Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören
10. März 2018
Ein Flow Cytometry-basierten zellulären Bindung Assay beschrieben wird, die in erster Linie als Screening-Instrument verwendet wird, um Verbindungen zu identifizieren, die die Bindung eines Eindringmittel beschrifteten CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) an den CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen.
Das übergeordnete Ziel des zellbasierten Assays ist es, Moleküle zu identifizieren, die an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor binden. Basierend auf ihrer Fähigkeit, mit einem fluoreszenzmarkierten Liganden um die Bindung an den Rezeptor zu konkurrieren. Der Konkurrenzbindungsassay kann die Entdeckung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren unterstützen.
Wie wir mit diesem Protokoll für den Chemokinrezeptor CXC4 zeigen werden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass lebende Zellen anstelle von Gedächtnispräparaten zur Analyse der rezeptiven Bindung verwendet werden. Und dass die Verwendung von Radioaktivitätsmarkierungssonden vermieden wird.
Obwohl diese Methode ursprünglich entwickelt wurde, um die Bindung an den Chemokinrezeptor CXCR4 zu untersuchen, kann sie auch für andere GPCR entwickelt werden, für die fluoreszenzmarkierte Liganden existieren. Zu Beginn geben Sie 100 Mikroliter der Verbindungslösung in eine klare, gut abgerundete Bodenplatte mit 96 Zähnen gemäß einem vordefinierten Versuchslayout. Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension aus einem Reagenzreservoir mit einer Mehrkanalpipette in die 96-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter fluoreszenzmarkiertes CXCL12 mit 100 Nanogramm pro Milliliter aus einem ähnlichen Reagenzreservoir in die Vertiefungen der 96-Well-Platte gegeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Zentrifugieren Sie anschließend die 96-Well-Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400-facher Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen, indem Sie die Platte umdrehen. Trocknen Sie die Platte auf einem Taschentuch.
Geben Sie 200 Mikroliter frischen SA-Puffer aus einem Reagenzreservoir mit einer Mehrkanalpipette in die Vertiefungen. Fahren Sie sofort mit der erneuten Zentrifugation der Platte fort, und zwar fünf Minuten lang bei 400-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand erneut, indem Sie die Platte umdrehen und dann auf einem Taschentuch trocknen.
Zum Schluss resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 200 Mikrolitern 1%-Paraformaldehyd, gelöst in PBS. In diesem Schritt werden die Zellen fixiert. Um die Proben durchflusszytometrisch zu analysieren, starten Sie das Gerät und öffnen Sie die entsprechende Software.
Wählen Sie die zellularen Parameter aus, die in einem Punktblockformat visualisiert werden sollen, als Vorwärtsstreubereich, als Seitenstreubereich und in einer Histogrammansicht als Fluoro-Vier-Detektionskanal. Wählen Sie eine Stichprobe aus. Zum Beispiel eine Negativkontrollprobe, um ein Gating einer definierten homogenen Zellpopulation auf der Grundlage der Parameter Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung durchzuführen.
Passen Sie die Einstellungen für das Laden der Zellen in das Durchflusszytometriegerät an. Wählen Sie vor der Injektion drei Mischungen aus. Wählen Sie die automatische Injektion von 100 Mikrolitern fixierter Zellen und verwenden Sie eine Probenflussrate von 1,5 Mikrolitern pro Sekunde.
Führen Sie das Beispiel aus, indem Sie Daten abrufen auswählen. Die Parameter für die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung für diese Probe sowie die Fluor-Vier-Detektion werden nun auf dem Bildschirm angezeigt. Wählen Sie nun das Software-Gating-Tool aus.
Basierend auf der Visualisierung des Forward-Scatter- und des Side-Scatter-Dot-Plots können Sie eine homogene und lebensfähige Zellpopulation durch Gating vordefinieren. Wählen Sie diese Option aus, um 20.000 Ereignisse pro Stichprobe zu analysieren. Das bedeutet, dass für jede Probe 20.000 Zellen analysiert werden, die innerhalb eines vordefinierten Gates liegen.
Die Datenerfassung wird fortgesetzt, bis diese Anzahl von Ereignissen erreicht ist. Starten Sie den Lauf, indem Sie zuerst die zu analysierenden Bohrungen auswählen. Wählt dann Run Wells aus.
