Das MPLEx-Protokoll für Multi-Omic Analysen von Bodenproben

Diese Methode wird in den Bereichen Proteomik, Metabolomik und Lipidomik eingesetzt, indem sie dazu beiträgt, umfassende Informationen über die molekularen Veränderungen zu erhalten, die in bodenassoziierten mikrobiellen Gemeinschaften aufgrund von Umweltstörungen stattfinden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Gewinnung mehrerer Analyten aus einer einzigen Bodenprobe die Präzision und Genauigkeit erhöht und gleichzeitig die Zeit und den Aufwand für die Probenvorbereitung verringert. Wiegen Sie zunächst für jede 20-Gramm-Bodenprobe 10 Gramm in zwei separate 50-Milliliter-Methanol/Chloroform-kompatible Röhrchen.

Verwenden Sie Kunststoffschläuche aus PTFE, da Chloroform die meisten Kunststoffe auslaugt und die Proben verunreinigt. Geben Sie etwa 10 Milliliter chloroformgewaschenen Edelstahl und Granatperlen in jedes Röhrchen. Geben Sie dann auf Eis vier Milliliter kaltes Reinstwasser in jedes Röhrchen und geben Sie die Proben in einen Eiskübel in einen Abzug.

Geben Sie mit einer serologischen 25-Milliliter-Glaspipette schnell 20 Milliliter eiskaltes Chloroform von zwei zu eins Chloroform zu Methanolvolumen/-volumen in die Röhrchen. Ziehen Sie die Deckel fest und wirbeln Sie die Erdmischung in Lösung. Das Chloroform-Methanol hilft dabei, die Zellwand von Prokaryoten aufzubrechen und inaktiviert auch enzymatische Aktivitäten.

Befestigen Sie dann die Röhrchen an 50-Milliliter-Röhrchen-Wirbelaufsätzen und wirbeln Sie, wenn möglich, 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius horizontal in einem Kühlschrank. Legen Sie die Proben dann für etwa 15 Minuten in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius, um sie vollständig abzukühlen. Anschließend wird jede Probe mit einem Sonden-Ultraschallgerät in einem Abzug 30 Sekunden lang auf Eis mit einer sechs Millimeter großen Sonde von 1/4 Zoll bei 60 % Amplitude beschallt.

Legen Sie die Proben nach der Beschallung in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius, da die Beschallung viel Hitze erzeugen kann. Nach der Wiederholung der horizontalen Vortexing-, Ultraschall- und Gefrierschritte zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei der 4.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius. Zu diesem Zeitpunkt wird die Probe in die obere Metabolitenschicht, die Proteinzwischenschicht und die untere Lipidschicht getrennt.

Legen Sie die Proben auf Eis. Verwenden Sie dann in einem Abzug eine serologische 10-Milliliter-Glaspipette, um die oberen Metabolitenschichten aus den beiden 50-Milliliter-Röhrchen in ein großes Glasfläschchen zu übertragen. Kippen Sie nun das 50-Milliliter-Röhrchen leicht, um die Proteinzwischenschicht freizugeben, so dass sie frei auf der unteren Lipidschicht schwebt.

Schöpfen Sie dann mit einem sauberen Flachkopf-Laborspatel aus Edelstahl vorsichtig beide Proteinzwischenschichten ab und geben Sie sie zusammen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie mit einer serologischen 25-Milliliter-Glaspipette die unteren Lipidschichten in ein großes Glasfläschchen. Geben Sie 20 Milliliter eiskaltes Methanol in die beiden Röhrchen mit dem Schmutz und in das eine Röhrchen mit der Proteinzwischenschicht.

Drehen Sie die Röhrchen kurz vor und zentrifugieren Sie die Trümmerpellets und die Proteinzwischenschicht fünf Minuten lang bei der 4.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius. Anschließend wird das Methanol in einen Sondermüllbehälter in einem Abzug umgefüllt. Frieren Sie die Protein- und Schmutzpellets in flüssigem Stickstoff ein und trocknen Sie sie etwa zwei Stunden lang in einem Gefriertrockner.

Geben Sie 20 Milliliter Proteinsolubilisierungspuffer in 50-Millimolar-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 zu jedem der Trümmerpellets und 10 Milliliter in das Proteinzwischenschichtröhrchen. Im Abzug beschallt die Sonde die Proben 30 Sekunden lang mit einer Amplitude von 20 %, um sie in Lösung zu bringen. Wirbeln Sie die Proben zwei Minuten lang.

Legen Sie dann die Proteinzwischenschichtprobe 30 Minuten lang bei 50 Grad Celsius in einen Rotator des Laborröhrchens, um das Protein zu lösen. Wirbeln Sie die Trümmerproben weitere 10 Minuten lang horizontal, um alle verbleibenden intakten Zellen zu lysieren. Drehen Sie dann für die restlichen 20 Minuten mit den Proteinzwischenschichtproben.

