Name: Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Gel-Seq-Methode zur gleichzeitigen DNA- und RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung aus kleinen Zellpopulationen mit Hydrogel-Matrizen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht Multi-Omics-Analysen.

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Mittel für diese Arbeit wurde von der Universität von San Diego, die National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, NIH R01-HG007836 gewähren, und vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen.
Frühere Versionen von ein paar Zahlen wurden zuerst in "Hoople, G. D. Et Al. veröffentlicht. Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren. Lab-on-Chip 17, 2619-2630, Doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Labor auf einem Chip hat die Wiederverwendung von Abbildungen in dieser Publikation sanktioniert.

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<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
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<li>Hoople, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-seq%3A+whole-genome+and+transcriptome+sequencing+by+simultaneous+low-input+DNA+and+RNA+library+preparation+using+semi-permeable+hydrogel+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers.</a> Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%26T-seq%3A+parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li>
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<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).</li>
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</ol>

KZ ist Mitbegründer und wissenschaftlicher Berater des Singlera Genomics Inc.

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die mit der Gel-Seq-Gerät-Fertigung sowie das Protokoll selbst verbunden. Während der Fertigung empfiehlt es sich, beginnend mit der vorgeschriebenen Schichtdicken für die verschiedenen Regionen des Gels. Wir verbrachten viel Zeit verschiedene Herstellung Testmöglichkeiten und das hier beschriebene Protokoll produziert die besten Geräte für die Kassetten, die in der Tabelle der Werkstoffe und Reagenzienaufgeführt. Wenn Forscher eine alternative Kassettensystem verwenden...

