Name: Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Biofilmbildung bei enterischen Krankheitserregern unter Gallensalzbedingungen. Diese kombinierten Assays ermöglichen die detaillierte Charakterisierung von Adhäsion, Matrixbildung und Dispersion für bakteriologische Pathogenesestudien.

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Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Gallensalze Medium: um tryptic Soy Bouillon (TSB) mit 0,4 % Gallensalze (Gewicht/Volumen) vorzubereiten, Aufschwemmen 200 mg der Gallensalze in 50 mL autoklaviert TSB. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Wöchentlich machen Sie frisches Medium. Anmerkungen: Die Salze der Gallensäure routinemäßig verwendet, ist eine 1:1 Mischung aus Natrium Cholate und Natrium-Deoxycholate von Schafen und Rindern Gallenblase isoliert. Wie zuvor4gezeigt hat, war die Anwesenheit von Glukose für Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Vergleich zu Luria-Bertani (LB) Brühe hinzugefügt; und daher war ausreichend induzieren Biofilmbildung in Shigella und die anderen enterischen Krankheitserregern analysiert. Abhängig von den Bakterien analysiert werden könnten verschiedene Glukosekonzentration oder verschiedene Zucker Anforderungen erforderlich sein.</li>
	<li>0,5 % w/V Kristallviolett im Wasser: 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) konjugiert zu Fluorescein erfolgt (FITC): rekonstruieren die Aktie mit 1 X PBS-Puffer. Die 10 mg konzentriert-Aktie mit 400 μl 1 X PBS, eine Endkonzentration von 25 µg/mL zu verdünnen und vor Licht schützen.</li>
	<li>PBS + Glukose: 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (2 % w/V Glukose final) auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.</li>
	<li>PBS + Gallensalze: Auflösen 40 mg in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze final). Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.</li>
	<li>PBS + Glukose und Gallensalze: 40 mg Gallensalze und 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze und 2 % w/V Glukose final) aufzulösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.</li>
	<li>LB-Agar-Platten vorbereiten.</li>
	<li>Formaldehyd/Glutaraldehyd Fix: Hinzufügen 810 µL Formaldehyd (37 %-Stammlösung, 3 % Endkonzentration) und 125 µL Glutaraldehyd (25 % Stammlösung, 0,25 % Endkonzentration) 14 mL 1 X PBS. Gründlich mischen und Lagerung bei 4 ° C. Das Update sollte für den bestimmungsgemäßen Gebrauch kalt sein. Achtung: Das Update ist giftig und Sondermüll Beseitigung erfordert.</li>
	<li>Antifade Eindeckmedium Lösung: Verwenden Sie antifade Eindeckmedium Lösung mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck, um Immunofluoreszenz immunofluorescent Mikroskopie Proben zu hemmen, während eindringmittel Färbung der DNS des Bakteriums.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Bakterien
<ol><li>Wachsen Sie über Nacht Kulturen der Bakterienstämme impfen 3 mL TSB mit einer einzigen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kultur Rohr getestet werden. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 225 u/min für die Inkubation über Nacht (16-24 h). Hinweis: Stämme sollten aus Gefrierschrank Beständen alle 2 bis 4 Wochen und gepflegt auf Platten nicht mehr als 2 Wochen alt restreaked werden.</li>
</ol>3. Einhaltung der Festphasen-Assay
Hinweis: Dieser Assay quantifiziert anhaftende Bakterien mit einer 96-Well-Platte-Methode. Bakterien werden statisch in flachen Bodenplatten angebaut. Waschen wird durchgeführt, um nicht-anhaftende Bakterien entfernen und anhaftende Bakterien sind mit Kristallviolett gefärbt. KRISTALLVIOLETT Fleck Peptidoglycan in der bakteriellen Zellwand bindet und mit Ethanol solubilisiert werden kann. Die Zahl der anhaftenden Bakterien wird anhand von Kristallviolett Aufbewahrung bestimmt.
<ol><li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + Gallensalze (BS).</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
	<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).</li>
	<li>Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp (TSB und TSB + BS) getestet werden.</li>
	<li>Fügen Sie 130 µL/Well des beimpften Kultur in drei Vertiefungen und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.</li>
	<li>Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Vakuum durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen des Mediums am unteren Rand des Brunnens. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bakterienpopulation befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Wenn während der Inkubationszeit EPS Matrix produziert wurde, wird die Matrix als einen weißen Niederschlag visualisiert werden. Stören Sie die EPS-Matrix nicht.</li>
	<li>Vorsichtig waschen der Brunnen einmal mit 200 µL steriler PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.</li>
	<li>Invertieren Sie die Platte zum Trocknen. Lassen Sie ein Minimum von 20 min trocknen. Hinweis: Da der Biofilm vor Verschmutzung gründlich getrocknet werden muss, kann das Protokoll angehalten bei diesem Schritt für ein paar Stunden oder sogar über Nacht sein. Die zusätzliche Trocknungszeit wird das Färbeverfahren nicht verändern, während unvollständige Trocknung Quantifizierung der Ergebnisse und der Reproduzierbarkeit auswirkt.</li>
	<li>Gut 150 µL 0,5 % Kristallviolett bis jeweils experimentell und Steuerung hinzufügen.</li>
	<li>5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.</li>
	<li>Der Brunnen einmal mit 400 µL destilliertes Wasser zu waschen. Das zusätzliche Volumen hilft, um passives Kristallviolett Fleck von den Seiten der Brunnen zu entfernen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung.</li>
	<li>Die Brunnen fünfmal mit 200 µL destilliertes Wasser zu waschen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung. Hinweis: Gründliches Waschen ist wichtig für die Quantifizierung. Wenn die leere Brunnen aus destilliertem Wasser sind und keine verbleibenden Kristallviolett Fleck enthalten, fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Invertieren Sie die Platte trocken, vor Licht geschützt werden. Stellen Sie sicher, vollständige Trocknung der Platte wie oben erwähnt.</li>
	<li>Destain Brunnen mit 200 µL von 95 % Ethanol. Inkubieren Sie die Platte auf den Shaker für 30 min. Zur Vermeidung von Verdampfung, besonders bei höheren Temperaturen führen Sie diesen Schritt bei 4 ° C.</li>
	<li>Mit einem Teller Reader, Aufzeichnen der OD-540. Hinweis: Die Wellenlänge für maximale Absorption von Kristallviolett ist in der Nähe von 590 nm. Die Literatur berichtet eine Reihe von OD540 - OD5954,13,14,15,16 für Kristallviolett Absorption; So wählen Sie eine Wellenlänge zur Verfügung basierend auf der Platte-Leser.</li>
</ol>4. EPS-Matrix-Erkennung
Hinweis: Diese kostenlose Proben zu quantifizieren und visualisieren die EPS. In beiden Fällen EPS-Erkennung erfolgt anhand einer Lektin Polysaccharide zu binden. Das eindringmittel konjugiert Protein ermöglicht die Quantifizierung (Schritt 4.1) oder Visualisierung (Schritt 4.2).
<ol><li>Semi-quantitativen Nachweis von EPS<ol>
<li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