Zentrifugieren Sie alle Proben 10 Minuten lang bei 4.500-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur und sammeln Sie den Überstand aus jedem Röhrchen pro Probe in zwei 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 10 Milliliter Solubilisierungspuffer in das Proteinzwischenschicht-Pellet. Dann beschallen Sie das Pellet und wirbeln es zurück in die Lösung.

Nach dem Zentrifugieren werden die Überstände gleichmäßig in die beiden 50-Milliliter-Röhrchen mit den Überständen aus dem Schuttgranulat gemischt und die Röhrchen in einem Schaufelrotor mit festem Winkel bei der 8.000-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugiert, um den verbleibenden Schmutz zu pelletieren. Teilen Sie die Überstände auf zwei 50-Milliliter-Röhrchen auf. Geben Sie dann mit einer serologischen 10-Milliliter-Glaspipette 7,5 Milliliter TCA in jedes Röhrchen.

Die Proben werden in Lösung eingewirbelt. Legen Sie die Proben dann für zwei Stunden bis über Nacht in einen Gefrierschrank mit minus 20 Grad Celsius. Um das gefällte Protein zu pelletieren, zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei der 4.500-fachen Schwerkraft und vier Grad Celsius und dekantieren Sie den Überstand zu einem Abfall.

Geben Sie 10 Milliliter 100% eiskaltes Aceton zu jedem Proteinpellet. Wirbeln Sie die Röhren und verbinden Sie sie wie Pellets in einem Rohr. Zentrifugieren Sie das Aceton und dekantieren Sie es dann.

Waschen Sie das Pellet mit einem kleineren Volumen Aceton zweimal und geben Sie die Suspension für die letzte Drehung in ein 1,5- oder Zwei-Milliliter-Röhrchen. Den Überstand in den Abfall umfüllen und das Pellet auf einem Papiertuch in einem Abzug etwa 20 Minuten lang umgedreht trocknen lassen. Je nach Größe des Pellets fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter des Proteinsolubilisierungspuffers hinzu.

Beschallen und wirbeln Sie das Pellet in Lösung. Beachten Sie, dass die Probe viskos sein kann, da Huminstoffe zusammen mit dem Protein ausfallen, die bei einer anschließenden Zentrifugation entfernt werden. Schütteln Sie schließlich die Probe in einem Inkubator oder Shaker bei 300 U/min und 40 Grad Celsius für 30 Minuten, um das Protein in Lösung zu lösen, bevor Sie mit dem Proteinaufschluss oder dem Schockfrosten für die zukünftige Verarbeitung fortfahren.

Unter Verwendung des MPLEx-Protokolls, das in diesem Video demonstriert wird, wurden 3.376 Peptide, 105 Lipide und 102 polare Metaboliten aus dem Prärieboden der Ureinwohner von Kansas extrahiert, und die Extraktion von Proteinen im Protokoll wird mit Proteinextraktionskits und SDS-Extraktionen unter Verwendung von Umkehrphasen-LC-MS/MS verglichen. Beim ersten Vergleich von drei Replikaten des kommerziellen Proteinextraktionskits und der SDS-Methoden überlappten sich nur 12 % der Peptide zwischen den beiden Techniken, was die Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und die unterschiedlichen Extraktionseffekte zeigt. Beim Vergleich von MPLEx mit einem kommerziellen Proteinextraktionskit und SDS-Extrakten wurden etwa 38% der Peptide, die mit der MPLEx-Methode beobachtet wurden, auch bei der Verwendung der SDS- und/oder kommerziellen Kit-Extraktionen nachgewiesen.

In Anbetracht der Anzahl der Arten in der Bodenbakteriengemeinschaft von Kansas und ihres Metagenoms ist die Überlappung der Peptididentifikationen vernünftig. Wie hier gezeigt, wurde die breite Anwendbarkeit des MPLEx-Ansatzes zuvor anhand des Archaeons S.acidocaldarius, eines unicyanobakteriellen Konsortiums, des Hirnrindengewebes der Maus, des menschlichen Urins und der Blätter von A. thaliana untersucht. In allen Fällen war die Anzahl der Proteine, die mit der MPLEx-Methode beobachtet wurden, ähnlich wie bei den Kontrollen, was auf ihren Nutzen für viele verschiedene Probentypen hinweist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proteine, Metaboliten und Lipide aus einer einzigen Bodenprobe gewinnen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, flexibel zu sein, da alle Bodentypen unterschiedlich sind. Zum Beispiel variiert die Größe der Proteinzwischenschicht, abhängig von der Bodenbiomasse und den im Boden vorhandenen Huminstoffen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug immer getroffen werden sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen.