Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken sowohl aus der DNA als auch aus der RNA kleiner Zellpopulationen zu generieren, ohne dass die Probe an irgendeinem Punkt geteilt werden muss. Diese Methode bietet Forschern einen neuen Ansatz, um die strukturellen Variationen der DNA bei der Expression von Genen zu untersuchen. Als wir uns Gel-seq ausgedacht haben, gab es keine Protokolle für die gleichzeitige Sequenzierung von DNA und RNA aus derselben Probe.

Glücklicherweise gibt es mittlerweile drei veröffentlichte Ansätze, die dieses Problem lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl genomische als auch transkriptomische Informationen aus derselben Gruppe von Zellen zu vernachlässigbaren zusätzlichen Kosten gewonnen werden können. Gel-seq wurde ursprünglich mit aufrechten Kassetten entwickelt, dieses Protokoll kann jedoch an jede Standard-Gelelektrophoresekassette angepasst werden.

Bereiten Sie den Füllstoff, die Vorläufermischungen mit hoher Dichte und die Vorläufermischungen mit niedriger Dichte in drei Röhrchen vor. Fügen Sie die Reagenzien in der beschriebenen Reihenfolge hinzu und wirbeln Sie die Mischung ein. Fügen Sie weder APS noch Temed vorzeitig hinzu.

Warten Sie, bis Sie angewiesen werden. Entgasen Sie anschließend jede Gelmonomerlösung, indem Sie zuerst eine Nadel durch die Kappe einführen. Dann schließen Sie die Nadel an eine Hausvakuumleitung an und tauchen Sie diese Baugruppe in ein Ultraschallbad.

Warten Sie etwa eine Minute, bis keine Blasen mehr aus der Flüssigkeit austreten. Als nächstes wird das Temed und das APS in die Füllstoff-Vorläufermischung gegeben und kurz vortext. Verwenden Sie innerhalb von drei Minuten eine Ein-Millimeter-Pipette, um sechs Millimeter zu jeder Gelkassette hinzuzufügen, ohne zu verschütten.

Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit waagerecht ist, indem Sie die Kassetten aufrecht auf einem ebenen Tisch positionieren. Füllen Sie dann die Kassetten nach und nach mit entgastem, ionisiertem Wasser auf und achten Sie darauf, die Vermischung der polymerisierenden Mischung mit dem Wasser zu minimieren. Lassen Sie das Polymer dann eine Stunde bis über Nacht aushärten.

Sobald das Polymer ausgehärtet ist, schütten Sie die Wasserschicht aus und verwenden Sie aus einer Entfernung von sechs Zentimetern einen sanften Druckluftstrom, um die Oberfläche des Gels zu trocknen. Fügen Sie als Nächstes Temed und APS zum Vorläufer des Gels mit hoher Dichte hinzu und wirbeln Sie es kurz ein. Übertragen Sie innerhalb von drei Minuten 320 Mikroliter auf jede Kassette und verteilen Sie sie auf der Füllgelschicht, indem Sie die Kassette einige Male hin und her bewegen.

Füllen Sie dann die Kassetten mit entionisiertem, entgastem Wasser auf und lassen Sie das Polymer etwa eine Stunde lang aushärten. Trocknen Sie das Polymer nach dem Aushärten wie zuvor ab. Fügen Sie schließlich Temed und APS zu der Gel-Vorläufermischung mit niedriger Dichte hinzu und wirbeln Sie sie ein.

Füllen Sie dann schnell den Rest der Kassetten mit dieser Mischung und setzen Sie die Gelkämme ein, bevor es mit dem Aushärten beginnt. Geben Sie nun den Überschuss an Reservevorläufer über den Waben, der während der Polymerisation adsorbiert werden soll. Nach dem Aushärten ist die Kassette gebrauchsfertig.

Nachdem Sie die RNA in cDNA umgewandelt haben, verwenden Sie ein Gel, um die interessierende Fraktion zurückzugewinnen. Reinigen Sie zunächst die Elektrophoresekammer gründlich mit mehreren Millilitern eines DNA-Entfernungsprodukts und einem fusselfreien Tuch. Füllen Sie dann die Kammer mit sauberem Nullkomma-Fünf-XTBE und stellen Sie das gesamte Gerät in einen 254-Nanometer-UV-Vernetzungsofen und sterilisieren Sie es 15 Minuten lang.

Setzen Sie nun eine Gel-seq-Kassette in die Elektrophoresekammer ein und verriegeln Sie sie. Entfernen Sie dann langsam den Gelkamm, indem Sie ihn vorsichtig nach oben ziehen, ohne das Gel zu zerreißen. Laden Sie nun die Proben mit einer Pipette.

Führen Sie die Spitze beim Laden der Proben vollständig in die Vertiefungen ein, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zwischen den Vertiefungen zu minimieren. Legen Sie 30 Minuten lang ein elektrisches Feld von 250 Volt über die Gel-Seq-Kassette an, um die gDNA von den cDNA/RNA-Hybriden zu trennen. Nachdem Sie das Gel geladen, ausgeführt und gesammelt haben, verwenden Sie ein Skalpell, um das Gel direkt unter der Schicht mit hoher Dichte in zwei Hälften zu schneiden, und entsorgen Sie die Hälfte des Füllgels.