		<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (eine 01:50 Verdünnung).</li>
		<li>Fügen Sie in eine sterile, schwarz, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden. Die Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.</li>
		<li>Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.</li>
		<li>Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine klare 96-Well-Platte mit einer Pipette, idealerweise ein Mehrkanal-Pipette. Seien Sie vorsichtig, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung und/oder der EPS befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Beiseite stellen.</li>
		<li>Die schwarze Platte für 15 min bei RT mit 200 µL/Well von Formaldehyd/Glutaraldehyd in 1 X PBS zu beheben.</li>
		<li>Während die anhaftende Bevölkerung Befestigung ist, bewerten Sie die überstehende Fraktion aus Schritt 4.1.6. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment.<ol>
<li>Alternativ kann der gesamte Test in eine schwarze klar Bodenplatte erfolgen. Unter diesen Umständen die OD600 Werte aufgezeichnet werden können und das Kulturmedium können anschließend vor 4.1.7 Schritt verworfen werden. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normieren im Fall gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie das Update und in den Sondermüll zu entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die PBS waschen mit der Vakuumleitung durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen der Wäsche am unteren Rand des Brunnens.</li>
		<li>150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 150 µL PBS in jede Vertiefung. Aufzeichnen die Fluoreszenz bei 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokale Mikroskopie Visualisierung von EPS-Produktion und Berechnung der Biofilm Dicke<ol>
<li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
		<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).</li>
		<li>Richten Sie eine sterile 24-Well-Platte mit 12 mm Runde Glasdeckgläser steril. Drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen fügen Sie 400 µL/Well nicht inokulierten Kontrolle Medien hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.</li>
		<li>Brunnen in zweifacher Ausfertigung 400 µL der beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen überzogen sind.</li>
		<li>Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.</li>
		<li>Bestätigen Sie visuell Wachstum in der TSB Zustand, Wachstum und EPS Niederschlag in der TSB (weiß) + BS Zustand und kein Wachstum und/oder weißen Niederschlag in sterilen Kontroll-Vertiefungen. Entfernen Sie die Überstände.</li>
		<li>Fix für 15 min bei RT mit 200 µL/Well Formaldehyd/Glutaraldehyd Lösung mit 1 X PBS-Puffer.</li>
		<li>Entfernen Sie das Update und Sondermüll zu entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.</li>
		<li>150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL/Well von PBS.</li>
		<li>Mit antifade Eindeckmedium Lösung mit DAPI montieren. Hinweis: Die Lösung ist eine fertige, Glycerin-basierte Montage-Lösung mit DAPI für Erhaltung der fluoreszierenden Labels während gleichzeitig Färbung der DNS in bakterielle Zellen für die Visualisierung als eine gegenfärbung. Folgen Sie des Kits Wegbeschreibungen und Empfehlungen für Inkubationszeiten vor imaging Proben. Das DAPI Färbeverfahren kann durchgeführt werden, vor der Anwendung antifade Eindeckmedium Lösung, die keine DAPI enthält.</li>
