Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Das übergeordnete Ziel dieses Biofilmbildungs- und Bewertungsprotokolls besteht darin, die Fähigkeit enterischer bakterieller Krankheitserreger zur Bildung eines Biofilms zu bestimmen, insbesondere unter Bedingungen, die den gastrointestinalen Transit und die Exposition gegenüber Gallensalzen nachahmen. Die Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, wie z.B. die Fähigkeit enterischer Krankheitserreger, die rauen Gallensalzbedingungen des Magen-Darm-Trakts zu überleben. Der Hauptvorteil der Techniken besteht darin, dass die kombinierten Ergebnisse der drei Assays eine detaillierte Charakterisierung der Biofilmbildung als Reaktion auf die Exposition gegenüber Gallensalz für jeden Krankheitserreger unterstützen.

Wir hatten die Idee für die kombinierten Methoden, da es notwendig war, die Gallensalz-induzierte Biofilmbildung in Shigella flexneri vollständig zu quantifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Aspekte des Assays die Reproduzierbarkeit einschränken können. Achten Sie daher bitte auf die kritischen Schritte, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Die Verfahren werden von Mitgliedern meines Labors, Kourtney Nicherson, Postdoktorandin, und Alejandro Llanos, Stipendiat für klinische Forschung, demonstriert. Beschriften Sie zunächst zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen als TSB und TSB plus BS. Geben Sie dann einen Milliliter TSB oder TSB plus BS in die jeweiligen Röhrchen. Beimpfen Sie anschließend die Röhrchen mit 20 Mikrolitern Übernachtkultur in einer Verdünnung von eins bis 50.

Geben Sie dann 130 Mikroliter ungeimpftes Kontrollmedium in jede der drei Vertiefungen in einer sterilen, durchsichtigen, mit Gewebekulturen behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden. Dies ist das leere Steuerelement. Geben Sie 130 Mikroliter inokulierte Kultur in jede der drei Vertiefungen.

Nachdem Sie die Kontrolle und die inokulierte Kultur in die jeweiligen Vertiefungen gegeben haben, inkubieren Sie die 96-Well-Platte vier bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius statisch. Sobald die Inkubation beendet ist, stellen Sie die Kontrollwelle auf dem Plattenleser auf den Blanko. Aspirieren Sie anschließend das Kulturmedium aus jeder Vertiefung.

Waschen Sie die Vertiefungen dann einmal vorsichtig mit 200 Mikrolitern sterilem PBS. Saugen Sie nach dem Waschen das PBS an und drehen Sie die Platte dann um, um sie etwa 20 Minuten lang zu trocknen. Es ist sehr wichtig, auf eine schonende Entfernung des Mediums und eine schonende Reinigung zu achten, um sicherzustellen, dass die EPS-Matrix nicht gestört wird.

Geben Sie anschließend 150 Mikroliter 0,5 % Kristallviolett in jede der Versuchs- und Kontrollvertiefungen. Dann die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen nach fünf Minuten einmal mit 400 Mikrolitern destilliertem Wasser.

Fügen Sie 200 Mikroliter destilliertes Wasser hinzu, um die Brunnen fünfmal zu waschen. Nach all den fünf Wäschen drehen Sie die Platte um und lassen Sie sie vollständig vor Licht geschützt trocknen. Um konsistente Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, dass die Proben vor dem Fortfahren gründlich getrocknet werden.

Nachdem die Platte vollständig getrocknet ist, verwenden Sie 200 Mikroliter 95%iges Ethanol, um die Vertiefungen zu entfärben. Lassen Sie die Platte dann 30 Minuten bei vier Grad Celsius auf dem Shaker, um eine Verdunstung zu vermeiden. Zeichnen Sie nach 30 Minuten den OD 540 auf dem Plattenleser auf.

Für den semiquantitativen Nachweis von EPS verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um das Kulturmedium auf eine durchsichtige 96-Well-Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann 200 Mikroliter Fixierreagenz, um die schwarze Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren. Erfassen Sie nun den Messwert von OD 600, indem Sie die Steuerung sowie den Rohling für die Standardisierung einstellen.

Zeichnen Sie dann den Messwert des Kulturmediums auf, während sich die adhärente Population fixiert. Sobald die Fixierung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Reagenz und entsorgen Sie es im Sondermüll. Verwenden Sie dann 200 Mikroliter steriles PBS, um die Vertiefungen zweimal vorsichtig zu waschen.

Nach dem Waschen das PBS ansaugen. Fügen Sie als nächstes 150 Mikroliter à 25 Mikrogramm pro Milliliter ConA-FITC hinzu. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Vertiefungen nach der Inkubation vorsichtig mit 200 Mikrolitern PBS. Geben Sie dann 150 Mikroliter PBS in jede Vertiefung und zeichnen Sie die Fluoreszenz bei 488 Nanometern auf. Nach der Zubereitung frischer Reagenzien erwärmen Sie PBS, PBS mit Glukose, PBS mit Gallensalzen und PBS mit Glukose und Gallensalzen auf 27 Grad Celsius.

