Name: Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Lernen Sie eine PCR-basierte Methode zur Erkennung von Candidatus Liberibacter spp. in Zitrusblattgewebe. Diese effiziente Technik ermöglicht Landwirten und Forschern eine schnelle, präzise Diagnose von Citrus Greening.

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Konzeption, H.C. und Z. f. F.; Untersuchung, H. C., J. C und Z. f. F; Ressourcen, Z. f. F.; Schreiben - Originalentwurf, I. A. P.; Schreiben – Review & Bearbeitung, I. A. P., J. C. H. C., S. L. T. und Z. f. F.; Visualisierung, H. C.; Aufsicht, Z. f. F.; Finanzierung Erwerb, Z. f. F und F. f. L.
Projekt unterstützt durch einen South Carolina Verbesserung Lehrer Qualität Hochschulbildung staatlichen Zuschuss mit dem Titel, Verbesserung der mittleren Klasse Science Teachers Wissen der Anlagenprozesse, Strukturen und Funktionen durch Engagement in Plant Sciences Research (Anlage Wissenschaft)
Mittel durch die Vereinigte Staaten Department of Education (CFDA-Nummer 84.367B)
Die Autoren möchte Dr. Nian Wang von der University of Florida für die Bereitstellung von genomischer DNA-Proben von Citrus Sinensis Valencia infiziert.