Nächste Generation sequencing (NGS) hatte eine profunde Auswirkung auf dem Weg, die Genetik geforscht wird. Wo Forscher einmal auf die Sequenzierung des Genoms eine ganze Spezies konzentriert, ist es nun möglich, das Genom einer einzigen Tumors oder sogar eine einzelne Zelle in einem Experiment sequentiell. 1 NGS hat auch kostengünstig zu den RNA-Transkripte gefunden innerhalb einer Zelle, eine Sammlung von Daten, bekannt als das Transkriptom Sequenzierung gemacht. Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. 2 , 3 , 4 leider Standardprotokolle sind unvereinbar und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine gegebene Probe DNA oder RNA-Sequenz. Wenn eine Start Stichprobe groß genug ist, kann es in zwei Hälften aufgeteilt werden. Bei kleineren Maßstäben Materialverlust durch Spaltung Proben kann Bibliothek Qualität beeinflussen und Bündelung von Proben kann durchschnittlich interessante Variationen zwischen den Zellen. 5 im übrigen interessieren sich Forscher zunehmend bei der Prüfung von Proben, die nicht können, z. B. Einzelzellen oder kleine heterogene Tumor Biopsien gespalten werden. 6
Um dieses Problem zu beheben, drei Protokolle vor kurzem wurden entwickelt, um aus der gleichen Ausgangspunkt Probe DNA und RNA Sequenz: Gel-Seq7, G &amp; T-Seq8und DR-Seq-9. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für Gel-Seq, die verwendet werden, um gleichzeitig DNA- und RNA-Bibliotheken von nur 100 Zellen bei vernachlässigbaren Kosten erzeugen kann. Der neue Aspekt der Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA basiert ausschließlich auf Größe mit low-cost Hydrogel Matrizen zu trennen. Die Kern-Innovation des Gel-Seq-Protokolls ist die physische Trennung der DNA von RNA. Diese Trennung erfolgt elektrophoretisch mit einer Kombination aus Polyacrylamid-Membranen, die die Größenunterschiede zwischen diesen Molekülen nutzen. Um diese Größenunterschiede in Zusammenhang zu setzen, zu prüfen, wie DNA und RNA abgebildet werden: während DNA vorhanden auf der Micron-Skala ist und eingesehen werden traditionelle Mikroskopie, RNA existiert auf der Nanometerskala und komplexe Techniken wie Cryo-Elektron abgebildet werden muss Mikroskopie. 10
Der Ansatz zur Trennung von DNA und RNA in diesem Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. Die linke Tafel zeigt, dass DNA und RNA frei schwebend in Lösung in der Nähe von einer Membran. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wie auf der rechten Seite gezeigt, erleben DNA und RNA eine elektrophoretische Kraft, die Migration durch die Membran induziert. Durch die Membran Eigenschaften optimieren, schufen wir eine semipermeable Membran, die DNA von RNA trennt. Die DNA-Moleküle sind gegen die Membran gedrückt, aber verfangen am Rande wegen ihrer großen Größe. Auf der anderen Seite können kleine RNA-Moleküle, konfigurieren und schlängeln sich durch die Membran. Dieser Prozeß, bekannt als Reptation, ähnelt die Art, wie, die eine Schlange durch Rasen bewegt. Schließlich sind diese RNA-Moleküle durch eine zweite, mit hoher Dichte Membran, die zu schwierig für noch kleinere Polymere ist gestoppt (&gt; 200 Basenpaaren), durch Winden. Einmal physisch getrennt, kann um Informationen über das Genom und Transkriptom zu generieren DNA und RNA erholt und verarbeitet werden. Während wir DNA und RNA trennen können, haben wir gefunden, dass bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn die RNA transkribiert, cDNA vor der Trennung umgekehrte ist. Die DNA/RNA-Hybriden sind stabiler als RNA allein und können noch durch die Dichte Membran passieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Abbildung 1 . Gel-Seq operative Prinzip. Das zugrunde liegende Prinzip verwendet, um räumliche Trennung von DNA und RNA. In einem angewandten elektrischen Feld kleine RNA-Moleküle Wandern durch die Dichte Membran aber große DNA-Moleküle sind an der Oberfläche gefangen. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von ref 7 wiedergegeben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Dieses Papier beschreibt ausführlich sowohl die Herstellung von Gel-Seq-Gerät und das biologische Protokoll generieren gepaart DNA- und RNA-Bibliotheken. Eine Übersicht der beiden ist in Abbildung 2dargestellt. Das Gerät ist durch Schichtung drei unterschiedliche Dichte Polyacrylamid Gele übereinander in einem Prozess ähnlich erstellen standard Stapeln Gele hergestellt. 11 das biologische Protokoll beginnt mit 100-1000 Zellen mit PBS-Puffer suspendiert. Die Zellen lysiert und die RNA in cDNA umgewandelt wird, bevor das Gerät verwendet wird, um die genomische DNA aus der DNA/RNA-Hybriden zu trennen. Nach der Trennung und Verwertung, genomische und transkriptomischen sind Bibliotheken zubereitet einen Prozess, der das gesamte Genom Standardbibliothek Vorbereitung Kit Protokoll verfolgt. Weitere Details über die Entwicklung und Validierung von Gel-Seq abgelesen werden im Labor auf einem Chip-Veröffentlichung "Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Abbildung 2 . Gel-Seq Protokoll. Eine Übersicht über die Schritte, die Gel-Seq-Gerät und das Protokoll zum generierten gepaarten DNA und RNA Bibliotheken zu fabrizieren. Teile davon wurden mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von Ref. 7 wiedergegeben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Um DNA und RNA Bibliotheken aus einzelnen Zellen zu generieren, Forscher sollten erwägen, entweder G &amp; T-Seq oder DR-f-G &amp; T-FF, wie Gel-Seq, stützt sich auf eine räumliche Trennung von RNA aus genomischer DNA. Dieser Ansatz stützt sich auf Boten-RNA (mRNA) 3′ Polyadenylated Schweif als Pulldown-Ziel. Die mRNA wird auf eine magnetische Perle biotinylierte Oligo-dT Grundierung mit erfasst. Sobald die mRNA eingefangen hat die Perlen mit einem Magneten in Position gehalten werden und der Überstand mit der genomischen DNA entfernt und in einem anderen Gefäß übertragen werden kann. Nachdem diese körperliche Trennung abgeschlossen ist, können separate Bibliotheken aus der mRNA und DNA generiert werden. 8 dieser Ansatz funktioniert gut, wenn die RNA von Interesse Polyadenylated ist, kann nicht jedoch es verwendet werden, nicht Polyadenylated Abschriften, wie ribosomaler RNA, tRNA oder RNA von Prokaryoten zu studieren.