Zeichnen Sie dann die OD 600-Werte von der Übernacht-Biofilmplatte auf dem Plattenleser auf, indem Sie die Steuerung gut und leer einstellen. Anschließend wird das Nährmedium mit einer Vakuumleitung abgesaugt, ohne die anhaftende Population auf der Kunststoffoberfläche zu stören. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal vorsichtig mit 200 Mikrolitern sterilem PBS.

Nach dem Waschen mit PBS 130 Mikroliter des vorgewärmten PBS, PBS mit Glukose, PBS mit Gallensalzen und PBS mit Gallensalzen und Glukose in jede der drei Vertiefungen geben und die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Platte aus dem Inkubator. Pipettieren Sie den Überstand auf eine frische sterile 96-Well-Platte.

Bereiten Sie schließlich eine bis 10 serielle Verdünnungen des Überstands mit PBS in der 96-Well-Platte oder in einem Verdünnungsblock vor. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um fünf Mikroliter jeder Verdünnung auf LB-Agarplatten zu übertragen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Völker. Das Balkendiagramm wird erhalten, um die Gallensalz-abhängige Biofilmbildung in enterischen Krankheitserregern zu quantifizieren. Dies geschieht durch die Darstellung der OD 540-Werte der einzelnen Stämme in An- und Abwesenheit von Gallensalzen im Medium.

Das Diagramm zeigt eine signifikante Zunahme der Biofilmbildung für die meisten Erregerstämme, mit Ausnahme von enteroaggrativen E.Coli. Als nächstes wird das bei der Biofilmbildung produzierte EPS nachgewiesen, indem die Menge an ConA-FITC bestimmt wird, die vom EPS zurückgehalten wird. Das Balkendiagramm zeigt einen signifikant erhöhten Fluoreszenzwert in Gegenwart von Gallensalzen.

Dies bestätigt die EPS-Produktion für den Erreger Shigella flexneri. Hier ist die ConA-FITC-abhängige Färbung der EPS-Matrix signifikant hoch, wenn sie den Gallensalzen ausgesetzt wird. Dies deutet auf die Bildung eines bakteriellen Biofilms hin, der durch die polysaccharidreiche EPS-Matrix gekennzeichnet ist.

One X PBS und DAPI werden verwendet, um die FITC-abhängige Spezifität bzw. das Vorhandensein der bakteriellen DNA zu zeigen. Schließlich wird die Anzahl der koloniebildenden Einheiten gezählt, um die Gallensalz-abhängige Ausbreitung von Bakterien aus dem Biofilm zu analysieren. Die Grafik zeigt, dass sich die Bakterien leicht mit Glukose von den Biofilmen in PBS und PBS verteilen.

Die Exposition der Bakterien gegenüber Gallensalzen hemmt jedoch drastisch die Ausbreitung aus den Biofilmen. Diese Assays wurden entwickelt, um die transienten virulenten Biofilme zu erfassen und zu quantifizieren, die von enterischen Krankheitserregern, insbesondere Shigella flexneri, als Reaktion auf die Exposition gegenüber Gallensalz im Dünndarm vor einer Infektion im Dickdarm gebildet werden. Modifikationen an den Assays, wie z. B. die Arten von Basismedien, die Zusammensetzung der verwendeten Gallensalze und die bakteriellen Wachstumsbedingungen, müssen möglicherweise für verschiedene Krankheitserreger angepasst werden, abhängig von der Infektionsstelle im Magen-Darm-Trakt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie jeden der Assays durchführen, um die Biofilmbildung in Ihrem Bakterien- oder Mutantenstamm gründlich zu bewerten. Denken Sie daran, dass die Arbeit mit den Krankheitserregern und einigen der Lösungen äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie geeignete Handhabungs- und Entsorgungsmethoden sollten bei der Durchführung dieser Untersuchungen stets berücksichtigt werden.

Darüber hinaus sind die Vorbereitung frischer Gallensalzmedien, geeignete Kontrollen und die Sicherstellung der experimentellen Reproduzierbarkeit für die Datenanalyse und die Bestätigung des Gallensalz-induzierten Biofilm-Phänotyps von entscheidender Bedeutung. Die Techniken, die einzigartige und kreative Hochdurchsatzanwendungen traditioneller Methoden darstellen, werden eine angemessene Quantifizierung des facettenreichen und dynamischen Prozesses der Gallensalz-induzierten Biofilmbildung in enterischen Krankheitserregern ermöglichen.