Das Durchflusszytometriegerät analysiert nun diese Proben nacheinander, indem es die mittlere Fluoreszenzintensität für jede Probe aufzeichnet. Das entspricht dem mittleren Fluoreszenzsignal der 20.000 Zellen, die innerhalb des vordefinierten Gates liegen. Führen Sie abschließend die Datenanalyse durch, wie im Protokoll beschrieben.
Nach Vorinkubation von Jurkat-Zellen mit hohen Konzentrationen von AMD3100, nicht etablierten und spezifischen CXCR4-Antagonisten. Die mittlere Fluoreszenzintensität, die die Bindung von markiertem CXCL12 widerspiegelt, wird fast vollständig auf das Hintergrundniveau reduziert. Dies zeigt die hochspezifische Bindung von CXCL12 an CXCR4, das auf Jurkatzellen exprimiert wird.
Verbindungen, die nicht in der Lage sind, mit markiertem CXCL12 um die Bindung an den CXCR4-Rezeptor zu konkurrieren, wie der CCR5-Antagonist Maraviroc, beeinflussen die mittlere Fluoreszenzintensität nicht. Im Gegensatz dazu tun hochaktive Verbindungen dies dosisabhängig. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen wettkampfrezeptiven Bindungsassay mit lebenden Zellen und Durchflusszytometrie durchführen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt einen auf der Durchflusszytometrie basierenden zellulären Bindungsassay, der darauf abzielt, Verbindungen zu identifizieren, welche die Bindung von CXCL12 an CXCR4 hemmen. Die Methode nutzt lebende Zellen zur Analyse der Rezeptorbindung und vermeidet dabei den Einsatz radioaktiver Markierungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zelluläre Bindungsassays
- GPCRs (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren)
- Wirkstofffindung
Hintergrund
- CXCL12 ist ein Chemokin, das an CXCR4, einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, bindet.
- Die Identifizierung von Hemmstoffen dieser Bindung kann die Arzneimittelentwicklung unterstützen.
- Herkömmliche Methoden beinhalten oft Radioaktivität, was bei diesem Assay vermieden werden soll.
- Die Verwendung lebender Zellen ermöglicht eine genauere Darstellung biologischer Wechselwirkungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Screening-Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen, die die Bindung von CXCL12 an CXCR4 hemmen.
- Aufzeigen der Vorteile der Verwendung lebender Zellen in Bindungsassays.
- Unterstützung der Arzneimittelentdeckung für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.
Verwendete Methoden
- Durchflusszytometrie zur Analyse der zellulären Bindung.
- Verwendung fluoreszenzmarkierter Liganden zur Beurteilung der Bindungskonkurrenz.
- Lebendzellanalysen zur Bewertung von Rezeptorinteraktionen.
- Verzicht auf radioaktive Markierung im experimentellen Aufbau.
Hauptergebnisse
- Der Test identifiziert erfolgreich Verbindungen, die die Bindung von CXCL12 hemmen.
- Die Analyse lebender Zellen liefert relevantere Daten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Die Methode eignet sich zur Untersuchung potenzieller Wirkstoffkandidaten.
- Die Ergebnisse belegen die Durchführbarkeit des Assays in der Wirkstoffforschung.
Schlussfolgerungen
- Der auf Durchflusszytometrie basierende Assay ist ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung von CXCR4-Inhibitoren.
- Die Verwendung lebender Zellen erhöht die Genauigkeit von Bindungsstudien.
- Der Verzicht auf Radioaktivität vereinfacht den experimentellen Ablauf.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Mit diesem auf Durchflusszytometrie basierenden Wettbewerbs-Bindungsassay können Biopharma-Teams kleine Moleküle identifizieren, die die Interaktion zwischen CXCL12 und CXCR4 stören – ein wichtiger Ansatzpunkt in der Onkologie und bei entzündlichen Erkrankungen. Durch die Verwendung lebender Zellen und fluoreszierender Liganden vermeidet die Methode Radioaktivität und liefert gleichzeitig physiologisch relevante Bindungsdaten. Sie unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und die Identifizierung von Leitverbindungen, indem sie quantitative und reproduzierbare Messwerte für die Priorisierung von Substanzen bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Messung direkter Wirkstoffeffekte auf die Rezeptor-Ligand-Bindung in einem nativen zellulären Kontext.
