Name: Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Gel-Seq-Methode zur gleichzeitigen DNA- und RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung aus kleinen Zellpopulationen mit Hydrogel-Matrizen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht Multi-Omics-Analysen.

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Mittel für diese Arbeit wurde von der Universität von San Diego, die National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, NIH R01-HG007836 gewähren, und vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen.
Frühere Versionen von ein paar Zahlen wurden zuerst in "Hoople, G. D. Et Al. veröffentlicht. Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren. Lab-on-Chip 17, 2619-2630, Doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Labor auf einem Chip hat die Wiederverwendung von Abbildungen in dieser Publikation sanktioniert.

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</ol>

KZ ist Mitbegründer und wissenschaftlicher Berater des Singlera Genomics Inc.

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die mit der Gel-Seq-Gerät-Fertigung sowie das Protokoll selbst verbunden. Während der Fertigung empfiehlt es sich, beginnend mit der vorgeschriebenen Schichtdicken für die verschiedenen Regionen des Gels. Wir verbrachten viel Zeit verschiedene Herstellung Testmöglichkeiten und das hier beschriebene Protokoll produziert die besten Geräte für die Kassetten, die in der Tabelle der Werkstoffe und Reagenzienaufgeführt. Wenn Forscher eine alternative Kassettensystem verwenden...

Nächste Generation sequencing (NGS) hatte eine profunde Auswirkung auf dem Weg, die Genetik geforscht wird. Wo Forscher einmal auf die Sequenzierung des Genoms eine ganze Spezies konzentriert, ist es nun möglich, das Genom einer einzigen Tumors oder sogar eine einzelne Zelle in einem Experiment sequentiell. 1 NGS hat auch kostengünstig zu den RNA-Transkripte gefunden innerhalb einer Zelle, eine Sammlung von Daten, bekannt als das Transkriptom Sequenzierung gemacht. Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. 2 , 3 , 4 leider Standardprotokolle sind unvereinbar und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine gegebene Probe DNA oder RNA-Sequenz. Wenn eine Start Stichprobe groß genug ist, kann es in zwei Hälften aufgeteilt werden. Bei kleineren Maßstäben Materialverlust durch Spaltung Proben kann Bibliothek Qualität beeinflussen und Bündelung von Proben kann durchschnittlich interessante Variationen zwischen den Zellen. 5 im übrigen interessieren sich Forscher zunehmend bei der Prüfung von Proben, die nicht können, z. B. Einzelzellen oder kleine heterogene Tumor Biopsien gespalten werden. 6
Um dieses Problem zu beheben, drei Protokolle vor kurzem wurden entwickelt, um aus der gleichen Ausgangspunkt Probe DNA und RNA Sequenz: Gel-Seq7, G &amp; T-Seq8und DR-Seq-9. Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für Gel-Seq, die verwendet werden, um gleichzeitig DNA- und RNA-Bibliotheken von nur 100 Zellen bei vernachlässigbaren Kosten erzeugen kann. Der neue Aspekt der Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA basiert ausschließlich auf Größe mit low-cost Hydrogel Matrizen zu trennen. Die Kern-Innovation des Gel-Seq-Protokolls ist die physische Trennung der DNA von RNA. Diese Trennung erfolgt elektrophoretisch mit einer Kombination aus Polyacrylamid-Membranen, die die Größenunterschiede zwischen diesen Molekülen nutzen. Um diese Größenunterschiede in Zusammenhang zu setzen, zu prüfen, wie DNA und RNA abgebildet werden: während DNA vorhanden auf der Micron-Skala ist und eingesehen werden traditionelle Mikroskopie, RNA existiert auf der Nanometerskala und komplexe Techniken wie Cryo-Elektron abgebildet werden muss Mikroskopie. 10
Der Ansatz zur Trennung von DNA und RNA in diesem Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. Die linke Tafel zeigt, dass DNA und RNA frei schwebend in Lösung in der Nähe von einer Membran. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wie auf der rechten Seite gezeigt, erleben DNA und RNA eine elektrophoretische Kraft, die Migration durch die Membran induziert. Durch die Membran Eigenschaften optimieren, schufen wir eine semipermeable Membran, die DNA von RNA trennt. Die DNA-Moleküle sind gegen die Membran gedrückt, aber verfangen am Rande wegen ihrer großen Größe. Auf der anderen Seite können kleine RNA-Moleküle, konfigurieren und schlängeln sich durch die Membran. Dieser Prozeß, bekannt als Reptation, ähnelt die Art, wie, die eine Schlange durch Rasen bewegt. Schließlich sind diese RNA-Moleküle durch eine zweite, mit hoher Dichte Membran, die zu schwierig für noch kleinere Polymere ist gestoppt (&gt; 200 Basenpaaren), durch Winden. Einmal physisch getrennt, kann um Informationen über das Genom und Transkriptom zu generieren DNA und RNA erholt und verarbeitet werden. Während wir DNA und RNA trennen können, haben wir gefunden, dass bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn die RNA transkribiert, cDNA vor der Trennung umgekehrte ist. Die DNA/RNA-Hybriden sind stabiler als RNA allein und können noch durch die Dichte Membran passieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Abbildung 1 . Gel-Seq operative Prinzip. Das zugrunde liegende Prinzip verwendet, um räumliche Trennung von DNA und RNA. In einem angewandten elektrischen Feld kleine RNA-Moleküle Wandern durch die Dichte Membran aber große DNA-Moleküle sind an der Oberfläche gefangen. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von ref 7 wiedergegeben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Dieses Papier beschreibt ausführlich sowohl die Herstellung von Gel-Seq-Gerät und das biologische Protokoll generieren gepaart DNA- und RNA-Bibliotheken. Eine Übersicht der beiden ist in Abbildung 2dargestellt. Das Gerät ist durch Schichtung drei unterschiedliche Dichte Polyacrylamid Gele übereinander in einem Prozess ähnlich erstellen standard Stapeln Gele hergestellt. 11 das biologische Protokoll beginnt mit 100-1000 Zellen mit PBS-Puffer suspendiert. Die Zellen lysiert und die RNA in cDNA umgewandelt wird, bevor das Gerät verwendet wird, um die genomische DNA aus der DNA/RNA-Hybriden zu trennen. Nach der Trennung und Verwertung, genomische und transkriptomischen sind Bibliotheken zubereitet einen Prozess, der das gesamte Genom Standardbibliothek Vorbereitung Kit Protokoll verfolgt. Weitere Details über die Entwicklung und Validierung von Gel-Seq abgelesen werden im Labor auf einem Chip-Veröffentlichung "Gel-Seq: Vollständiggenom und Transkriptom Sequenzierung durch gleichzeitige Low-Eingang DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitung mit semi-permeable Hydrogel Barrieren ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Abbildung 2 . Gel-Seq Protokoll. Eine Übersicht über die Schritte, die Gel-Seq-Gerät und das Protokoll zum generierten gepaarten DNA und RNA Bibliotheken zu fabrizieren. Teile davon wurden mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry von Ref. 7 wiedergegeben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Um DNA und RNA Bibliotheken aus einzelnen Zellen zu generieren, Forscher sollten erwägen, entweder G &amp; T-Seq oder DR-f-G &amp; T-FF, wie Gel-Seq, stützt sich auf eine räumliche Trennung von RNA aus genomischer DNA. Dieser Ansatz stützt sich auf Boten-RNA (mRNA) 3′ Polyadenylated Schweif als Pulldown-Ziel. Die mRNA wird auf eine magnetische Perle biotinylierte Oligo-dT Grundierung mit erfasst. Sobald die mRNA eingefangen hat die Perlen mit einem Magneten in Position gehalten werden und der Überstand mit der genomischen DNA entfernt und in einem anderen Gefäß übertragen werden kann. Nachdem diese körperliche Trennung abgeschlossen ist, können separate Bibliotheken aus der mRNA und DNA generiert werden. 8 dieser Ansatz funktioniert gut, wenn die RNA von Interesse Polyadenylated ist, kann nicht jedoch es verwendet werden, nicht Polyadenylated Abschriften, wie ribosomaler RNA, tRNA oder RNA von Prokaryoten zu studieren.
DR-Seq stützt sich auf eine Vorverstärkung Schritt wo DNA und cDNA abgeleitet von RNA in der gleichen Röhre verstärkt werden. Die Probe wird dann in zwei Teile gespalten und parallel, DNA und RNA-Seq Bibliotheken vorzubereiten verarbeitet. Zur Unterscheidung zwischen genomischer DNA und die cDNA abgeleitet von RNA, nimmt DR-Seq einen rechnerischen Ansatz. Sequenzen, in denen nur Exons vorhanden sind werden rechnerisch in der genomischen DNA-Daten, unterdrückt, wie diejenigen aus entweder DNA oder RNA entstanden sein könnte. 9 ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die DNA und DNA/RNA nicht räumlich getrennt sein müssen wie in Gel-Seq und G &amp; T-seq. Der Nachteil ist jedoch, dass DR-Seq a-priori Kenntnis des Genoms und Transkriptom (d.h. Exons und Introns erfordert), und möglicherweise nicht ideal für Anwendungen wie z. B. Sequenzierung von Kernen, in denen viele Transkripte noch nicht vollständig sind gespleißt und weiterhin enthalten Introns. 12
Der neuartige Aspekt des Gel-Seq ist die Fähigkeit, DNA und RNA in Hunderten von Zellen ausschließlich anhand der Größe trennen. Diese Methode erfordert kein priori Kenntnis des Genoms oder Transkriptom, ist robust gegen unvollständige Spleißen und beschränkt sich nicht auf Poly-Adenylated-Protokolle. Für Anwendungen, wo ein Forscher mit mindestens 100 Zellen beginnen kann, bietet Gel-Seq ein einfaches Verfahren mit billigen und allgemein zugänglichen Materialien.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid-Monomer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Im Text als Festphasen-Reversible-Immobilisierungskügelchen (SPRI) bezeichnet</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Ladefarbstoff (6x)</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich</td><td>R0611</td><td>Im Text als 6X Ladefarbstoff</td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Im Text als 2X qPCR Mix</td></tr> bezeichnet <tr><td>N,N&prime;-Methylenbis(acrylamid)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>Auch bekannt als Bis-Acrylamid</td></tr><tr><td>NexteraXT DNA Library Preparation Kit (im Text als Library Preparation Kit bezeichnet)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Enthält: TD (im Text als Transposase-Puffer bezeichnet), ATM (im Text als Transposase bezeichnet), NT (im Text als Transposase-Stopp-Puffer bezeichnet) und NPM (im Text als PCR-Mix für die Bibliotheksvorbereitung bezeichnet)</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Millipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (im Text als Whole-Transcript Amplification (WTA) Kit bezeichnet)</td><td>Takara/Clontech</td><td>634888</td><td>Enthält: Lysepuffer, RNase-Inhibitor, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (im Text als RT-Primer bezeichnet), 5X Ultra Low First Strand Buffer (im Text als Erststrangpuffer bezeichnet), SMART-Seq v4 Oligonukleotid (im Text als Template-Switch-Oligonukleotid (TSO) bezeichnet), SMART-Scribe Reverse Transkriptase (im Text als reverse Transkriptase bezeichnet) und PCR Primer II A (im Text als cDNA-PCR-Primer bezeichnet)</td></tr><tr><td>Zufälliges Hexamer mit WTA-Adapter</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Oberflächendekontaminationsmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp; &nbsp;</td><td>Im Text als Produkt zur DNA-Entfernung bezeichnet</td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA-Puffer (10-fache Konzentration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold-Nukleinsäure-Gel-Färbung (10.000-faches Konzentrat in DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Im Text als Gel-Färbung</td></tr> bezeichnet<tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; Spritzennadeln, Stärke 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Branson CPX Serie Ultraschallbad</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Leere Gelkassetten, mini, 1,0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Mesh-Filterplatte - Corning&nbsp; HTS Transwell 96 gut durchlässige Stützen - 8.0 &micro; m Porengröße</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Im Text bezeichnet als 8 um Mesh Filterplatte</td></tr><tr><td>PowerPac HC Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Nachweissystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>Jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Nicht mehr erhältlich, jede gleichwertige Hardware ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Gel Documentation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Im Text als Gel Imager</td></tr><tr><td>bezeichnet Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Im Text als UV Transilluminator</td></tr> bezeichnet<tr><td>&nbsp; Ultraschall&nbsp; Bad</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Jedes gleichwertige Ultraschallbad ist akzeptabel.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: eine methode zur gleichzeitigen sequenzierung bibliothek vorbereitung von dna und rna mit hydrogel matrizen