(1) Isolierung genomischen DNA aus pflanzlichem Gewebe mit einem genomischen Extraction Kit
<ol><li>Erhalten Sie Zitrus Blattgewebe schneiden ein ganzer frischen Blatt von einem Zitrusfrüchte Baum mit einer sauberen Schere, und legen Sie das Blatt in einen sauberen Plastikbeutel. Hinweis: Die Tasche mit dem Blattgewebe sollte im Kühlschrank 4 ° C oder auf Eis in einem isolierten Behälter so bald wie möglich nach der Entnahme zu sparsam zu sein platziert werden.</li>
	<li>Fügen Sie eine kleine Menge von flüssigem Stickstoff in einem Mörser und Stößel chill. Während sie entspannen, sind, mit einer Schere schneiden Sie ein kleines Stück Blattgewebe, ca. 1 Quadratzoll in der Größe. Platzieren Sie das geschnittene Gewebe im Mörser, sofort es einzufrieren. Mehr flüssigen Stickstoff, bei Bedarf hinzugefügt werden. Hinweis: Isolierte Handschuhe sollten immer getragen werden, beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Mahlen Sie schnell das Pflanzengewebe zu einem feinen Pulver mit dem Mörtel. Schleifen der flüssige Stickstoff vollständig verdampft, bis ein feines grünes Pulver bleibt weiter.</li>
	<li>Kurz entspannen Sie eine Spachtel aus Metall in flüssigem Stickstoff für 10-15 s, dann schöpfen Sie das Boden-Gewebe im Inneren des Mörtels zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, mit dem Spatel.</li>
	<li>Fügen Sie 600 µL Kerne Lyse Lösung (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 1000 µL pipette und Wirbel der Probe für 1-3 s, dann im Wasserbad 65 ° C für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 3 µL RNase-Lösung hinzu, die lysate mit einer Pipette 10µL, Invertieren Sie die Röhre 2 - 5 Mal zu mischen, und bei 37 ° C in einem Schrank Inkubator für 15 min inkubieren. Hinweis: Lassen Sie die Mischung abkühlen auf Raumtemperatur bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Niederschlag Proteinlösung, Vortex: bei Hochgeschwindigkeit, 20 s, dann Zentrifuge für 3 min bei 13.000 x g eine feste Kugel zu bilden. Während die Probe zentrifugiert wird, ist fügen Sie 600 µL Raumtemperatur Isopropanol einen frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch hinzu.</li>
	<li>Mit einer 1000 µL Pipette, vorsichtig aus der zentrifugiert Probe, Übertragung auf den frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit Isopropanol überstand. Die Pellets kann nun verworfen werden. Hinweis: Vermeidung einer Kontamination des Überstands mit Protein durch eine winzige Menge überstand über die Pellets verlassen.</li>
	<li>Invertieren Sie das Rohr, bis die DNA als eine Masse von fadenförmige Stränge sichtbar wird, dann Zentrifugieren bei 13.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Dekantieren des Überstands, das Pellet 600 µL 70 % Ethanol hinzu, Invertieren Sie das Rohr mehrmals zu waschen die DNA, und 13.000 x g für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Vorsichtig Aspirieren das Ethanol, verlassen das lose DNA-Pellet dann öffnen und invertieren der Röhre, ruht auf saugfähigem Papier. An der Luft trocknen bei Raumtemperatur 15 Minuten.</li>
	<li>Das getrocknete DNA-Pellet fügen Sie 100 µL DNA Rehydratationslösung hinzu, dann Brüten Sie die DNA im Wasserbad 65 ° C für 1 h, beim Mischen in regelmäßigen Abständen durch Tippen auf das Rohr.</li>
	<li>Eine Küvette setzen Sie 1 µL gereinigtes Wasser auf, und legen Sie sie in einem Spektralphotometer als Leerzeichen verwendet werden. Berechnen Sie die Konzentration von DNA vorhanden, indem 1 µL Probe auf der Küvette und Einfügen in das Spektrophotometer. DNA-Konzentration (ng/µL) kann (ein260- A320) berechnete × Verdünnung Faktor × 50 ng/µL. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe kann bei 4 ° c gelagert werden</li>
</ol>2. führen Sie PCR genomischer DNA-Proben
<ol><li>Kombinieren Sie 10 µL 2 (siehe Tabelle der Materialien), X PCR Master Mix 1 µL forward Primer (10 Uhr/µL), 1 µL reverse Primer (10 Uhr/µL) (siehe Tabelle 2 für Primer-Sequenzen), 100 ng von genomischer DNA aus der Probe extrahiert und gereinigtes Wasser (bis zu 20 µL Endvolumen) in ein 50 µL PCR-Röhrchen, Flick, mischen und kurz Zentrifuge.</li>
	<li>Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler und entsprechend ausführen (siehe Tabelle 1). Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Gegebenenfalls speichern Sie Sample bei 4 ° C nachdem die Reaktion abgeschlossen ist.</li>
</ol>3. die Amplifizierte DNA in ein Agarose-Gel electrophorese
<ol><li>Wiegen Sie 0,4 g Agarose Pulver und fügen Sie es zusammen mit 1 X TAE-Puffer auf eine saubere 200 mL Erlenmeyerkolben, Füllung bis zu 50 mL.</li>
	<li>Mikrowelle auf hoch für 1,5 min schütteln alle 30 s, bis Agarose vollständig aufgelöst ist. Hinweis: Isolierte Handschuhe sollte getragen werden, beim Umgang mit flüssigen Agarose um Verbrennungen zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie 2,5 µL 10 mg/mL Interkalation Bromid flüssige Agarose und schütteln zu mischen, dann Gießen Sie das flüssige Agarosegel in eine Ebene Gel-Form. Fügen Sie schnell standard 12-Zahn-Gel Kämme nach Gießen.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel für 20 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen, dann entfernen Gel Kämme, und legen Sie das Gel in eine Ebene Gel Box gefüllt mit 1 X TAE-Puffer.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette, laden Sie die insgesamt amplifizierten DNA-Proben in Brunnen. Fügen Sie 5 µL DNA ladder (siehe Tabelle der Materialien) in einem separaten gut aus Ihren Proben.</li>
	<li>Electrophorese die Proben 35 min bei konstanter 90 V, dann das Gel zu entfernen und in einem UV-Transilluminator.</li>
	<li>Fotografieren und analysieren das Gel Streifen Muster bei der Verwendung von UV-Durchleuchtung bei 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu und Zheng Qing Fu erklären keine Interessenkonflikte.

Es ist wichtig, dass alle Schritte befolgt werden, genau um optimale Versuchsbedingungen zu erreichen. Ganze Blattgewebe diente während dieser Demonstration; das Protokoll kann theoretisch jede Art von Pflanzengewebe enthalten angepasst werden. Bisher haben Forscher Vene Blattgewebe, anstatt ganze Blattgewebe genomischen DNA entzogen und ähnliche Ergebnisse11erreicht. Wenn die Band das citrus FBOX -gen entsprechend nicht angezeigt wird, das Ergebnis ist ungültig, und möglicherweise eine o...

Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, hat einen bedeutenden Verlust von Zitrusbäumen verursacht. Ein repräsentativer Fall ist Florida, wo die Krankheit voraussichtlich eine Ermäßigung von 70 % in der Produktion von Florida orange-Boxen von 244 Millionen Kisten in der Saison 1997-1998 70 Millionen Kisten ab 2016-2017 Staffel1zufügen. Über 90 % der Zitrusbäume in Florida sind infizierte2, und es wird geschätzt, dass der Zitrusindustrie Florida etwa 1 Milliarde Dollar pro Jahr wegen Zitrusfrüchten Krankheiten verliert wobei citrus Greening eine wichtige Rolle-3 spielt. Citrus Greening wird in erster Linie durch die invasive asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, verbreitet aber auch durch Pfropfung des infizierten Gewebes. verteilt werden können Die Krankheit verursacht Gelbfärbung der Venen, asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, vorzeitige entblätterung, Zweig absterben, Wurzel Verfall und Tod der Pflanze. Wichtig ist, verursacht die Krankheit die Zitrusfrüchte Pflanze Blumen in der Nebensaison zu produzieren, die nur selten Früchte zu produzieren. Die Frucht, die durch infizierte Zitruspflanzen entsteht sind unreif, grün und bitter schmecken4.
Der Zweck dieser Methode ist es, genau und bewegliche Bakterium Verbindung Liberibacter spp., dem Erreger der citrus Greening, Leben in das Phloem von infizierten Zitrusbäume5genau zu bestimmen. Genomischer DNA entzogen ganze Blattgewebe, die Leben Bakterien enthält. Diese extrahierte genomische DNA dient als Vorlage für konventionelle PCR wo Oligonukleotide ergänzen das Bakterium 16 s rDNA Sequenz verwendet werden, um diese Sequenz zu verstärken. Oligonukleotide, die komplementär zu einem Zitrus FBOX gen dienen als eine interne Amplifikationskontrolle. Wir haben diese Methode verwenden, weil es nachweislich um in der bisherigen Forschung6erfolgreich zu sein.
Diese Methode hat den klaren Vorteil, einfach, kostengünstig und in der Lage, in jedem normal ausgestatteten Biochemie Labor durchgeführt werden. Darüber hinaus bleibt die PCR die genaue und präzise Methode zur Erkennung von dieser Erreger, wegen der Schwierigkeit der Kultivierung dieser Erreger-7und der Erreger Fähigkeit zu überleben und sich fortzupflanzen, seit Jahren im Rahmen einer asymptomatischen Host-8. Viele andere Spezialität-PCR-Assays wurden verwendet, um erfolgreich diese Erreger erkennen; konventionelle PCR bleibt jedoch der einfachste Test für präzise und spezifische Erkennung, vor allem innerhalb von asymptomatischen Gastgeber8.

<table><tbody><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Quelle für Zellkernlyse-, RNase-, Proteinfällungs- und DNA-Rehydrationslösungen</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro mit Bedienfeld</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Mikrowelle</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 digitales Wasserbad</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Metallspatel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Mörser und Stößel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Steril 10 μ; L Spitzen</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Steril 200 &mu; L Spitzen</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1250 &mu; L-Spitzen</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer-Kit mit variablem Volumen</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Küvette</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Stapelbare Gießschale und Kämme</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospektrometer basic</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL PCR</td><td>Gefäße Fisher scientific</td><td>AB-0620</td> 1,5 mL <td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td> Reverse Primer Thermo Fisher Scientific N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser, PCR-Qualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA-Leiter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

spezifische und präzise erkennung von citrus greening erreger verbindung liberibacter spp mit konventionellen pcr auf citrus blatt gewebeproben

