und entsorgen Sie den Puffer von der Platte. Einige trockene Papiertücher dargelegt, auf dem Tisch, und tippen Sie auf die Platte auf den Kopf gestellt, bis gibt es keine mehr Puffer innerhalb der Brunnen.</li>
	<li>Füllen Sie die leeren Streptavidin-Platte mit 150 µL PBST pro Bohrloch und entsorgen Sie der PBST aus der Platte für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.</li>
	<li>Transfer 30 µL Serum/Antigen Bebrüten pro Bohrloch in die Streptavidin-Platte.</li>
	<li>Abdeckplatte mit Folie, Licht zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einer niedrigen Einstellung bei RT für 1 h.</li>
</ol>8. Waschen Sie die Platte und lesen Puffer
<ol><li>Ablagestapel Bebrüten von der Platte. Fügen Sie 150 µL PBST pro Bohrloch und verwerfen Sie die PBST aus der Platte für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.</li>
	<li>Fügen Sie nach dem Waschen, 150 µL pro Bohrloch des Puffers lesen. Hinweis: Es ist wichtig, Luftblasen in der Lösung zu verhindern, da dies Auswirkungen auf wie die Platte auf die Platte Leser Maschine gelesen wird.</li>
</ol>9. lesen Sie die Platte und analysieren von Daten
<ol><li>Zählen Sie die Platte auf die Platte-Leser-Maschine. Antikörper-Werte werden als Impulse pro Sekunde (CPS) angezeigt.</li>
	<li>Vermitteln Sie die Antikörpertiter von der Platte Leser Maschine als relative Index erhalten. Berechnen Sie der Index aus der folgenden Gleichung: Der Indexwert = [CPS (Beispiel) - CPS (Negativkontrolle)] / [CPS (Positivkontrolle) - CPS (Negativkontrolle)].</li>
	<li>Identifizieren Sie positive und negative Antikörper mit der Cut-off für Positivität definiert basierend auf der 99. Perzentile des 100 gesunde Kontrollpersonen (nicht-diabetischen Individuen ohne irgendwelche bekannten Autoimmunerkrankungen und haben keine Familiengeschichte von Diabetes).</li>
</ol>

<ol><li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+presymptomatic+type+1+diabetes%3A+a+scientific+statement+of+JDRF%2C+the+Endocrine+Society%2C+and+the+American+Diabetes+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li>
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<li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Insel-Autoantikörper sind derzeit die zuverlässigste Biomarker für Autoimmunität von Typ 1 Diabetes. Sie markieren den Beginn der Insel bestimmten Autoimmunität und offene Krankheitsrisiken zu bestimmen. Die ECL-Assay für Insel-Autoantikörper, wurde ausführlich in mehreren nationalen und internationalen Typ 1 Diabetes klinischen Studien validiert. Der Test hat gezeigt, erhöhte Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu den aktuellen "Gold" standard RBAs. Die ECL-Assay hat seine überlegene Vorteil für höhere Spezifität der Krankheit durch anspruchsvolle High-Affinität und risikoreiche Insel-Autoantikörper von geringem Risiko und geringer Affinität Signale generiert durch die RBA gezeigt. Dies ist vor allem in den Fächern, die nur einzelne Inselchen Autoantikörper positiv aufgefallen und haben nie Fortschritte gemacht, um Typ-1-Diabetes. Die meisten dieser geringe Affinität, die Autoantikörper gefunden wurden, verloren während follow-up Tests innerhalb von Monaten bis Jahren, verhält sich wie eine "vorübergehende positiv." Wie bereits vermutet, diese geringe Affinität, die "single" Autoantikörper wahrscheinlich durch Immunisierung mit einem kreuzreaktiven Molekül entstanden. Während höhere Affinität ergaben sich höhere Risiko-Insel-Autoantikörper aus Immunisierung mit den Inselchen Antigene selbst. ECL-Assays zeigten darüber hinaus die Möglichkeit, die Zeit der "Serokonversion" vom aktuellen standard Radio-Bindung-Assays (RBA) von Jahren bei Kindern mit Prä-Diabetes, antedate, die von Geburt an klinischen Diabetes folgten. Eine laufende internationale klinische Studie, die ökologischen Determinanten von Diabetes in Young (TEDDY) hängt präzise Erkennung, das Timing und die Darstellung der ersten Insel-Autoantikörper "Serokonversion", markieren Sie den Anfang von der kleinen Insel zu lokalisieren Autoimmunität und umweltbedingte Auslöser zu identifizieren. Ein möglicher Grund für erhöhte Empfindlichkeit in der ECL-Test ist, dass der Test alle Immunglobulinklassen erfasst: IgG, IgM, IgA, oder IgE, anstatt die traditionellen RBA oder sich nur auf den Nachweis von IgG ELISA.
