Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

Da regulatorische Elemente wie transkriptionelle Enhancer in großen genomischen Abständen von ihren Zielgenen lokalisiert werden können, die sie durch chromosomale Interaktionen über große Entfernungen regulieren, besteht das Ziel von Promoter Capture Hi-C darin, genregulatorische Elemente mit ihren Zielgenen zu verknüpfen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Genomstruktur und -funktion zu beantworten, z. B. wie die dreidimensionale Architektur eines Genoms die Kontrolle der Genexpression beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Nachweis signifikanter Promotorinteraktionen ermöglicht, eine einzige Einschränkung von der Lösung.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie, da sie nicht-kodierende krankheitsassoziative Sequenzvarianten in oder in der Nähe von regulatorischen Kontrollsequenzen mit ihren Zielgenen verknüpfen kann. Beginnen Sie mit mindestens 20 Millionen Zellen pro Experiment. Für Suspensionszellen sammeln und zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g und 20 Grad Celsius für drei Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 30,625 Millilitern Medium mit 10 % FBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann 4,375 Milliliter 16 % methanolfreies Paraformaldehyd zu einer Endkonzentration von 2 % hinzuFixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur durch sanftes Mischen auf einer Wippe. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 Millilitern frisch zubereitetem eiskaltem Glycin mit einem molaren Glycin gestillt.

Fünf Minuten lang unter leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur mixen. Dann 15 Minuten auf Eis inkubieren und gelegentlich umdrehen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Suspensionszellen bei 760 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 50 Millilitern eiskaltem PBS pH 7,4. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten und entfernen vorsichtig den Überstand. Nach der Zelllyse, wie im Textprotokoll beschrieben, waschen Sie die Zellkerne mit dem 1,25-fachen Restriktionspuffer 2.

Dazu wird das Pellet in einem Milliliter eiskaltem Puffer resuspendiert und die resuspendierten Kerne in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Drehen Sie die Kerne fünf Minuten lang bei 760 g und vier Grad Celsius, bevor Sie den Überstand entfernen. Das Pellet wird in 1790 Mikrolitern 1,25-fachem Restriktionspuffer 2 resuspendiert.

Teilen Sie dann die Suspension in fünf Aliquote auf, die jeweils fünf bis 10 Millionen Zellkerne in 358 Mikrolitern enthalten. Fügen Sie 11 Mikroliter mit 10 % Gewicht pro Volumen, SDS pro Aliquot hinzu und schütteln Sie bei 950 Umdrehungen pro Minute 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermomixer. Wenn Zellklumpen auftreten, dissoziieren Sie sie durch Pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden.

Als nächstes fügen Sie 75 Mikroliter 10% Triton X-100 pro Aliquot hinzu und schütteln Sie es bei 950 U/min und 37 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Thermomixer. Fügen Sie 12 Mikroliter à 100 Einheiten pro Mikroliter HindIII pro Aliquote hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie bei 950 U/min in einem Thermomixer.

Nach dem Aufschluss führen Sie eine quantitative PCR durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter Biotinylierungs-Mastermix pro Aliquot hinzu und mischen Sie. Inkubieren Sie die Aliquoten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie alle 30 Sekunden fünf Sekunden lang bei 700 U/min.

Nach einer Stunde die Aliquots auf Eis legen. Führen Sie die Hi-C-Bibliothek wie im Textprotokoll beschrieben aus. Übertragen Sie zwischen 500 Nanogramm und einem Mikrogramm der Hi-C-Bibliothek in ein neues Röhrchen und verdampfen Sie die Probe dann auf einem Vakuumkonzentrator, bis sie trocken ist.

Resuspendieren Sie die verdampfte Hi-C-Bibliothek, indem Sie 3,6 Mikroliter Wasser in molekularbiologischer Qualität, 2,5 Mikroliter Blocker 1, 2,5 Mikroliter Blocker 2 und 0,6 Mikroliter benutzerdefinierten Blocker hinzufügen. Übertragen Sie die Probe in eine Vertiefung eines neuen PCR-Röhrchenstreifens, verschließen Sie ihn mit dem PCR-Kappenstreifen und legen Sie die Probe auf Eis. Markieren Sie die Vertiefung als D für Hi-C-DNA.

Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie den Puffer fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius in einem Thermomischer. Den Puffer in eine Vertiefung eines neuen PCR-Röhrchenstreifens geben, mit dem PCR-Kappenstreifen verschließen und bei Raumtemperatur aufbewahren.

Markieren Sie die Vertiefung als H für Hybridisierungspuffer. Mischen Sie in eine Vertiefung eines neuen PCR-Röhrchenstreifens fünf Mikroliter biotinylierte RNA-Sonden mit 100 Nanogramm pro Mikroliter, 0,5 Mikroliter SRNase B, RNase-Inhibitor und 1,5 Mikroliter Wasser in molekularbiologischer Qualität. Verschließen Sie den PCR-Röhrchenstreifen mit einem PCR-Kappenstreifen und legen Sie ihn auf Eis.