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus Greening, auch bekannt als Huanglongbing, ist eine zerstörerische Zitrus Krankheit verwüsten Zitrusfrucht Betriebe weltweit. Diese Krankheit verursacht asymmetrische gelbes Blatt Marmorierung, Vene Vergilbung, entblätterung, Wurzel Verfall und letztlich der Tod der Zitrusfrüchte Pflanze. Wenn infiziert, die Zitruspflanzen haben Wachstumsstörungen und Blumen außerhalb der Saison zu produzieren. Diese Blumen bringen selten Obst, und diejenigen, die kleine, bitter, unregelmäßig geformte Zitrusfrüchte, die nachgeben sind nicht erwünscht. Diese Krankheit ist durch die asiatische citrus Psyllid Diaphorina Citri, und durch die Pfropfung von infizierten Zitrusfrüchten Gewebe verteilt. Der Erreger hat eine lange und Variable Inkubationszeit innerhalb der Zitrusfrüchte Pflanze – manchmal Jahre, bevor Symptome auftreten. Versuche, dieses Erregers in Vitro Kultur unterlegen, möglicherweise aufgrund der geringen und unebenen Konzentration des Erregers innerhalb von Zitrusfrüchten Gewebe infiziert, oder weil es schwierig ist, die Umwelt zu replizieren Bedingungen förderlich für Wachstum der der Erreger. Es ist sehr schwierig, die Krankheit zu identifizieren, bevor es sich ausgebreitet hat, aufgrund seiner langen Inkubationszeit und Forscher Unfähigkeit zur Kultur des Erregers. Dadurch zeigt sich die Krankheit erst nach der Zerstörung plötzlich ein Zitrus Bauer gesamte Ausbeute. Hier ist eine Methode für die genaue und spezifische Erkennung des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. mit einem genomische DNA-Extraktion Kit und PCR. Diese Methode ist einfach, effizient, kostengünstig und flexibel für die Quantitative Analyse. Diese Methode kann für den Einsatz auf jedem Zitrus Gewebe angepasst werden; jedoch wird es möglicherweise durch die Menge der Erreger im Gewebe vorhanden begrenzt. Allerdings wird diese Methode zulassen, dass Zitrusfrüchte Landwirte infizierten Zitruspflanzen früher zu identifizieren und die Ausbreitung dieser zerstörerischen Krankheit einzudämmen, bevor sie weiter verbreiten kann.

Ein positives Ergebnis ergibt sich eine deutliche Band entspricht 500 bp für Verbindung Liberibacter Asiaticus Las606/Lss6, und/oder eine ausgeprägte Band entspricht 700 bp für Laa2/Laj5, Beilage in der 16 s ribosomalen β Operon9. Die interne Verstärkung kontrollbande muss auch immer am 400 bp. Diese Band Verstärkung der Zitrusfrüchte FBOX gen10entspricht, und müssen für ei...

Citrus Greening ist eine besonders destruktive Erkrankung Zitrusfrüchte Kulturen weltweit. Hier ist eine einfache Methode PCR und genomische DNA-Extraktion von Zitrusfrüchten Blattgewebe für die genaue und präzise Identifikation des Erregers citrus Greening, Verbindung Liberibacter spp. verwenden

Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Citrus Greening-Erreger Candidatus liberibacter spp. im Zitrusblattgewebe genau nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht es Zitrusbauern und Forschern, schnell und genau das Vorhandensein von Krankheitserregern zu identifizieren, die für das Citrus Greening verantwortlich sind.Das Verfahren wird von Ian Palmer, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Diese Methode ist effizient, kostengünstig und für die quantitative Analyse anpassbar. Darüber hinaus kann es mit einem Mindestmaß an Laborerfahrung und -ausrüstung durchgeführt werden.Schneiden Sie zuerst mit einer sauberen Schere ein ganzes frisches Blatt von einem Zitrusbaum ab und legen Sie es in eine saubere Plastiktüte. Kühlen Sie dann einen Mörser und einen Stößel, indem Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff hinzufügen. Schneide dann mit der Schere kleine Stücke des Blattgewebes ab, die etwa einen Quadratzentimeter groß sind.Lege die Blattstücke in den Mörser, um sie sofort einzufrieren. Beginnen Sie schnell mit dem Mahlen des Blattgewebes mit dem Mörser, bis der flüssige Stickstoff verdampft ist und ein feines grünes Pulver übrig bleibt. Als nächstes kühlen Sie e

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Forschung

JoVE Journal

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Umwelt

Quelle: Gulla, S., et al. Multi-Locus-Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels multiplexer PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Protokoll extrahiert genomische DNA aus Yersinia ruckeri, indem isolierte Kolonien in ultrareines Wasser suspendiert und Wärme zur Lyseierung der Zellen anwendet. Die Zentrifugation trennt den DNA-haltigen Supernatanten von Zellresten und liefert so Vorlagen-DNA, die für PCR-basierte Genotypisierung und...