In ECL-Assays für einige bestimmte Autoantikörper wie IAA scheint die Bindung der Autoantikörper gegen das Antigen durch eine Komponente im normalen menschlichen Serum gehemmt werden. Zu entfernen oder lassen Sie diese Hemmung, mußte Säurebehandlung von Serumproben tun, bevor das Serum mit Antigen inkubiert wurde. Wie dargestellt in [Abb. 5], ECL-IAA-Assay der Bindung-Aktivitäten von der Maus Insulin monoklonale Antikörper und Patienten Serum Autoantikörper mit dem Antigen wurde erheblich verbessert. Die Versauerung der Serumproben Antikörper Assays verwendet wird in der Regel angewendet, um bereits vorhandene gebundene komplexe distanzieren. Der Mechanismus hinter wie IAA Signale in humanem Serumproben gehemmt sind und freigegeben durch Säuerung des Serums ist nicht bekannt, aber mit dieser Methode in anderen ECL basierte Assays14,15.
In einigen Fällen, beim Beschriften von Molekülen sind Biotin oder Sulfo-Tag, die Kennzeichnung Positionsinside Antigen-Protein-Moleküle auf oder sehr nahe an wichtigen Epitope Antikörper-Bindung, die mit der Bindung an Antikörper stören kann. Dies reduziert Assay-Empfindlichkeit und kann komplett abzureißen Assays. Für Routine-Kennzeichnung Verfahren Maximierung oder Sättigung für jedes Antigen-Protein-Molekül, maximale Aktivität oder Signal pro beschrifteten Molekül zu erzeugen, durch die Maximierung der Kennzeichnung Kapazität von jede mögliche Kennzeichnung Position gewünscht. Ungesättigten Kennzeichnung sollte durchgeführt werden, indem das molare Verhältnis von Antigen-Protein-Moleküle (Biotin und Sulfo-Tag) Kennzeichnung, Beschriftung auf dem Antigen wird ein möglicher Grund für die Unterbrechung der Bindung Antikörperaktivität reduziert. Major Epitope besser reserviert werden kann und Unterbrechung der Antikörper-Bindung-Aktivität kann mit Hilfe der ungesättigten Kennzeichnung Strategie in den meisten Fällen freigegeben werden.
Jeder Test sollte eine interne standard hohe positive und negative Kontrolle für die Index-Berechnung der unbekannten Proben enthalten. Niedrigen Positivkontrolle in der Nähe der Assay obere Grenze des normalen Kontrollen ist wichtig für die Überwachung der Assay-Empfindlichkeit. Das Labor sollte genügend Aliquote standard positive und negative Kontrollen für den langfristigen Einsatz halten und alle Aliquote sollte bei-20 ° c gelagert werden Assay-Qualitätssicherung Assays in Duplikate für jede Probe ausgeführt werden müssen und jedes positive Ergebnis sollte durch die Wiederholung der Probe in einem separaten Assay bestätigt werden. Ein dritte Assay ist notwendig, wenn die zweite bestätigende Assay nicht einverstanden ist, mit den ersten Test und die Ergebnisse von zwei Assays, die einverstanden sind (zB., +, + oder-, -), werden die endgültige Festlegung der ein positives oder negatives Ergebnis.