Beschriften Sie das Röhrchen mit R für RNA. Richten Sie das PCR-Gerät wie im Textprotokoll beschrieben ein. Gehen Sie bei allen Eingriffen bei laufendem PCR-Gerät so schnell wie möglich vor, um eine Verdunstung der Probe zu vermeiden.

Legen Sie den D-PCR-Röhrchenstreifen in das PCR-Gerät, schließen Sie den Deckel des PCR-Geräts und starten Sie die PCR-Reaktion. Wenn das PCR-Programm 65 Grad Celsius erreicht, öffnen Sie den Deckel des PCR-Geräts und legen Sie den H-PCR-Röhrchenstreifen in das PCR-Gerät. Schließen Sie den Deckel der PCR-Maschine und inkubieren Sie sie drei Minuten lang.

Öffnen Sie dann den Deckel des PCR-Geräts, legen Sie den R-PCR-Röhrchenstreifen in das PCR-Gerät und schließen Sie das PCR-Gerät. Öffnen Sie nach zwei Minuten den Deckel des PCR-Geräts und alle PCR-Röhrchenstreifen. Übertragen Sie 13 Mikroliter Vertiefung H in Vertiefung R und dann das gesamte Volumen von Vertiefung D in Vertiefung R. Pipettieren Sie dreimal auf und ab, um die Reaktion zu mischen und den PCR-Röhrchenstreifen zu verschließen.

Entfernen Sie die H- und D-PCR-Röhrchenstreifen und schließen Sie den Deckel des PCR-Geräts. Inkubieren Sie die Reaktion 24 Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Geben Sie 60 Mikroliter Streptavidin-gekoppelte magnetische Kügelchen in ein neues Röhrchen.

Legen Sie das Röhrchen eine Minute lang auf den magnetischen Trennständer, bevor Sie den Überstand entfernen. Suspendieren Sie die Kügelchen erneut mit 200 Mikrolitern 1x Bindungspuffer und drehen Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur und 15 U/min auf einem rotierenden Rad. Drehen Sie das Röhrchen zwei bis drei Sekunden lang sanft in einer Tischzentrifuge, um die Probe zu entnehmen.

Nachdem Sie das Rohr drei Minuten lang auf den magnetischen Trennständer gelegt haben, entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal. Als nächstes resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern 1x Bindungspuffer.

Öffnen Sie das PCR-Gerät und den PCR-Röhrchenstreifen, während das PCR-Programm noch läuft, und übertragen Sie die Hybridisierungsreaktion in das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen. Inkubieren Sie die Reaktion und die Kügelchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad bei drei Umdrehungen pro Minute. Befreien Sie sich von den Kügelchen auf dem magnetischen Trennständer und entfernen Sie den klaren Überstand.

Nachdem die Kügelchen in 500 Mikrolitern Waschpuffer 1 erneut suspendiert wurden, inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 950 U/min in einem Thermomixer. Hole die Perlen wieder zurück und entferne den klaren Überstand. Nun die Kügelchen wieder in 500 Mikroliter Waschpuffer 2 suspendieren und mischen.

Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 950 U/min in einem Thermomixer. Wiederholen Sie diese Wäsche mit Waschpuffer 2 noch zweimal. Legen Sie dann die Probe auf den magnetischen Trennständer, entfernen Sie den klaren Überstand und suspendieren Sie die Kügelchen wieder in 200 Mikrolitern 1x Restriktionspuffer 2.

Nachdem Sie die Kügelchen zurückgewonnen und den Überstand wieder entfernt haben, resuspendieren Sie die Kügelchen in 30 Mikroliter 1x Restriktionspuffer 2. Diese Abbildung zeigt das Hi-C-Interaktionsprofil des Promotor-Captures für den IL8-Promotor in 17 humanen hämatopoetischen Zelltypen. Promotorinteraktionen von lymphoiden Zelltypen sind als violette Bögen und Promotorunterbrechungen von myeloischen Zelltypen als blaue Bögen dargestellt.

Monozytenspezifische Wechselwirkungen sind durch grüne Pfeile gekennzeichnet, neutrophile spezifische Wechselwirkungen sind durch rote Pfeile gekennzeichnet und eine megakaryozytenspezifische Wechselwirkung ist durch einen braunen Pfeil gekennzeichnet. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, so genau wie möglich zu arbeiten. Es ist keine schwarze Magie, aber es ist ein langwieriges Protokoll, so dass sich kleine Fehler summieren und sich am Ende negativ auf die Datenqualität auswirken.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die CRISPR/Cas9-Genomore-Epigenom-Editierung durchgeführt werden, um die biologische Funktion von Promotor-interagierenden Regionen, die durch Promotor-Capture Hi-C aufgedeckt wurden, zu untersuchen. Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Promotor Capture Hi-C in Ihrem Labor implementieren können.