Gewinnung von genomischer DNA aus Pflanzenblattgewebe, das mit pathogenen Bakterien infiziert ist

Quelle: Chen, H., et al. Spezifischer und genauer Nachweis des Zitrus-Greening-Erregers Candidatus liberibacter spp. mittels konventioneller PCR an Zitrusblattgewebeproben. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Gewinnung der gesamten genomischen DNA aus Zitrusblattgewebe, das mit einem pathogenen Bakterium infiziert ist. Das Protokoll ermöglicht eine zuverlässige DNA-Rückgewinnung für den nachgelagerten PCR-basierten Nachweis des phloembegrenzten Erregers.

Extraktion der Gesamt-DNA aus Blättern zur Erkennung bakterieller Infektionen

Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Schnelle und präzise Erkennung von Krankheitserregern vor Ort, vor allem bodenbürtige Pflanzenpathogene, ist wichtig zur Vermeidung weiterer Inokulum Produktion und Verbreitung von Pflanzenkrankheiten im Feld. Die entwickelte Methode hier über eine tragbare Echtzeit-PCR-Detection-System ermöglicht vor Ort Diagnose unter Feldbedingungen.

Vor-Ort-molekulare Erkennung von bodenbürtige Phytopathogene mit einem tragbaren Echtzeit-PCR-System

Dieses Papier berichtet das Protokoll für eine schnelle Identifizierung Assay für Tabak Tabaci basierend auf Loop-vermittelten isothermen (Lampe)-Verstärkungstechnologie. Das Protokoll erfordert minimal Labor Ausbildung und kann, daher, an Grenzübergangsstellen für Pflanze Importe wie Seehäfen und Flughäfen vor Ort umgesetzt werden.

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

Wir haben eine Methode entwickelt, um Phytophthora capsici zoospores in Wasserquellen mit einer Filterpapier-DNA-Extraktionsmethode in Verbindung mit einem schleifenvermittelten isothermen Amplifikationstest (LAMP) zu detektieren, der im Feld oder im Labor analysiert werden kann.

Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation

In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.

Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a

Wir haben ein Instrument entwickelt, hergestellt und validiert, das phloemreiches Rindenknospenknospengewebe schnell verarbeitet. Im Vergleich zu aktuellen Methoden hat der Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) den Probendurchsatz erhöht und die erforderlichen Arbeits- und Gerätekosten gesenkt.

Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik

Dieses Manuskript beschreibt ein neuartiges direktes Pflanzeninfusionsgerät zum Screening der Wirksamkeit von Molekülen gegen das Bakterium (Candidatus Liberibacter asiaticus) oder seinen Insektenvektor (Diaphorina citri, Kuwayama), die in Kombination mit der Huanglongbing-Zitruskrankheit assoziiert sind.

Direktinfusionsgerät zur Molekülabgabe in Pflanzen

In diesem Protokoll wird ein kombinierter Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-CRISPR/Cas12a-Assay für den Nachweis des invasiven Pflanzenpathogens Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 dargestellt.

Kombinierte Rekombinase-Polymerase-Amplifikation CRISPR/Cas12a-Assay zum Nachweis von Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Hier beschreiben wir ein einfaches und schnelles Verfahren zum Nachweis von DNA von Bienenpathogenen, wie z.B. Lotmaria passim und Nosema ceranae, unter Verwendung einer amplifikationsbereiten Zelllyse, einer Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und CRISPR/Cas12a-Assays.

Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System

Lernen Sie eine PCR-basierte Methode zur Erkennung von Candidatus Liberibacter spp. in Zitrusblattgewebe. Diese effiziente Technik ermöglicht Landwirten und Forschern eine schnelle, präzise Diagnose von Citrus Greening.

Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben (Video) | JoVE Journal

Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben

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