Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe einer mikrofluidischen Plattform ein perfusionierbares Gefäßnetzwerk in einem mehrzelligen Aggregat oder Sphäroid zu konstruieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der alternativen Form von Bereichen der regenerativen Medizin zu beantworten, z. B. wie wichtig ein vaskuläres Netzwerk in vivo- und in vitro-Gewebemodellen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Weg der Verabreichung von Medikamenten und Nahrungsergänzungsmitteln in vitro simuliert werden kann, indem interessante Regionen direkt in die Sphäroide eingebracht werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die Zellen in den Zielbereich des mikrofluidischen Geräts einzuführen. Nach dem Gießen des PDMS-Prepolymers wird das Material zwei Stunden lang in einer Vakuumkammer entgast und anschließend über Nacht bei 80 Grad Celsius in einem belüfteten Ofen ausgehärtet. Am nächsten Morgen schälen Sie das PDMS vom Siliziumwafer und erzeugen mit einem Locher von zwei Millimetern Durchmesser an den angegebenen Stellen Löcher in das Material.

Verwenden Sie eine Stanze mit einem Durchmesser von einem Millimeter, um die Sphäroidvertiefung zu erzeugen, und verwenden Sie Klebeband, um die PDMS-Platte und einen 24 x 24 Millimeter großen Glasdeckglas zu reinigen. Behandeln Sie die saubere Platte 40 Sekunden lang mit Luftplasma und kleben Sie die PDMS-Platte auf den Deckglas. Härten Sie dann das PDMS mindestens 12 Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus.

Geben Sie zwei bis drei Tage vor der Aussaat des mikrofluidischen Geräts dreimal 10 bis das fünfte frisch aufgetaute hLF, RFP-HUVECs und GFP-HUVECs zu 10 Millilitern frischem Endothelmedium in einer 10-Millimeter-Schale. Wenn die hLFs und RFP-HUVECs die Subkonfluenz erreichen, suspendieren Sie die hLFs und RFP-HUVECs im Endothelmedium auf Endkonzentrationen von 1,0 mal 10 bis zur fünften bzw. 2,5 mal 10 bis zur vierten Zelle pro Millimeter. Nach zwei Tagen in der Suspensionskultur in einer Biosicherheitswerkbank ein 99-Mikroliter-Tröpfchen frisch zubereiteter Mastermix-Lösung in die Mitte einer 35-Millimeter-Petrischale auf Eis geben.

Um das mikrofluidische Gerät zu beladen, verwenden Sie eine modifizierte 100-Mikroliter-Mikropipettenspitze, um ein Sphäroid und 100 Mikroliter Medium in eine zweite Petrischale mit Raumtemperatur zu übertragen. Aspirieren Sie dann das Sphäroid in einer minimalen Menge Medium und drehen Sie die Pipette aufrecht, so dass sich das Sphäroid durch die Schwerkraft zum unteren Rand der Pipettenspitze bewegt. Berühren Sie die Pipettenspitze mit dem Meniskus des Mastermix-Tröpfchens, um das Sphäroid in die Lösung auszustoßen, ohne den Pipettenkolben zu drücken.

Geben Sie dann schnell einen Mikroliter frisch zubereitetes Thrombin zu dem Tröpfchen und mischen Sie das Thrombin vorsichtig in die Lösung. Übertragen Sie die Pipette auf sieben Mikroliter langsam in die Sphäroidvertiefung der PDMS-Platte. Der kritischste Schritt des Verfahrens ist die Injektion des Sphäroids mit genügend Gel, damit sich das Sphäroid am Boden des Geräts absetzen kann.

Entfernen Sie nach dem Laden vorsichtig die Pipettenspitze, um ein Auslaufen zwischen den Mikrostiften zu verhindern. Inkubieren Sie das Sphäroid 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wenn das Fibrin erstarrt ist, injizieren Sie langsam 20 bis 30 Mikroliter Endothelmedium in die Löcher eins A und drei A, um die Kanäle eins bzw. drei zu laden.

Übertragen Sie dann das Gerät auf ein feuchtes Labortuch in einer 100-Millimeter-Schale und inkubieren Sie das Gerät 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, um die Entfernung von Blasen an der Grenzfläche zwischen dem Medium und dem Fibrin zu erleichtern. Am nächsten Tag fügen Sie zwei Milliliter 0,05%iges Trypsin-EDTA zu den subkonfluenten GFP-HUVECs hinzu und stoppen Sie die Trypsinreaktion mit vier Millilitern vollständigem Medium, wenn sich die Zellen vollständig abgelöst haben. Sammeln Sie die Endothelzellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Endothelmedium in einer Konzentration von fünfmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter.

Injizieren Sie als Nächstes 20 Mikroliter HUVECs in Loch eins B, um Kanal eins zu laden, und platzieren Sie das Gerät 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, in einem 90-Grad-Winkel geneigt, um sicherzustellen, dass die HUVECs am Fibrin in Kanal zwei haften. Nachdem Sie Kanal drei auf die gleiche Weise geladen haben, legen Sie das Gerät für sieben bis 14 Tage in eine neue 100-Millimeter-Schale mit einem feuchten Labortuch im Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie täglich die Hälfte des Mediums in den Kanälen eins und drei. Diese repräsentativen Bilder, die am Tag Null der HUVEC-Beladung aufgenommen wurden, zeigen Fibringel, das nur in Kanal zwei geladen wurde, ohne Leckage in Kanal eins oder drei und mit den HUVECs, die erfolgreich an der Seitenwand des Fibringels befestigt sind.

Es kann auch beobachtet werden, dass sich das Sphäroid richtig an der Unterseite des Geräts absetzt. Angiogene Sprossen werden ab dem ersten Tag beobachtet, wobei der längste Spross das Sphäroid am dritten Tag dieses Experiments erreicht und die meisten angiogenen Sprossen das Sphäroid am siebten Tag erreichen. Optimalerweise kann nach vier Tagen in dem Gerät ein Fluss durch die Gefäßlumen beobachtet werden, wobei der Gefäßwinkel als Richtung der Gefäßspitze und des Zentrums des Sphäroids von der Gefäßwurzel definiert ist.

Die Gefäßwinkel nehmen zeitabhängig ab, was auf eine Wanderung der angiogenen Sprossen in Richtung des Sphäroids hinweist. RFP und GFP-HUVECs können koordiniert ein einzelnes Gefäßlumen bilden, was deutlich zeigt, wie angiogene Sprossen aus den Kanälen eins und drei anastomosiert zu RFP-HUVECs im Sphäroid sprießen, um ein kontinuierliches Gefäßnetzwerk zu bilden. Weiterhin fließt FITC-Dextran, das in Kanal eins injiziert wird, in das konstruierte Gefäßnetzwerk und das Innere des Sphäroids und erreicht schließlich Kanal drei, was bedeutet, dass das integrierte Gefäßnetzwerk Nährstoffe für das Sphäroid bereitstellen und Abfallprodukte aus ihm entfernen könnte.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im organisch-elektrischen Bereich, um die Wirksamkeit von Medikamenten oder Nahrungsergänzungsmitteln von Interesse in In-vitro-Gewebemodellen zu untersuchen.