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Die Fähigkeit zu verstärken und aus kleinen Start Proben entweder DNA oder RNA-Sequenz wurde erst in den letzten fünf Jahren erreicht. Leider die Standardprotokolle für Erzeugung von genomischen oder transkriptomischen Bibliotheken sind nicht kompatibel und Forschern müssen entscheiden, ob Sie für eine besondere Probe DNA oder RNA-Sequenz. Gel-Seq löst dieses Problem durch Forscher um gleichzeitig Bibliotheken für DNA und RNA beginnend mit 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren. Wir konzipiert Gel-Seq so, dass es leicht von anderen Forschern umgesetzt werden könnten; viele Genetik Labore verfügen bereits über die notwendige Ausrüstung, die Gel-Seq-Gerät-Herstellung zu reproduzieren. Unser Protokoll beschäftigt häufig verwendete Kits für beide ganz-Transkript Verstärkung (WTA) und Bibliothek Vorbereitung, die auch bereits Forscher vertraut sein dürften versiert in der Erzeugung von genomischen und transkriptomischen Bibliotheken. Unser Ansatz ermöglicht Forschern, bringen die Kraft der DNA und RNA Sequenzierung auf einer einzigen Probe ohne Spaltung mit unwesentlichen zusätzlichen Kosten zu tragen.