		<li>Bewerten von konfokalen Mikroskopie. Auf einem confocal Mikroskop legen des Lasers auf 495 nm/519 nm Anregung/Emission für FITC Visualisierung. Legen Sie einen zweiten Laser auf 360 nm/460 nm Anregung/Emission DAPI zu visualisieren. Suchen Sie den Biofilm durch die Konzentration auf das DAPI-Kanal. Das DAPI und FITC Kanäle verwenden, um die volle Dicke bestimmen und legen Sie die obere und untere Grenzen imaging. Volle Dicke Z-Stapel Bilder aufnehmen von Aufnahmen jeder 0,25 µm nach dem Festlegen der Umfänge auf der Ober- und Unterseite des Stapels Z. Finden Sie für weitere Informationen über konfokalen Mikroskopie in Publikationen von Paddock Et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Die 3D-Bilder in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) zu visualisieren die volle Biofilmbildung und berechnen Sie die Dicke der Biofilm zu rekonstruieren. Die durchschnittliche Dicke erhielt für S. Flexneri Galle-Salz induzierte Biofilme war 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Dispersion Assay
Hinweis: In diesem Test wird die Demontage der Biofilm durch bakterielle Streuung erkannt. Hier Reife Biofilme werden festgelegt und anschließend (in der Regel am nächsten Tag), die Medien werden durch PBS ersetzt oder ergänzt PBS. Überstand Komponente wird dann bewertet, um die Anzahl der Bakterien quantitate, die von den Biofilm getrennt haben.
<ol><li>Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.</li>
	<li>Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).</li>
	<li>Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.</li>
	<li>Drei Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.</li>
	<li>Statisch inkubieren Sie Platte-für 4-24 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Bevor Sie fortfahren, zu wärmen, PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose auf 37 ° c Diese Reagenzien täglich frisch zubereiten.</li>
	<li>Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Medium ohne Anzeichen von Trübung klar. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Vakuumleitung. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung befindet sich auf der Kunststoffoberfläche.</li>
	<li>Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Wäsche mit 130 µL/Well des folgenden in drei Brunnen: PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose. Diese Reagenzien müssen auf 37 ° c vorgewärmt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Inkubator 37 ° C. Übertragen Sie die Überstände auf eine frische, sterile 96-Well-Platte.</li>
	<li>Mit einer 96-Well Platte oder Verdünnung Block 10-fach vorbereiten (01:10) serielle Verdünnungen des Überstands in sterilen PBS. Hinweis: Die Verdünnungsreihe sollte von unverdünnt bis 10-6 je nach Bakterienstamm zu prüfenden Bereich. Pilotprojekten können durchgeführt werden, um den optimalen Verdünnung zu ermitteln.</li>
	<li>Platte 5 µL jeder Verdünnung auf LB-Agar mit einer Mehrkanal-Pipette zu erkennen. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Zählen Sie Kolonien auf den nächsten Tag und Konto für den Verdünnungsfaktor, bei der Festlegung der Wiederherstellung koloniebildenden Einheiten (KBE). Um die prozentuale Dispersion im Vergleich zu den 1 x PBS Steuerelementsatz (100 %) zu berechnen, teilen Sie die Wiederaufnahme KBE aus jeder Behandlung Zustand durch die Erholung KBE von 1 X PBS Kontrollprobe. Hinweis: Routine Medien Platten für die bakterielle Belastung von Interesse können auch verwendet werden. Beispielsweise können Shigella auf Kongo-rot Platten beschichtet werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten trocken für geeignete Stelle-Plating-Techniken sind.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Experimente...

Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem eine Kaskade von Ereignissen in Bildung eines ausgereiften anhaftende Bakteriengemeinschaft1,2,3gipfelt. Bakterien produzieren Adhesins um die frühe Bindung während der Verschiebung adhäsin gen expressionsprofile zur Stärkung der Anlage während der Reifung der Biofilm zu erleichtern. Gleichzeitig tritt die EPS-Produktion zu beschichten der Bakteriengemeinschaft in einer Matrix, die Zellen vor den ersten Stressor zu schützen. Der Biofilm enthaltene Bakterien sind langsam wachsend; und als solche die meisten Antibiotika unwirksam macht. Darüber hinaus spart das langsame Wachstum Energie, bis Bedingungen ändern, um bakterielles Wachstum1,2,3bevorzugen. Nach die harten Bedingungen bestanden haben, Bakterien den Biofilm zu zerstreuen und wieder planktonischen Lebensweise1,2,3. Traditionell, Biofilmen auf Oberflächen eingehalten werden und eine anhaltende klinische Herausforderung wegen Infektion Stauseen auf Katheter und in Wohnung Geräte1,2,3vorhanden.
Biofilmbildung wurde kürzlich für mehrere magensaftresistenten Krankheitserreger beschrieben; Bakterien, die den Dünndarm oder Dickdarm4infizieren. Shigella -Arten, tritt Infektion im menschlichen Dickdarm nach einer Durchreise durch die Mehrheit des Magen-Darm-Trakt. Während der Passage durch den Dünndarm ist Shigella Galle ausgesetzt; ein Lipid-abbauenden Waschmittel abgesondert in den Darm zur Verdauung von Lipiden während gleichzeitig töten die meisten Bakterien5zu erleichtern. Enterische Krankheitserregern haben die einzigartige Fähigkeit, die bakterizide Wirkung der Galle6widerstehen. Unsere jüngsten Analyse verwendet in-Vivo-wie Kombinationen aus Glukose und Gallensalze, robuste Biofilmbildung in S. Flexneri demonstrieren sowie anderen Arten von Shigellen, pathogene Escherichia coliund Salmonellen4. Zuvor, Salmonella Enterica Serovar Typhi gezeigt werden konnte, bilden einen Galle-induzierte Biofilm durch einzigartige Besiedlung der Gallenblase während der chronischen Infektion7,8,9, 10. Darüber hinaus vorherige Forschung mit Vibrio11und Campylobacter12 gezeigt Biofilmbildung auf Galle. Daher die Analysen erweitert die Galle-induzierte Biofilm Formation Beobachtungen auf andere Krankheitserreger und helfen, um Demonstration der konservierten magensaftresistenten Erreger Antwort auf Galle zu etablieren. Im Gegensatz zu chronischen Biofilme in der bakteriellen Gentranskription ist begrenzt und Zelle Seneszenz kann auftreten,1,2,3schlagen wir vor, dass der Magensaftresistente Galle-induzierte Biofilm in der Natur mehr vergänglich ist. Diese vorübergehende virulenten Biofilm ist geprägt durch eine schnelle Demontage (gesehen in der Dispersion-Assay) und verbesserte Virulenz Genexpression beobachtet in den Biofilm Bevölkerung4,6. 
Wie Biofilmbildung eine facettenreiche, dynamischer Prozess und die Verwendung von Gallensalzen wie ein auslösende Faktor für die meisten enterischen Krankheitserregern nur vor kurzem beschrieben ist, sind die Werkzeuge und Techniken, die einzigartige und kreative Anwendungen der traditionellen Methoden. So sind die hier vorgestellten drei kostenlose Strategien, mehrere wichtige Eigenschaften der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erwachsenden bakterielle, Produktion von EPS-Matrix und Dispersion von lebensfähigen Bakterien von den Biofilm zu quantifizieren. Diese Techniken wurden in erster Linie für die Forschung mit Shigellagenutzt; und Bewertung der anderen enterischen Krankheitserregern erfordern daher, Optimierung. Dennoch positive Daten aus allen drei Tests unterstützen Identifikation von Biofilmen und reproduzierbare Protokolle für die Galle Salz-induzierte Biofilmbildung einführen.