Mit der Plattform für einzelne ECL-Assays kann daraus eine Multiplex-Assay erweitert werden. Es kann gleichzeitig bis zu 10 verschiedene Autoantikörper in einem einzigen Brunnen mit einer winzigen Menge des Serums bestimmen. Derzeit sind vier kleine Insel-Autoantikörper einschließlich IAA, GADA, IA-2A und ZnT8A gleich an Bedeutung für die Risiko-Vorhersage der Progression zu T1D in beiden Verwandten von Patienten mit T1D und der allgemeinen Bevölkerung. Die Methoden für das screening von diesen 4 Autoantikörper mit einzelnen Autoantikörper Strommessungen sind aufwändig und ineffizient, vor allem für großflächige Bevölkerung Screening. Haben Sie wichtig ist, bis zu 40 % der Patienten mit T1D eine weitere Autoimmunerkrankung16,17,18. Leider gibt es keine einfache und kostengünstige Tool zum Bildschirm für diese Bedingungen. Die Multiplex-ECL-Assay ist nicht nur in der Lage 4 aktuellen großen Insel-Autoantikörper-Assays in einem zu kombinieren, aber ist auch in der Lage, weitere Autoantikörper-Tests aus anderen relevanten Autoimmunerkrankungen weiter kombinieren. Dies macht es möglich, effizient Hochdurchsatz-screening für mehrere Autoimmunerkrankungen gleichzeitig in großem Maßstab Populationen führen. In der Multiplex-ECL-Assay wird wie in [Abb. 6] jeder Antikörper-Antigen-Komplex gebildet in der Flüssigkeit-Phase zu einer spezifischen Linker Quelle Stelle in der gleichen gut zurückgehalten werden. Der Signalempfänger auf der Platte-Leser-Maschine ist in der Lage, die Signale aus 10 verschiedenen Quellen von Flecken zu erkennen. Jedoch können die Flecken mit einem extrem hohen Signal generieren einen hohen Assay-Hintergrund und verursachen Interferenzen zu benachbarten Orten durch Übersprechen. Aus diesem Grund sollte die Obergrenze Signale für jedes Autoantikörper-Test beschränkt sich auf weniger als 20.000 zählt. Nach unserer Erfahrung sollte die Autoantikörper mit niedrigeren Hintergründe relativ weit entfernt von jenen Stellen, die mit höheren zählt, wenn die spot Karte ausgelegt ist platziert werden. Für Langzeitstudien mit Multiplex-ECL-Assays empfiehlt es sich, dass der gleiche Linker zum gleichen Autoantikörper-Test verwendet werden, um den Assay konsistent zu halten.

Ein aktuelles staging Klassifikationssystem wurde erstellt, um die Diagnose der Anfangsphase des T1D bei Patienten zu unterstützen. Genaue Erfassung der menschlichen Insel-Autoantikörper spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung und Inszenierung präsymptomatische Typ 1 Diabetes, da das Vorhandensein des Insel-Autoantikörper weist auf das Vorhandensein von β-Zelle Autoimmunität. Die beträgt bei denen Diabetes betrifft Patienten aus dem ersten Auftreten der β-Zelle Autoimmunität zu den Symptomen der Krankheit, verbunden mit der Anzahl und Art der Insel-Autoantikörper, Variable2,3.
Das Zeitalter der Autoantikörper Serokonversion, Titer und Affinität der Insel-Autoantikörper beeinflussen die Rate des Fortschreitens auf symptomatische Typ 1 Diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Vor kurzem entwickelte ECL-Assays umfassend validiert wurden, haben gezeigt, erhöhten Empfindlichkeit und sind weitere krankheitsspezifische10,11,12,13. Diese Tests verbessern die Vorhersage und Inszenierung der Diabetes-Risiko durch die frühere Erkennung von Insel-Autoantikörper. Sie markieren die Einleitung von Inselchen Autoimmunität genauer und ignorieren die niedrig-Affinität und risikoarme Signale nicht relevant für Diabetes.
ECL-Assay überbrücken Autoantikörper im Serum, falls vorhanden, die Sulfo-Tag-konjugiert Antigen biotinylierte Erfassung Antigen in der flüssigen Phase. Nach Überbrückung, Biotin Linker gefangen in der festen Phase und erkannt durch ECL von Sulfo-Tag auf der Streptavidin beschichteten Platte (Abbildung 1).
In diesem Beitrag werden einzelne Antikörper-ECL-Assays mit menschlichen Insel-Autoantikörper in erster Linie eingesetzt. Kurz, Multiplex Antikörper Assays basierend auf einzelnen ECL-Assays diskutiert werden. Multiplex-Assays kann verwendet werden, um mehrere, bis zu 10, Autoantikörper innerhalb einer einzigen gut, identifizieren mit 15 µL Serum. Diese einfachen Hochdurchsatz-Assay kann verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Autoantikörper für mehrere relevante Autoimmunerkrankungen in der Allgemeinbevölkerung Bildschirm.

