Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Citrus Greening-Erreger Candidatus liberibacter spp. im Zitrusblattgewebe genau nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht es Zitrusbauern und Forschern, schnell und genau das Vorhandensein von Krankheitserregern zu identifizieren, die für das Citrus Greening verantwortlich sind.

Das Verfahren wird von Ian Palmer, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Diese Methode ist effizient, kostengünstig und für die quantitative Analyse anpassbar. Darüber hinaus kann es mit einem Mindestmaß an Laborerfahrung und -ausrüstung durchgeführt werden.

Schneiden Sie zuerst mit einer sauberen Schere ein ganzes frisches Blatt von einem Zitrusbaum ab und legen Sie es in eine saubere Plastiktüte. Kühlen Sie dann einen Mörser und einen Stößel, indem Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff hinzufügen. Schneide dann mit der Schere kleine Stücke des Blattgewebes ab, die etwa einen Quadratzentimeter groß sind.

Lege die Blattstücke in den Mörser, um sie sofort einzufrieren. Beginnen Sie schnell mit dem Mahlen des Blattgewebes mit dem Mörser, bis der flüssige Stickstoff verdampft ist und ein feines grünes Pulver übrig bleibt. Als nächstes kühlen Sie einen Metallspatel 10 bis 15 Sekunden lang in flüssigem Stickstoff.

Verwenden Sie dann den kalten Spatel, um das gemahlene Gewebe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Mörtel zu schöpfen. Verwenden Sie eine 1000-ml-Pipette, um der Probe 600 ml Kernlyselösung hinzuzufügen. Anschließend wird die Probe ein bis drei Sekunden lang vortext.

Inkubieren Sie das Röhrchen bei 65 Grad Celsius 15 Minuten lang in einem Wasserbad. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um 3 ml RNA-Lösung zum Lykat hinzuzufügen, um RNA zu entfernen. Mischen Sie dann den Inhalt der Tube, indem Sie sie zwei- bis fünfmal umdrehen.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Schrankinkubator. Nach 15 Minuten geben Sie 200 ml Proteinfällungslösung in die Probe. Wirbeln Sie das Rohr 20 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit durch.

Zentrifugieren Sie anschließend die Probe drei Minuten lang bei 13000 g. Während der Zentrifugation werden 600 ml Isopropanol, das bei Raumtemperatur gehalten wird, in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Nachdem die Zentrifugation beendet ist, entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen in das Röhrchen, das Isopropanol enthält.

Entsorgen Sie das Pellet. Drehen Sie das Röhrchen um, damit die DNA wie ein fadenartiger Strang sichtbar ist. Zentrifugieren Sie anschließend die Probe bei 13000 g für eine Minute bei Raumtemperatur.

Dekantieren Sie den Überstand nach der Zentrifugation. Fügen Sie dann 600 ml 70%iges Ethanol zum Pellet hinzu. Drehen Sie das Rohr mehrmals um, um das Pellet zu waschen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 13000 g. Nach Beendigung der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig abgesaugt. Drehen Sie dann die Tube bei geöffnetem Deckel auf ein saugfähiges Papier um und trocknen Sie sie 15 Minuten lang an der Luft.

Nach dem Trocknen 100 ml DNA-Rehydrationslösung zum Pellet geben. Inkubieren Sie die DNA-Suspension bei 65 Grad Celsius in einem Wasserbad für eine Stunde. Klopfen Sie während des Mischens regelmäßig auf die Tube.

1 ml gereinigtes Wasser in eine Mikroküvette geben. Lesen Sie das Wasser auf dem Spektralphotometer als Leerzeichen ab. Geben Sie dann 1 ml der Probe in die Mikroküvette.

Legen Sie die Mikroküvette auf das Spektralphotometer und ermitteln Sie die DNA-Konzentration. Stellen Sie die PCR-Reaktion her, indem Sie alle Reagenzien und 100 Nanogramm genomische DNA in ein 50-ml-PCR-Röhrchen geben. Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schnippen, gefolgt von einer schnellen Zentrifugation.

Legen Sie das PCR-Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Um das Agarose-Gel zuzubereiten, wiegen Sie 0,4 Gramm Agarosepulver. Geben Sie dann das Agarosepulver in einen 200ML Erlenmeyerkolben und stellen Sie das Volumen auf 50ML mit 1X TAE-Puffer ein.

Die Agarosemischung ca. 1,5 Minuten auf hoher Stufe in der Mikrowelle erhitzen. Alle 30 Sekunden schütteln, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Fügen Sie als nächstes 2,5 ml 10 Milligramm pro Milliliter Ethidiumbromid zur flüssigen Agarose hinzu.

Schütteln Sie dann den Kolben, um das Ethidiumbromid zu mischen, und gießen Sie das flüssige Agarosegel schnell in eine ebene Gelform. Führen Sie sofort einen Standard-Gelkamm mit 12 Zähnen ein. Lassen Sie das Gel etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie dann den Gelkamm.

Geben Sie nun das erstarrte Gel in die mit 1X TAE-Puffer gefüllte Elektrophoreseeinheit. Laden Sie die gesamte amplifizierte DNA-Probe und später 5 ml DNA in separate Vertiefungen auf das Gel. Starten Sie die Elektrophoreseeinheit bei konstanten 90 Volt für 35 Minuten.

Entfernen Sie dann das Gel aus der Elektrophoreseeinheit. Legen Sie das Gel anschließend auf einen UV-Transilluminator. Nehmen Sie die Fotos der Gelstreifenmuster im Transilluminator bei 302 Nanometern auf.

Um das Greening-Bakterium zu identifizieren, werden die PCR-amplifizierten genomischen DNAs, die sowohl aus infizierten als auch aus nicht infizierten Proben gewonnen wurden, elektrophoresiert. Im Gel weisen diese Banden, die 500 Basenpaaren entsprechen, auf das Vorhandensein einer spezifischen Region der Ribosomen-DNA Las16S im Bakterium CL asiaticas hin. Diese Banden, die 700 Basenpaaren entsprechen, weisen auf das Vorhandensein von LAA2/LAJ5 und dem in der ribosomalen 16S-Beta-Operon-DNA-Sequenz im Bakterium vorhandenen Insert hin.

Diese unterschiedlichen Banden bei 400 Basenpaaren deuten auf die Amplifikation nur des Zitrus-F-Box-Gens hin, das sich auf die interne Amplifikationskontrolle bezieht. Um unsere Ergebnisse als gültig zu betrachten, ist das Vorhandensein dieser Bande erforderlich. Im Gegenteil, das Vorhandensein nur einer Bande bei 400 Basenpaaren, aber das Fehlen der anderen Banden bei 500 und 700 Basenpaaren deutet auf ein gesundes Zitrusgewebe hin.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um die Durchführung quantitativerer Methoden wie RTQPCR zum Nachweis der vorhandenen Erregermenge zu ermöglichen.