- Operationaler Wert: Liefert einen funktionellen Endpunkt, der CXCR4 als Zielstruktur entrisst, indem die mechanistische Bestätigung der Wirkstoffaktivität erfolgt.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem Verbindungen mit dosisabhängigen Hemmprofilen identifiziert werden, die auf eine Zielstrukturengagement hinweisen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Daten zur Bindungshemmung mittels mittlerer Fluoreszenzintensität und ermöglicht dadurch die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehung.
- Operativer Wert: Anpassbar an das 96-Loch-Plattenformat, wodurch die Durchsatzkapazität für Screening-Kampagnen erhöht wird, während die Konsistenz des Assays erhalten bleibt.
- Wiederverwendbarkeit: Schafft eine standardisierte Plattform, die auf andere GPCRs übertragbar ist, sofern fluoreszierende Liganden verfügbar sind, und reduziert damit den Aufwand für Neuentwicklungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verwendet lebende Jurkat-Zellen, um die physiologische Rezeptor-Expression und Bindungsdynamik widerzuspiegeln, wodurch die translatorische Relevanz verbessert wird.
- Operationeller Wert: Erzeugt Daten, die mit der nachgeschalteten präklinischen Evaluierung kompatibel sind, indem die zielgerichteten Wirkstoffeffekte bestätigt werden.
- Risikominderung: Verringert falsch-positive Ergebnisse, indem spezifische CXCR4-Inhibitoren von unspezifischen Verbindungen unterschieden werden (z. B. zeigt Maraviroc keine Wirkung).
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für den Entdeckungsprozess von der Zielvalidierung bis zur Leittreffer-Identifizierung und liefert Bindungsdaten, die den Übergang vom Treffer zum Leittreffer unterstützen. Er ergänzt die phänotypische Bildschirmanalyse, indem er der Charakterisierung von Verbindungen eine mechanistische Tiefe verleiht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung der durch Verbindungen hervorgerufenen Störung der Bindung von CXCL12 an CXCR4 in lebenden Zellen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft des Assays durch standardisierte Inkubations-, Wasch- und Fixierungsschritte, die mit Durchflusszytometrie-Auswertungen kompatibel sind.
- Analytik: Liefert die mittlere Fluoreszenzintensität als quantitative Ausgabe zur Beurteilung und Vergleichung der Potenz und Wirksamkeit von Verbindungen bei verschiedenen Dosen.
- Translationale Forschung: Verwendet eine krankheitsrelevante Zelllinie (Jurkat), die CXCR4 exprimiert, und verknüpft Bindungsdaten mit einem potenziellen therapeutischen Nutzen bei Krebs und Entzündungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als modulares Bindungsplattform-Assay, der auf andere GPCR-Ziele übertragbar ist, und maximiert so die Rendite der Investitionen in die Assay-Entwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Zielstrukturenbindung, indem spezifische, verdrängbare Bindung von CXCL12 an CXCR4 nachgewiesen wird.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Zellbehandlung, Inkubationszeiten und Durchflusszytometrie-Gating-Protokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem Verbindungen ohne zielstrukturnspezifische Aktivität früh im Entdeckungsprozess aussortiert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem Verbindungen mit klaren dosisabhängigen Hemmprofilen identifiziert werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Bedienung von Durchflusszytometern, der Kompensation und der Gating-Strategien für lebensfähige Zellpopulationen.
- Setzt den Zugang zu Durchflusszytometern voraus, die in der Lage sind, fluoreszierende Signale in den entsprechenden Kanälen (z. B. FITC oder äquivalent) zu detektieren.
- Erfordert die Standardisierung der Zellpräparation, der Verdünnung von Verbindungen und der Inkubationsbedingungen über alle Screening-Durchläufe hinweg.
- Die Anpassung an andere GPCRs erfordert die Entwicklung oder Beschaffung von spezifischen, fluoreszenzmarkierten Liganden für den Zielrezeptor.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Dauer des Assays (~90 Minuten zuzüglich Analysezeit) und die Notwendigkeit, die Ligandenkonzentration zu optimieren, um robuste Signal-Rausch-Verhältnisse sicherzustellen.