<table><tbody><tr><td>Humanes rekombinantes Proinsulinprotein (PINS)</td><td>AmideBio</td><td>Humanes Proinsulin, Rec</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes GAD65-Protein</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes IA-2-Protein</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Platte&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin beschichtete Platte</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Leimungsspinsäule</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-Tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>Blocker A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>4x Read Buffer T mit Tensid</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG4-Biotin</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Platte</td><td>Marke Fisher 14230232</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Streptavidin-Platte</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin-Entsalzungssäule</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Plattenschüttler</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge mit Schaufelrotation</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

electrochemiluminescence-assays für menschliche insel-autoantikörper

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Ermittlung der Insel-Autoantikörper mit Typ 1 Diabetes assoziiert führt (T1D) der Weg zu projizieren und davon abhalten, diese Krankheit in der Allgemeinbevölkerung. Eine neuartige ECL-Assay ist ein nicht radioaktiven Fluiden Phase Assay für Insel-Autoantikörper mit höherer Sensitivität und Spezifität als die aktuelle "Gold" standard Radio-Bindung Assay (RBA). ECL-Assays können das Auftreten von präsymptomatische T1D genauer definieren, durch die Unterscheidung der mit hohem Risiko, hohe Affinität Autoantikörper aus den risikoarmen, niedrige Affinität Autoantikörper erzielte RBAs und konventionellen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA ). Das Antigen-Protein in dieser ECL-Assay verwendet wird bzw. mit Sulfo-Tag und Biotin, gekennzeichnet. Jedes ECL-Autoantikörper-Test, die ein bestimmtes Antigen-Protein verwendet braucht ein Optimierungsschritt, bevor es für Labor-Anwendung verwendet werden kann. Dieser Schritt ist besonders wichtig bei der Festlegung der Anforderungen für Serum Säure Behandlungen, Konzentrationen und Verhältnisse von zwei verschiedenen Antigenen beschriftet mit Sulfo-Tag und Biotin. Um den Test durchzuführen, Serum Proben mit Sulfo-Tag-konjugiert gemischt und biotinylierte erfassen Antigen Proteins in Phosphat gepufferte Lösung (PBS), mit 5 % Bovine Serum Albumin (BSA). Danach werden die Proben bei 4 ° c über Nacht inkubiert. Am selben Tag ist eine Streptavidin beschichteten Platte mit Blocker Puffer zubereitet und über Nacht bei 4 ° c inkubiert Am zweiten Tag waschen Sie die Streptavidin-Platte und übertragen Sie die Serum-Antigen-Mischung auf den Teller. Legen Sie die Platte auf den Teller-Shaker, bei niedriger Drehzahl eingestellt und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h. Anschließend die Platte wird wieder gewaschen, und Leser Puffer hinzugefügt. Die Platte wird dann auf die Platte Leser Maschine gezählt. Die Ergebnisse werden über einen Index vermittelt, die aus internen standard positive und negative Kontrolle Serumproben generiert wird.

Abbildung 2 zeigt die Checker Board. Es wird gezeigt, dass 250 ng/mL von Biotin und 250 ng/mL von Sulfo-Tag beschriftete Antigen sind die rationellsten Konzentrationen verwendet in der Probe, da die Signale von den hohen positiven Kontrollprobe, die negative Kontrollprobe der Assay-Hintergrund und das Verhältnis von positive, negative Signale. Mit den optimierten Konzentrationen dieser zwei beschriftete Antigene wurde der Test mit Serumproben von 100 neu diagnostizierten Patienten mit T1D und 100 gesunden Kontrollen durchgeführt. Der Indexwert des 0,023 wurde als der Assay-Cut-off für Positivität definiert. Dies entspricht 85 % Sensitivität im Patienten und 99 % Spezifität bei gesunden Kontrollpersonen, die mit dem Receiver (ROC) Kennlinie dargestellt in Abbildung 3Ain Betrieb. Der Test für die unbekannten Proben wurde mit internen standard hohe positive, niedrigen positiven und negativen Kontrollproben durchgeführt. Die Ergebnisse