Ziehen Sie dann das restliche Gel vorsichtig von der Kassette ab, indem Sie vorsichtig ein Schaberwerkzeug verwenden. Nachdem Sie die Trennung mit einem Geldokument überprüft haben, verwenden Sie einen Transilluminator, um die Banden zu entfernen. Die gDNA sollte sich am Anfang des Gels mit niedriger Dichte befinden, und die cDNA sollte sich an der Grenzfläche zwischen den Regionen mit niedriger und hoher Dichte befinden.

Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Bereiche des Gels aus, die gDNA und cDNA enthalten. Entfernen Sie auch die gleichen Abschnitte von der negativen Kontrollspur. Übertragen Sie die Abschnitte des Gels mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig in Streifenröhrchen.

Wenn das Gel zerbricht, suchen Sie alle zerbrochenen Teile und übertragen Sie sie in die Tube. Als nächstes mahlen Sie jedes Gel mit kreisenden Bewegungen ab und drücken Sie es mit einer Pipettenspitze. Bevor Sie die Spitzen entfernen, fügen Sie der gDNA 40 Mikroliter nukleasefreies Wasser und den cDNA-Proben 80 Mikroliter hinzu.

Entfernen Sie dann vorsichtig die Spitzen und entsorgen Sie sie. Befestigen Sie nun die Streifenröhrchen an einem Wirbelmischer bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie acht bis 12 Stunden lang. Die DNA wird sich so dem Gel entziehen.

Pipettieren Sie die Proben nach dem Schütteln in eine Filterplatte mit einer Maschenweite von acht Mikrometern. Drehen Sie dann die Platte fünf Minuten lang bei 2.600 g, um die Gelfragmente abzuseihen. Heben Sie anschließend die Netzfilterplatte von der Gehäuseplatte ab und übertragen Sie die gelfreien Proben mit einer Pipette von der Platte in neue 200-Mikroliter-Streifenröhrchen.

Zu jeder Probe, die gDNA enthält, einen Mikroliter Protease hinzufügen und auf und ab pipettieren, um sie gut zu vermischen. Inkubieren Sie die Proben dann 15 Minuten lang bei 50 Grad Celsius. Anschließend eine Heizungsaktivierung bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten durchführen.

Dieser Schritt der Nukleosomenverarmung ist entscheidend. Verwenden Sie anschließend eine 18-Gauge-Nadel, um ein Loch in die Kappe jedes Probenröhrchens zu stechen. Verwenden Sie dann einen Vakuum, um die gDNA-Proben auf fünf Mikroliter und die cDNA-Proben auf 10 Mikroliter zu reduzieren.

Wenn das Volumen unter das Zielwert fällt, fügen Sie bei Bedarf nukleasefreies Wasser hinzu. gDNA- und cDNA/RNA-Hybride wurden mit dem Gel-seq-Gerät physikalisch getrennt. Die Negativkontrolle hat keine Autofluoreszenz des Gels an den Grenzflächen.

Die DNA-Leiter zeigen nur eine dunkle Bande an der Grenzfläche zwischen der Membran niedriger und hoher Dichte, was darauf hindeutet, dass kleine Fragmente das Gel mit niedriger Dichte passieren können. Eine biologische Probe von 500 PC3-Zellen zeigt die gewünschte Trennung von genomischer DNA und cDNA/RNA-Hybriden. Eine dunkle Bande an der Spitze der Membran niedriger Dichte ist genomische DNA im Megabasenmaßstab, während die cDNA/RNA-Hybride an der Grenzfläche zwischen den Regionen mit niedriger und hoher Dichte gestapelt sind.

Die kleinen Fragmente unter 100 Basenpaaren sind Off-Target-Produkte, die während der reversen Transkription aus Primer-Oligonukleotiden erzeugt werden, und sind zu erwarten. Die Bibliotheken wurden aus 500 PC3-Zellen oder 750 HeLa-Zellen generiert. Die Fragmentverteilungen aus den übereinstimmenden Bibliotheken, die aus Gel-seq generiert wurden, wurden mit nicht übereinstimmenden Proben verglichen, die mit Standardprotokollen erzeugt wurden.

Die Verteilung der Nukleotidfragmente war bei beiden Methoden ähnlich. Die Sequenzierungsergebnisse der PC3-Zellbibliothek wurden mit herkömmlichen Methoden verglichen. Genomweite Variationen der Kopienzahl wurden verglichen.

Statistisch gesehen erzielten die beiden Methoden ähnliche Ergebnisse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gepaarte Next Generation Sequencing-Bibliotheken für DNA und RNA aus derselben Ausgangsprobe generieren können. Wie bei jedem Sequenzierungsexperiment mit geringem Input ist es unerlässlich, daran zu denken, eine saubere Arbeitsumgebung zu schaffen.

Auf das Sterilisieren von Röhrchen und das Reinigen von Handschuhen sollten Sie besonders achten. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahmen scheitern Experimente gelegentlich an Kontaminationen. Ein wichtiger Hinweis: Die Allgegenwart und Sicherheit von Polyacrylamid-Gelen lässt leicht vergessen, dass es sich bei den Vorläufern der Herstellung um gefährliche Neurotoxine handelt.

Sie sollten mit diesen Reagenzien immer in einem Abzug arbeiten und verschüttete Flüssigkeiten sofort beseitigen. Wir haben Gel-seq so konzipiert, dass es für Forscher einfach zu implementieren ist, und wir hoffen, dass dies die schnelle Einführung dieser Technologie erleichtern wird.