<table><tbody><tr><td>Tryptische Sojabrühe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gallensalze</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Kulturröhrchen, 17 x 100 mm, Kunststoff, steril</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hartes Antifading mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit flachem Boden (klar)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit flachem Boden (schwarz)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit flachem Boden (klar)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser 12mm, rund</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Plattenleser</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierender Plattenleser</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal oder fluoreszierend Mikroskop</td><td>Nikon A1 konfokales Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37°; C Schüttel-Brutkasten</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C-Platten-Inkubator</td><td>Thermolyne Serie 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

galle-salz-induzierte biofilmbildung im enterischen krankheitserregern: techniken für die identifizierung und quantifizierung

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.

In Abbildung 1wird in den meisten der sechs magensaftresistenten Krankheitserreger getestet nach dem Wachstum in Medien, die Salze der Gallensäure Biofilmbildung induziert. Eine deutliche Zunahme der anhaftenden Bakterien nach Gallensalze Exposition in fast allen Stämmen beobachtet wird getestet. Die Ausnahme ist Enteroaggregative E. Coli (EAEC); beachten Sie jedoch die induzierte Beobachtung der Δaaf mutierten4</...

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Biofilmbildungs- und Bewertungsprotokolls besteht darin, die Fähigkeit enterischer bakterieller Krankheitserreger zur Bildung eines Biofilms zu bestimmen, insbesondere unter Bedingungen, die den gastrointestinalen Transit und die Exposition gegenüber Gallensalzen nachahmen. Die Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, wie z.B. die Fähigkeit enterischer Krankheitserreger, die rauen Gallensalzbedingungen des Magen-Darm-Trakts zu überleben. Der Hauptvorteil der Techniken besteht darin, dass die kombinierten Ergebnisse der drei Assays eine detaillierte Charakterisierung der Biofilmbildung als Reaktion auf die Exposition gegenüber Gallensalz für jeden Krankheitserreger unterstützen.Wir hatten die Idee für die kombinierten Methoden, da es notwendig war, die Gallensalz-induzierte Biofilmbildung in Shigella flexneri vollständig zu quantifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Aspekte des Assays die Reproduzierbarkeit einschränken können. Achten Sie daher bitte auf die kritischen Schritte, um die Reproduzierbarkeit zu gewäh

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der Test beschreibt ein schnelles Mittel zur frühen Bildung von Biofilmen in Bakterien und Pilzen zu messen. Diese Methode verwendet eine Mikrotiterplatte als Substrat für die mikrobielle Bildung von Biofilmen und der Biofilm wird visualisiert Kristallviolett Belastung. Der Test liefert entweder eine qualitative oder quantitative Assay für die frühe Bildung von Biofilmen.

Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere...

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Quelle: Tay, S. B., et al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen.  J. Vis. Exp. (2016)Das Video demonstriert eine Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse in einem pathogenen Bakterium, indem unbehandelte Kontrollen mit Proben verglichen werden, die mit einem Quorum-Abschreckungsenzym behandelt wurden. Das Enzym stört die bakterielle Signalübertragung während der frühen Inkubation und verringert so die Zelladhäsion. Nach dem Waschen und...

Quantifizierung enzyminduzierter Biofilmsuppression bei pathogenen Bakterien

Das Video zeigt einen Festphasen-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Biofilmbildung. In einer Multi-Well-Platte haften Bakterien in mit Gallensalz angereicherten Medien an festen Oberflächen und bilden Biofilme, was durch Kolorimetrie durch Kristallviolettfärbung und Ethanolbehandlung bestätigt wird.

Ein Festphasen-Adhärenz-Assay zur Beurteilung der Biofilmbildung

Dieses Video zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Quantifizierung der Gallensalz-induzierten Biofilmbildung. Nach der Zugabe von Gallensalzen in der Kultur eines pathogenen Darmbakteriums wird die Biofilmproduktion mit Hilfe eines fluoreszierenden Lektins nachgewiesen, das an die Polysaccharide in der extrazellulären polymeren Substanz (EPS)-Matrix des Biofilms bindet.

Ein Assay zur Untersuchung der Gallensalz-induzierten Biofilmbildung durch EPS-Matrix-Detektion

Das Video zeigt einen Biofilm-Dispersionsassay mit einer Multi-Well-Platte. Die Puffer- und Glukosebehandlung zersetzt den Biofilm und setzt Bakterien frei, während Gallensalze Stress induzieren und die Bakterien in der schützenden extrazellulären Polymersubstanz zurückhalten. Eine höhere Dispersion mit Puffer und Glukose bestätigt den erfolgreichen Abbau des Biofilms, geschätzt durch Messung koloniebildender Einheiten.

Nachweis der Biofilmdemontage durch einen Dispersionsassay

Diese Studie präsentiert die Entwicklung reproduzierbarer Methoden zur Untersuchung von Biofilm-Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bacillus subtilis-Vielzelligkeit.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, der statische und dynamische Methoden kombiniert, um die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen in der Milchindustrie zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer biologischer oder chemischer Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen zu testen.

Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.

Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Lernen Sie die Analyse von Biofilmbildung bei enterischen Krankheitserregern unter Gallensalzbedingungen. Diese kombinierten Assays ermöglichen die detaillierte Charakterisierung von Adhäsion, Matrixbildung und Dispersion für bakteriologische Pathogenesestudien.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

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