Custom-Engineered Tissue Culture Formen von gelasert meistern

Diese Methode kann die Forschung im Bereich des Tissue Engineering im Zusammenhang mit der Gewebeentwicklung, der Zellausrichtung und der mechanischen Analyse von Polymeren und künstlich hergestellten Geweben erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie kostengünstig, einfach zu bedienen und schnell ist. Wir haben diese Technik in meinem Labor entwickelt, weil die geometrische Kontrolle von künstlich hergestellten Geweben im Feld nicht durchgeführt wurde, und wir sahen die dringende Notwendigkeit, translational über die Vergrößerung von gezüchteten Geweben nachzudenken.

Diese Technik ermöglicht es uns, die Vorteile geometrischer Warteschlangen für die Zellphysiologie und künstlich hergestellte Gewebe durch Herstellungstechniken mit Stiften und einer Vielzahl von Formen zu nutzen. Diese Methode kann Einblicke in die Produktion von künstlich hergestellten Geweben mit kontrollierter Größe, Form und Ausrichtung geben. Es kann auch auf verschiedene Krankheitsmodelle, die personalisierte regenerative Medizin und die Translation von künstlich hergestellten Geweben in präklinische Studien angewendet werden.

Beginnen Sie damit, ein Vektorgrafikprogramm auf einem Computer zu öffnen. Um die gewünschte Formgeometrie und das Vektorformat vorzubereiten, öffnen Sie eine neue Leinwand mit den entsprechenden Abmessungen im RGB-Farbformat. Wählen Sie dann das Formwerkzeug aus dem linken Bereich aus und erstellen Sie die gewünschte Geometrie, indem Sie die Abmessungen oben im Fenster eingeben, um die Formgrößen genau zu definieren.

Entwerfen Sie die Formgeometrien so, dass ein Rand von mindestens sechs Millimetern von der Kante der äußersten Merkmale und der Schnittlinie aus möglich ist, um das Beschneiden des PDMS-Meniskus nach dem Formguss zu ermöglichen. Auf diese Weise kann die fertige Form bündig mit dem Boden der Kulturschale abschließen. Öffnen Sie als Nächstes den Farbwähler in der oberen linken Ecke des Fensters und definieren Sie neue Farbfelder, die mit der Lasercutter-Software kompatibel sind.

Wählen Sie jeden Pfad aus und weisen Sie ihm eine geeignete Farbe aus dem Schnittmuster zu. Wenn Sie fertig sind, weisen Sie der Füllfarbe die Option Keine zu. Weisen Sie auf ähnliche Weise Farbfelder zu Radierpfaden zu, indem Sie das Objekt auswählen und dann in der Farbauswahl den Radierpfad für die Füllfarbe und Keine für die Pfadfarbe auswählen.

Speichern Sie Designs in den Formaten ai or. pdf, je nachdem, welches für das Vektorgrafikprogramm und den Lasercutter geeignet ist. Bereiten Sie den Laserschneider gemäß den Herstellerangaben für den Schnitt vor und sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung.

Legen Sie dann eine 1/4 Zoll große Acrylplatte auf das Laserbett. Stellen Sie die Höhe des Bettes so ein, dass es richtig auf das Acryl abgestimmt ist. Öffnen Sie anschließend die Designdatei auf dem Computer, der mit dem Laserschneider verbunden ist, und öffnen Sie das Menü Drucken.

Stellen Sie sicher, dass der Laserschneider als Drucker eingestellt ist und dass im Dropdown-Menü "Skalierung" die Option "Nicht skalieren" ausgewählt ist, um eine Verzerrung des Designs zu vermeiden. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Drucken am unteren Rand des Dialogfelds Drucken. Klicken Sie im Druckdienstprogramm für den Laserschneider auf die Einstellungsschaltfläche, um die Parameter für das Ätzen des Schnitts für jedes der Designmerkmale festzulegen.

Legen Sie hier die Parameter Leistung, Geschwindigkeit und Impulse pro Zoll für jede der zuvor ausgewählten Farben fest. Sobald die Einstellungen eingegeben wurden, klicken Sie auf die große grüne Schaltfläche in der Lasercutter-Software. Dies führt dazu, dass der Laserschneider beginnt, die Negativ-Urformen zu ätzen und zu schneiden.

Verwenden Sie zum Schluss eine kleine Bürste oder Druckluft, um alle Rückstände von den negativen Urformen zu entfernen. Dadurch wird die Oberfläche für den PDMS-Guss vorbereitet. Bereiten Sie eine PDMS-Gießmischung nach Herstellerangaben vor.