Die räumliche Trennung von gDNA und DNA/RNA-Hybriden in der Gel-Seq-Gerät kann durch fluoreszierende Gel Imaging sichtbar gemacht werden; ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 3dargestellt. Zentrale A zeigt die fabrizierte Gel-Seq-Gerät; falsche Farbe wurde hinzugefügt, um die verschiedenen Gel-Regionen zu unterscheiden. Zentrale B zeigt eine Nahaufnahme von vier verschiedenen Trennungen für die Validierung verwendet. Die dritte Spur, eine Negativkont...

Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken sowohl aus der DNA als auch aus der RNA kleiner Zellpopulationen zu generieren, ohne dass die Probe an irgendeinem Punkt geteilt werden muss. Diese Methode bietet Forschern einen neuen Ansatz, um die strukturellen Variationen der DNA bei der Expression von Genen zu untersuchen. Als wir uns Gel-seq ausgedacht haben, gab es keine Protokolle für die gleichzeitige Sequenzierung von DNA und RNA aus derselben Probe.Glücklicherweise gibt es mittlerweile drei veröffentlichte Ansätze, die dieses Problem lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl genomische als auch transkriptomische Informationen aus derselben Gruppe von Zellen zu vernachlässigbaren zusätzlichen Kosten gewonnen werden können. Gel-seq wurde ursprünglich mit aufrechten Kassetten entwickelt, dieses Protokoll kann jedoch an jede Standard-Gelelektrophoresekassette angepasst werden.Bereiten Sie den Füllstoff, die Vorläufermischungen mit hoher Dichte und die Vorläufermischungen mit niedriger Dichte in drei Röhrchen vor. Fügen Sie die Reagenzien in der beschriebenen Reihenfolge hinzu und wirbeln Sie die Mischung ein. Füg

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

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Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

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