der CPS Grafen sind dargestellt Tabelle 2A. Der Mittelwert CPS von hohen und niedrigen Positivkontrollen sind rot, 17903 [(19940+15866)/2 markiert] und 839 [(857+820)/2], und die Negativkontrollen grün, 168 [(170+165)/2 hervorgehoben]. Der Index für unbekannte Proben wird berechnet, indem "(CPSProbe-168)/(17903-168)." Tabelle 2 b zeigt die berechneten Index-Werte für alle Proben. Die Indexwerte, die größer als 0,023 rot, entspricht die CPS-Werte auch in Tabelle 2Arot geschrieben geschrieben sind. Diese Werte werden als die positiven Ergebnisse definiert werden, die größer als99 Perzentil der gesunden Kontrollgruppe . Wenn eine irrationale Antigenkonzentration verwendet wird, wird der Test einen hohen Hintergrund haben wie in Tabelle 2 C. gezeigt Geringe Mengen an positive Antikörper werden wie die Werte A2, A5, D1 und H4 in Tabelle 2Dgrau hervorgehoben vermisst werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Abbildung 1 : Abbildung einer bivalenten Platte schlagen auf einen einzigen ECL-IAA-Assay. Die Insel-Autoantikörper in der Serum-Brücken Sulfo-Tag Antigen biotinylierte Erfassung Antigen, konjugiert, die in der festen Phase auf der Streptavidin beschichteten Platte erfasst ist. Erkennung der Platte aufgenommenen Sulfo-Tag konjugierten Antigen wird durch ECL erreicht. Diese Zahl wurde von Yu, geändert Et Al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Abbildung 2 : The ROC-Kurve für die Bestimmung der Cut-off von Assay Positivität. 99 Perzentil entspricht 85 % Sensitivität Spezifität wurde ausgewählt und als ein Indexwert von 0,023 dargestellt wird. Diese Obergrenze des Assays stammen von 100 gesunden Kontrollpersonen. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Abbildung 3 : Darstellung der normalen menschlichen Serum ECL-IAA-Signale blockieren. A: die Signale von ECL-IAA-Assays mit einem Insulin monoklonale Antikörper (MoAb) drastisch durch die Zugabe von normalen menschlichen Serum blockiert wurden. Beim Vergleich von MoAb mit PBS-Puffer wurde das Signal teilweise restauriert, wenn die Humanserum mit Säure behandelt wurde. B: Signale von einem ECL-IAA-Assay mit 4 Patientenseren wurden mit Säure Behandlung deutlich verbessert. Diese Zahl wurde von Yu, geändert Et Al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Abbildung 4 : Abbildung des Assays Mutiplex ECL. Antikörper-Antigen-komplexe werden in der Flüssigkeit-Phase mit spezifischen linker gebildet. Die spezifischen Antikörper-Antigen-Linker komplexe sind gut auf jedem der Linker-punktweise in dasselbe Verhalten. Die Platte Leser Maschine ist in der Lage, die Signale aus verschiedenen Quellen der Spots zu unterscheiden und CPS zählt auf 10 verschiedenen Kanälen, bzw. gibt. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tabelle 1: Checker Board Test bestimmt die Konzentration und die Verhältnisse von Biotin und Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigene. A: Raw CPS zählt für Board Riffelblech mit hohen positiven Serum auf Hälfte der Platte und negativen Serum auf der anderen Hälfte. Die Konzentration des Antigens biotinylierte war horizontal hintereinander verdünnt und die Konzentration von Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen wurde vertikal in Serie verdünnt. B: die Verhältniswerte der CPS Grafen aus dem hohen positiven Serum gegen jeden ihrer entsprechenden CPS Grafen aus dem negativen Serum. Die gelben markierten Brunnen repräsentieren das beste Verhältnis von positiven zu negativen in der Gruppe B. Dieses Verhältnis entspricht 250 ng/mL Biotin und 250 ng/mL Sulfo-Tag gekennzeichnet Antigen-Konzentrationen in zentrale A mit einen akzeptabel niedrigen CPS-Count für negativen Serum. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Tabelle zu sehen.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tabelle 2: Analyse der Untersuchungsergebnisse. A: Raw CPS zählt von der Assay-Platte mit der standard hoch und niedrig Positivkontrollen hervorgehoben in rot und die negativen Standardsteuerelemente grün hervorgehoben. Jede Probe wurde in der Probe zweigleisig ausgebaut. B: Index-Werte wurden berechnet, wie in dem Assay-Protokoll beschrieben. Jeder Indexwert, der größer als 0,023 war wurde definiert als ein positives Ergebnis, rot hervorgehoben. C: Raw CPS zählt von der Assay-Platte mit dem gleichen Satz von Proben, wenn eine irrationale Antigenkonzentration verwendet wurde. Dies führte zu einem hohen Hintergrund und einige niedrige positive normalerweise erkannt, wie im Diagramm B gezeigt wurden umgewandelt zu negativen, in Panel D. grau hervorgehoben <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Tabelle zu sehen.</a>