Entgasen Sie das vorbereitete PDMS in einer Vakuumkammer, die mit einem Standard-Line-Vakuumlabor verbunden ist, für eine Stunde oder bis alle Blasen beseitigt sind. Während das PDMS entgast wird, nehmen Sie die Außenkante der Form mit Vinyl oder Kreppband auf, so dass das Band mindestens drei Millimeter über die geätzte Fläche der negativen Urform hinausragt. Achten Sie darauf, das Klebeband fest gegen die Seite der Form zu drücken, um spätere Undichtigkeiten zu vermeiden.

Gießen Sie anschließend etwa 0,35 Milliliter pro Quadratzentimeter PDMS in die Urform, sodass das PDMS eine Mindestdicke von 1,5 Millimetern erreicht. Setzen Sie die PDMS-beschichtete Negativ-Urform in eine Vakuumkammer ein und entgasen Sie erneut für eine Stunde oder bis alle Blasen entfernt sind. Stellen Sie dann die entgaste, PDMS-beschichtete Negativ-Urform für mindestens sechs Stunden auf eine ebene Schiene in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen, um das PDMS auszuhärten.

Nach dem Aushärten schneidest du die einzelnen Formen mit einer Rasierklinge auseinander, während sie sich noch auf der negativen Urform befinden. Ziehen Sie dann langsam und vorsichtig jede PDMS-Form von der negativen Urform ab. Schneiden Sie alle Bereiche ab, in denen ein Meniskus gegossen wird, was verhindern würde, dass die Form flach liegt, sowie überschüssiges Material oder Ablagerungen.

Zum Schluss autoklavieren Sie die Formen mit einem Standard-Autoklavenzyklus, um sie für die Gewebekultur zu sterilisieren. Kleben Sie zunächst Formen auf unbehandelte Kunststoffplatten. Bereiten Sie die Fibrinogen-, Thrombin- und neutralisierten Kollagenlösungen vor und ernten Sie die gewünschten Zellen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Kombinieren Sie das Fibrinogen, das neutralisierte Kollagen und die Zellsuspension, um eine Gießmischung herzustellen. Bewahren Sie die Gussmischung auf Eis auf. Verwenden Sie als Nächstes einen tragbaren Hochfrequenzgenerator, um die Oberflächen der Form zu behandeln, die der Gussmischung ausgesetzt werden, um die PDMS-Hydrophobie zu mildern.

Setzen Sie die Oberflächen etwa fünf Minuten vor dem Gießen des Materials drei bis fünf Sekunden lang der Plasmabehandlung aus. Unmittelbar vor dem Gießen der Proteinzellmischung das Thrombin zur Gießmischung geben und vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu bilden. Pipettieren Sie die Gussmischung schnell in die Formen und geben Sie die Mischung vorsichtig in alle Ecken und Spalten der Form ab.

Vermeiden Sie es, die Mischung über den ersten Stopp der Pipette hinaus auszustoßen, um Blasenbildung in den Konstrukten zu vermeiden. Legen Sie die Proben dann für 45 Minuten in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. Setzen Sie die Konstrukte nach 45 Minuten wieder in die Haube ein und bedecken Sie sie mit Zellmedien, bevor Sie in den Inkubator zurückkehren.

Wechseln Sie das Zellmedium alle 48 bis 72 Stunden, je nach Bedarf für den Zell- und Konstrukttyp. Befolgen Sie abschließend das begleitende Textprotokoll, um die Gewebeverdichtung und die Zugeigenschaften der Konstrukte zu quantifizieren, verschiedene Färbetechniken vorzubereiten und die Zellausrichtung zu messen. Im Laufe der Zeit und Kultur verdichten zellularisierte Konstrukte aufgrund von Matrix-Remodeling.

Dies geschieht sowohl durch Reorganisation als auch durch Degradation der umgebenden Matrix und ist typischerweise mit einer Erhöhung der mechanischen Steifigkeit verbunden. Gerichtete Verdichtung kann auch Stressfelder im Gewebe induzieren, die in zellularisierten Konstrukten manipuliert werden können, um die Zellausrichtung zu fördern. Diese beiden Bilder wurden von Herzgewebekonstrukten aufgenommen, die in drei mal 17 Millimeter großen rechteckigen Formen mit Stiften an beiden Enden gezüchtet wurden.

Und diese beiden Bilder sind kardiale Gewebekonstrukte, die ohne Einschränkungen gezüchtet wurden. Die beiden Konstrukte, die eingeschränkt waren, waren nur in der Lage, sich in die verbleibenden zwei Richtungen zu verdichten und führten zu einer stressinduzierten zellulären Ausrichtung. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um kundenspezifische Tissue-Formen in weniger als einem Tag zu entwerfen, herzustellen und zu implementieren.

Nach der Gewebebildung können andere Methoden wie mechanische Tests und Histologie durchgeführt werden, um die Auswirkungen der Ausrichtung auf die Zellmorphologie und die Gewebefunktion besser zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie benutzerdefinierte PDMS-Gewebeformen aus lasergeschnittenen Acrylmastern herstellen können.