DR-Seq stützt sich auf eine Vorverstärkung Schritt wo DNA und cDNA abgeleitet von RNA in der gleichen Röhre verstärkt werden. Die Probe wird dann in zwei Teile gespalten und parallel, DNA und RNA-Seq Bibliotheken vorzubereiten verarbeitet. Zur Unterscheidung zwischen genomischer DNA und die cDNA abgeleitet von RNA, nimmt DR-Seq einen rechnerischen Ansatz. Sequenzen, in denen nur Exons vorhanden sind werden rechnerisch in der genomischen DNA-Daten, unterdrückt, wie diejenigen aus entweder DNA oder RNA entstanden sein könnte. 9 ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die DNA und DNA/RNA nicht räumlich getrennt sein müssen wie in Gel-Seq und G &amp; T-seq. Der Nachteil ist jedoch, dass DR-Seq a-priori Kenntnis des Genoms und Transkriptom (d.h. Exons und Introns erfordert), und möglicherweise nicht ideal für Anwendungen wie z. B. Sequenzierung von Kernen, in denen viele Transkripte noch nicht vollständig sind gespleißt und weiterhin enthalten Introns. 12
Der neuartige Aspekt des Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA in Hunderten von Zellen ausschließlich anhand der Größe trennen. Diese Methode erfordert kein priori Kenntnis des Genoms oder Transkriptom, ist robust gegen unvollständige Spleißen und beschränkt sich nicht auf Poly-Adenylated-Protokolle. Für Anwendungen, wo ein Forscher mit mindestens 100 Zellen beginnen kann, bietet Gel-Seq ein einfaches Verfahren mit billigen und allgemein zugänglichen Materialien.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid-Monomer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Im Text als Festphasen-Reversible-Immobilisierungskügelchen (SPRI) bezeichnet</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Ladefarbstoff (6x)</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich</td><td>R0611</td><td>Im Text als 6X Ladefarbstoff</td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Im Text als 2X qPCR Mix</td></tr> bezeichnet <tr><td>N,N&prime;-Methylenbis(acrylamid)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Auch bekannt als Bis-Acrylamid</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (im Text als Library Preparation Kit bezeichnet)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Enthält: TD (im Text als Transposase-Puffer bezeichnet), ATM (im Text als Transposase bezeichnet), NT (im Text als Transposase-Stopp-Puffer bezeichnet) und NPM (im Text als PCR-Mix für die Bibliotheksvorbereitung bezeichnet)</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (im Text als Whole-Transcript Amplification (WTA) Kit bezeichnet)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>Enthält: Lysepuffer, RNase-Inhibitor, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (im Text als RT-Primer bezeichnet), 5X Ultra Low First Strand Buffer (im Text als Erststrangpuffer bezeichnet), SMART-Seq v4 Oligonukleotid (im Text als Template-Switch-Oligonukleotid (TSO) bezeichnet), SMART-Scribe Reverse Transkriptase (im Text als reverse Transkriptase bezeichnet) und PCR Primer II A (im Text als cDNA-PCR-Primer bezeichnet)</td></tr><tr><td>Zufälliges Hexamer mit WTA-Adapter</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Oberflächendekontaminationsmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp; &nbsp;</td><td>Im Text als Produkt zur DNA-Entfernung bezeichnet</td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA-Puffer (10-fache Konzentration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold-Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000-faches Konzentrat in DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Im Text als Gel-Färbung</td></tr> bezeichnet<tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; Spritzennadeln, Stärke 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Branson CPX Serie Ultraschallbad</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Leere Gelkassetten, mini, 1,0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Mesh-Filterplatte - Corning&nbsp; HTS Transwell 96 gut durchlässige Stützen - 8.0 &micro; m Porengröße</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Im Text bezeichnet als 8 um Mesh Filterplatte</td></tr><tr><td>PowerPac HC Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Nachweissystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Nicht mehr erhältlich, jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Im Text als Gel Imager</td></tr><tr><td>bezeichnet Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Im Text als UV Transilluminator</td></tr> bezeichnet<tr><td>&nbsp; Ultraschall&nbsp; Bad</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Jedes gleichwertige Ultraschallbad ist akzeptabel.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: eine methode zur gleichzeitigen sequenzierung bibliothek vorbereitung von dna und rna mit hydrogel matrizen

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. Leider die Standardprotokolle für Erzeugung von genomischen oder transkriptomischen Bibliotheken sind nicht kompatibel und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine besondere Probe DNA oder RNA-Sequenz. Gel-Seq löst dieses Problem durch Forscher um gleichzeitig Bibliotheken für DNA und RNA beginnend mit 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren. Wir konzipiert Gel-Seq so, dass es leicht von anderen Forschern umgesetzt werden könnten; viele Genetik Labore verfügen bereits über die notwendige Ausrüstung, die Gel-Seq-Gerät-Herstellung zu reproduzieren. Unser Protokoll beschäftigt häufig verwendete Kits für beide ganz-Transkript Verstärkung (WTA) und Bibliothek Vorbereitung, die auch bereits Forscher vertraut sein dürften versiert in der Erzeugung von genomischen und transkriptomischen Bibliotheken. Unser Ansatz ermöglicht Forschern, bringen die Kraft der DNA und RNA Sequenzierung auf einer einzigen Probe ohne Spaltung mit unwesentlichen zusätzlichen Kosten zu tragen.

Die räumliche Trennung von gDNA und DNA/RNA-Hybriden in der Gel-Seq-Gerät kann durch fluoreszierende Gel Imaging sichtbar gemacht werden; ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 3dargestellt. Zentrale A zeigt die fabrizierte Gel-Seq-Gerät; falsche Farbe wurde hinzugefügt, um die verschiedenen Gel-Regionen zu unterscheiden. Zentrale B zeigt eine Nahaufnahme von vier verschiedenen Trennungen für die Validierung verwendet. Die dritte Spur, eine Negativkont...

Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken sowohl aus der DNA als auch aus der RNA kleiner Zellpopulationen zu generieren, ohne dass die Probe an irgendeinem Punkt geteilt werden muss. Diese Methode bietet Forschern einen neuen Ansatz, um die strukturellen Variationen der DNA bei der Expression von Genen zu untersuchen. Als wir uns Gel-seq ausgedacht haben, gab es keine Protokolle für die gleichzeitige Sequenzierung von DNA und RNA aus derselben Probe.Glücklicherweise gibt es mittlerweile drei veröffentlichte Ansätze, die dieses Problem lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl genomische als auch transkriptomische Informationen aus derselben Gruppe von Zellen zu vernachlässigbaren zusätzlichen Kosten gewonnen werden können. Gel-seq wurde ursprünglich mit aufrechten Kassetten entwickelt, dieses Protokoll kann jedoch an jede Standard-Gelelektrophoresekassette angepasst werden.Bereiten Sie den Füllstoff, die Vorläufermischungen mit hoher Dichte und die Vorläufermischungen mit niedriger Dichte in drei Röhrchen vor. Fügen Sie die Reagenzien in der beschriebenen Reihenfolge hinzu und wirbeln Sie die Mischung ein. Fügen Sie weder APS noch Temed vorzeitig hinzu.Warten Sie, bis Sie angewiesen werden. Entgasen Sie anschließend jede Gelmonomerlösung, indem Sie zuerst eine Nadel durch die Kappe einführen. Dann schließen Sie die Nadel an eine Hausvakuumleitung an und tauchen Sie diese Baugruppe in ein Ultraschallbad.Warten Sie etwa eine Minute, bis keine Blasen mehr aus der Flüssigkeit austreten. Als nächstes wird das Temed und das APS in die Füllstoff-Vorläufermischung gegeben und kurz vortext. Verwenden Sie innerhalb von drei Minuten eine Ein-Millimeter-Pipette, um sechs Millimeter zu jeder Gelkassette hinzuzufügen, ohne zu verschütten.Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit waagerecht ist, indem Sie die Kassetten aufrecht auf einem ebenen Tisch positionieren. Füllen Sie dann die Kassetten nach und nach mit entgastem, ionisiertem Wasser auf und achten Sie darauf, die Vermischung der polymerisierenden Mischung mit dem Wasser zu minimieren. Lassen Sie das Polymer dann eine Stunde bis über Nacht aushärten.Sobald das Polymer ausgehärtet ist, schütten Sie die Wasserschicht aus und verwenden Sie aus einer Entfernung von sechs Zentimetern einen sanften Druckluftstrom, um die Oberfläche des Gels zu trocknen. Fügen Sie als Nächstes Temed und APS zum Vorläufer des Gels mit hoher Dichte hinzu und wirbeln Sie es kurz ein. Übertragen Sie innerhalb von drei Minuten 320 Mikroliter auf jede Kassette und verteilen Sie sie auf der Füllgelschicht, indem Sie die Kassette einige Male hin und her bewegen.Füllen Sie dann die Kassetten mit entionisiertem, entgastem Wasser auf und lassen Sie das Polymer etwa eine Stunde lang aushärten. Trocknen Sie das Polymer nach dem Aushärten wie zuvor ab. Fügen Sie schließlich Temed und APS zu der Gel-Vorläufermischung mit niedriger Dichte hinzu und wirbeln Sie sie ein.Füllen Sie dann schnell den Rest der Kassetten mit dieser Mischung und setzen Sie die Gelkämme ein, bevor es mit dem Aushärten beginnt. Geben Sie nun den Überschuss an Reservevorläufer über den Waben, der während der Polymerisation adsorbiert werden soll. Nach dem Aushärten ist die Kassette gebrauchsfertig.Nachdem Sie die RNA in cDNA umgewandelt haben, verwenden Sie ein Gel, um die interessierende Fraktion zurückzugewinnen. Reinigen Sie zunächst die Elektrophoresekammer gründlich mit mehreren Millilitern eines DNA-Entfernungsprodukts und einem fusselfreien Tuch. Füllen Sie dann die Kammer mit sauberem Nullkomma-Fünf-XTBE und stellen Sie das gesamte Gerät in einen 254-Nanometer-UV-Vernetzungsofen und sterilisieren Sie es 15 Minuten lang.Setzen Sie nun eine Gel-seq-Kassette in die Elektrophoresekammer ein und verriegeln Sie sie. Entfernen Sie dann langsam den Gelkamm, indem Sie ihn vorsichtig nach oben ziehen, ohne das Gel zu zerreißen. Laden Sie nun die Proben mit einer Pipette.Führen Sie die Spitze beim Laden der Proben vollständig in die Vertiefungen ein, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zwischen den Vertiefungen zu minimieren. Legen Sie 30 Minuten lang ein elektrisches Feld von 250 Volt über die Gel-Seq-Kassette an, um die gDNA von den cDNA/RNA-Hybriden zu trennen. Nachdem Sie das Gel geladen, ausgeführt und gesammelt haben, verwenden Sie ein Skalpell, um das Gel direkt unter der Schicht mit hoher Dichte in zwei Hälften zu schneiden, und entsorgen Sie die Hälfte des Füllgels.Ziehen Sie dann das restliche Gel vorsichtig von der Kassette ab, indem Sie vorsichtig ein Schaberwerkzeug verwenden. Nachdem Sie die Trennung mit einem Geldokument überprüft haben, verwenden Sie einen Transilluminator, um die Banden zu entfernen. Die gDNA sollte sich am Anfang des Gels mit niedriger Dichte befinden, und die cDNA sollte sich an der Grenzfläche zwischen den Regionen mit niedriger und hoher Dichte befinden.Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Bereiche des Gels aus, die gDNA und cDNA enthalten. Entfernen Sie auch die gleichen Abschnitte von der negativen Kontrollspur. Übertragen Sie die Abschnitte des Gels mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig in Streifenröhrchen.Wenn das Gel zerbricht, suchen Sie alle zerbrochenen Teile und übertragen Sie sie in die Tube. Als nächstes mahlen Sie jedes Gel mit kreisenden Bewegungen ab und drücken Sie es mit einer Pipettenspitze. Bevor Sie die Spitzen entfernen, fügen Sie der gDNA 40 Mikroliter nukleasefreies Wasser und den cDNA-Proben 80 Mikroliter hinzu.Entfernen Sie dann vorsichtig die Spitzen und entsorgen Sie sie. Befestigen Sie nun die Streifenröhrchen an einem Wirbelmischer bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie acht bis 12 Stunden lang. Die DNA wird sich so dem Gel entziehen.Pipettieren Sie die Proben nach dem Schütteln in eine Filterplatte mit einer Maschenweite von acht Mikrometern. Drehen Sie dann die Platte fünf Minuten lang bei 2.600 g, um die Gelfragmente abzuseihen. Heben Sie anschließend die Netzfilterplatte von der Gehäuseplatte ab und übertragen Sie die gelfreien Proben mit einer Pipette von der Platte in neue 200-Mikroliter-Streifenröhrchen.Zu jeder Probe, die gDNA enthält, einen Mikroliter Protease hinzufügen und auf und ab pipettieren, um sie gut zu vermischen. Inkubieren Sie die Proben dann 15 Minuten lang bei 50 Grad Celsius. Anschließend eine Heizungsaktivierung bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten durchführen.Dieser Schritt der Nukleosomenverarmung ist entscheidend. Verwenden Sie anschließend eine 18-Gauge-Nadel, um ein Loch in die Kappe jedes Probenröhrchens zu stechen. Verwenden Sie dann einen Vakuum, um die gDNA-Proben auf fünf Mikroliter und die cDNA-Proben auf 10 Mikroliter zu reduzieren.Wenn das Volumen unter das Zielwert fällt, fügen Sie bei Bedarf nukleasefreies Wasser hinzu. gDNA- und cDNA/RNA-Hybride wurden mit dem Gel-seq-Gerät physikalisch getrennt. Die Negativkontrolle hat keine Autofluoreszenz des Gels an den Grenzflächen.Die DNA-Leiter zeigen nur eine dunkle Bande an der Grenzfläche zwischen der Membran niedriger und hoher Dichte, was darauf hindeutet, dass kleine Fragmente das Gel mit niedriger Dichte passieren können. Eine biologische Probe von 500 PC3-Zellen zeigt die gewünschte Trennung von genomischer DNA und cDNA/RNA-Hybriden. Eine dunkle Bande an der Spitze der Membran niedriger Dichte ist genomische DNA im Megabasenmaßstab, während die cDNA/RNA-Hybride an der Grenzfläche zwischen den Regionen mit niedriger und hoher Dichte gestapelt sind.Die kleinen Fragmente unter 100 Basenpaaren sind Off-Target-Produkte, die während der reversen Transkription aus Primer-Oligonukleotiden erzeugt werden, und sind zu erwarten. Die Bibliotheken wurden aus 500 PC3-Zellen oder 750 HeLa-Zellen generiert. Die Fragmentverteilungen aus den übereinstimmenden Bibliotheken, die aus Gel-seq generiert wurden, wurden mit nicht übereinstimmenden Proben verglichen, die mit Standardprotokollen erzeugt wurden.Die Verteilung der Nukleotidfragmente war bei beiden Methoden ähnlich. Die Sequenzierungsergebnisse der PC3-Zellbibliothek wurden mit herkömmlichen Methoden verglichen. Genomweite Variationen der Kopienzahl wurden verglichen.Statistisch gesehen erzielten die beiden Methoden ähnliche Ergebnisse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gepaarte Next Generation Sequencing-Bibliotheken für DNA und RNA aus derselben Ausgangsprobe generieren können. Wie bei jedem Sequenzierungsexperiment mit geringem Input ist es unerlässlich, daran zu denken, eine saubere Arbeitsumgebung zu schaffen.Auf das Sterilisieren von Röhrchen und das Reinigen von Handschuhen sollten Sie besonders achten. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahmen scheitern Experimente gelegentlich an Kontaminationen. Ein wichtiger Hinweis: Die Allgegenwart und Sicherheit von Polyacrylamid-Gelen lässt leicht vergessen, dass es sich bei den Vorläufern der Herstellung um gefährliche Neurotoxine handelt.Sie sollten mit diesen Reagenzien immer in einem Abzug arbeiten und verschüttete Flüssigkeiten sofort beseitigen. Wir haben Gel-seq so konzipiert, dass es für Forscher einfach zu implementieren ist, und wir hoffen, dass dies die schnelle Einführung dieser Technologie erleichtern wird.

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

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Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

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Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

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Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

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