Hier präsentierten wir die Methoden, um menschliche Insel-Autoantikörper mit Electrochemiluminescence (ECL) Assays erkennen. Das Protokoll verwendet, um vorherzusagen, Typ 1 Diabetes, kann erweitert werden, um Autoantikörper für andere Autoimmunerkrankungen zu erkennen.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Elektrochemilumineszenz-Assays ist der Nachweis von Insel-Atutoantikörpern bei Autoimmun-Typ-1-Diabetes mit hoher Sensitivität und hoher Spezifität. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Typ-1-Diabetes zu beantworten, wie z. B. den Zeitpunkt des Beginns der Autoimmunität auf der Insel und die Vorhersage eines hohen Risikos für Typ-1-Diabetes. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zu den aktuellen Standard-Radioassays empfindlicher, krankheitsspezifischer und nicht radioaktiv ist.Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Vorhersage und Diagnose von Typ-1-Diabetes, da diese Insel-Autoantikörper Monate bis Jahre vor der symptomatischen klinischen Erkrankung auftreten. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Prädikation für Typ-1-Diabetes geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Autoimmunerkrankungen angewendet werden, wie z. B. Autoantikörper gegen Transglutaminase bei Zöliakie gegen TPO und Thyreoglobulin bei Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und einige andere. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass die Technik auf hoher Empfindlichkeit und Nicht-Radioaktivität basiert.Im Gegensatz zur herkömmlichen ELISA-Methode, die für den Nachweis von Insel-Autoantikörpern nicht gut geeignet ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Insulin-Autoantikörper-Assay mit Serumsäurebehandlung nur schwer in Textform beschrieben werden kann. Das Verfahren wird von Yong Gu, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert.Mischen Sie zunächst das humane Inselautoantigen mit Biotin oder SULFO-TAG in einem Verhältnis von einem zu fünf molaren in einem Röhrchen. Und decken Sie die Tube mit Alufolie ab, da beide Etiketten lichtempfindlich sind. Inkubieren Sie das Röhrchen dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur.In der Zwischenzeit, wenn die Inkubation läuft, primieren Sie die Spin-Säule mit zweifach phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Zentrifugieren Sie dann die Säule jeweils zwei Minuten lang bei der 1.000-fachen Schwerkraft. Als nächstes zentrifugieren Sie das Autoantigen-Tag-Gemisch in der Spin-Säule bei der 1.000-fachen Schwerkraft für zwei Minuten.Anschließend aliquotieren und lagern Sie das markierte Antigen bei minus 80 Grad Celsius. Als nächstes wird die rationale Konzentration des mit Biotin SULFO-TAG markierten Antigens basierend auf dem Schachbrett-Assay für den Antigenpuffer verwendet, um drei Milliliter Antigenlösung pro 96-Well-Platte herzustellen. Fügen Sie dann in jede Vertiefung vier Mikroliter Serum hinzu und stellen Sie das endgültige Volumen auf 20 Mikroliter mit einer gefalteten phosphatgepufferten Kochsalzlösung ein.Geben Sie dann 20 Mikroliter markierte Antigenlösung in jede Vertiefung. Und decken Sie die Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu verhindern. Dann die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker geben.Sobald der Shaker stoppt, lassen Sie die Platte 18 bis 24 Stunden bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Mischen Sie nun für jede Probe 15 Mikroliter Serum mit 18 Mikrolitern 0,5 molare Essigsäure und inkubieren Sie diese 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Auf der Grundlage des Schachbrett-Assays wird die rationale Konzentration des mit Biotin SULFO-TAG markierten Antigens verwendet, um die Antigenlösung herzustellen.Aliquotieren Sie dann 35 Mikroliter des Antigenpuffers in jeder Vertiefung einer neuen PCR-Platte. Kurz bevor der Verlauf der Inkubation des Serumgemisches abgeschlossen ist, fügen Sie 3,8 Mikroliter eines molaren Tris-Puffers bei PH neun hinzu, zusammen mit jeder Vertiefung auf der Antigenplatte. Sobald die Inkubation beendet ist, geben Sie schnell 25 Mikroliter des mit Essigsäure behandelten Serums in jede Vertiefung der Antigenplatte und rühren Sie die Lösung.Decken Sie dann die PCR-Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu vermeiden, und legen Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Platte bei vier Grad Celsius in den Kühlschrank und inkubieren Sie sie 18 bis 24 Stunden lang. Nehmen Sie eine Streptavidin-Platte bei vier Grad Celsius aus dem Kühlschrank und lassen Sie die Platte Raumtemperatur erreichen.Nachdem die Streptavidin-Platte Raumtemperatur erreicht hat, geben Sie 150 Mikroliter 3%Blocker A in jede Vertiefung, decken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie ab und inkubieren Sie sie über Nacht im Kühlschrank. Nehmen Sie am nächsten Tag die Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie den Puffer aus den Vertiefungen. Trocknen Sie dann die Platte, indem Sie sie kopfüber auf einige Papiertücher legen, damit der restliche Puffer einweichen kann.Fügen Sie dann 150 Mikroliter eines faltigen PBST-Puffers hinzu, um die Vertiefung drei aufeinanderfolgende Wäschen lang zu waschen. Übertragen Sie anschließend 30 Mikroliter Serumantigen-Inkubat in jede Vertiefung der Streptavidin-Platte und decken Sie die Platte mit Folie ab, um Licht zu vermeiden. Dann die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker geben.Nach einer Stunde verwerfen Sie das Serumantigen, inkubieren Sie von der Platte und fügen Sie 150 Mikroliter eines gefalteten PBST-Puffers hinzu, um die Vertiefung dreimal zu waschen. Sobald der Waschvorgang beendet ist, geben Sie 150 Mikroliter Lesepuffer in jede Vertiefung, um sie auf einem Plattenleser abzulesen. Vor der Analyse unbekannter Proben wurde der Assay-Cutoff für jeden Autoantikörper-Assay festgelegt, indem etwa 100 Typ-1-Diabetes-Patienten und etwa 100 gesunde Kontrollpersonen getestet wurden.Dann wurde eine ROC-Kurve gezeichnet, um den optimalen Index der oberen Grenze des Normalwerts für den GADA-Assay zu bestimmen, der 0,023 betrug, um die beste Sensitivität und Spezifität zu erhalten. Dann wurde das Ergebnis der unbekannten Probe anhand einer Gleichung berechnet, die aus hohen positiven, niedrigen positiven und negativen Kontrollstandards abgeleitet wurde. Als nächstes wurde ein Diagramm erstellt, um die Signale zu bestimmen, die im Inselautoatibody-Assay bei der Inkubation des monoklonalen Insulin-Antikörpers mit normalem Humanserum in Gegenwart und Abwesenheit einer sauren Behandlung erhalten wurden.Die Grafik zeigt, dass das Signal bei Zugabe von normalem Serum ohne Säurebehandlung deutlich blockiert ist. Im Gegenteil, das erhaltene Signal ist vergleichbar höher, wenn das Serum vor der Inkubation mit dem monoklonalen Insulin-Antikörper einer sauren Behandlung unterzogen wird. Ein ähnliches Diagramm wurde auch erstellt, um die Signale zu bestimmen, die mit Seren ausländischer Patienten in Gegenwart und Abwesenheit einer Säurebehandlung erhalten wurden.Die Behandlung der Patientenseren mit Säure vor der Inkubation mit dem Antikörper erhöht die Signale im Insel-Autoantikörper-Assay signifikant im Vergleich zu ohne Behandlung. Einmal gemeistert, kann diese Technik problemlos für mehrere hundert Proben an einem Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig vorgeformt ist. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, den Schachbrett-Assay für jeden Autoantikörper-Assay durchzuführen, um den Assay-Zustand zu optimieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Autoimmun-Typ-1-Diabetes den Weg zur Vorhersage und Prävention. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einfach Sie diesen Assay durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Serumproben gefährlich und ansteckend sein kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um direkten Hautkontakt zu vermeiden.

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Research

Forschung

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Immunology and Infection

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Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

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